副豬嗜血桿菌Wza基因表達與結構預測分析

伊立超，婁安鋼

副豬嗜血桿菌Wza基因表達與結構預測分析

伊立超，婁安鋼*

（延邊大學農學院，吉林 延吉 133000）

為了表達副豬嗜血桿菌Wza基因并獲得表達產物的理化性質，試驗參考GenBank中發(fā)表的副豬嗜血桿菌Wza基因序列（KC795491.1）進行重組真核表達質粒（pcDNA3.1-Wza）的構建，并在哺乳動物細胞293細胞鑒定蛋白的表達，同時分析Wza蛋白的理化性質，并預測其二級結構，并用在線軟件預測Wza蛋白質的三級結構，為進一步探究其致病性提供理論基礎。結果表明，成功構建pcDNA3.1-Wza質粒，并表達Wza蛋白。理化性質分析表明，其抗原指數(shù)較高。二級結構主要是β-折疊和無規(guī)卷曲，并且有許多抗原表位區(qū)域。

副豬嗜血桿菌；Wza基因；基因擴增；克隆；理化性質分析

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPs）是一種多態(tài)性，非運動性，革蘭氏陰性微細菌，屬于巴斯德桿菌科的嗜血桿菌屬。在某些情況下，它會侵入人體并引起以纖維性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。它已成為我國豬保育期間最普遍的繼發(fā)性細菌感染和仔豬死亡的主要原因之一，因此，找到關鍵的致病因素拮抗細菌的致病尤為重要。副豬嗜血桿菌的致病因素研究一直是該領域的重點之一。目前，神經(jīng)氨酸酶、菌毛、轉鐵蛋白和脂多糖都被認為是HPs的致病因子[1-2]。研究表明，有毒力的菌株可以抑制豬肺泡巨噬細胞（PAM）的吞噬作用，并且在與PAM相互作用后可以形成更明顯的莢膜；而無毒力的菌株則不能形成莢膜[3-4]。但是，一些研究還發(fā)現(xiàn)，從健康豬的上呼吸道分離出的HPs菌株也有莢膜，但從病變部位中分離出的HPs沒有莢膜產生，這表明HPs莢膜多糖合成基因（CapD）存在于HPs毒力菌株[1]?？傊M管莢膜多糖是巴斯德氏菌細菌的公認毒力因子，并且已經(jīng)進行了涉及莢膜與HPs毒力和致病性之間關系的研究，但已經(jīng)進行了許多臨床試驗。分離株是通過對相關毒力因子進行比較研究得出的結論，因此除莢膜外可能還有其他毒力因子會影響實驗結論。

目前的研究已經(jīng)完成了一些不同菌株HPs的全基因組測序，并鑒定出HPs脂多糖O抗原基因簇，該基因簇的長度約為15 kb。同時，在基因簇中，已經(jīng)鑒定出Wzx，Wzy，Wzc，Wzb和Wza基因。這些基因在O抗原的加工和呈遞中發(fā)揮作用[5]，并且還在莢膜多糖的生物合成中起重要作用。其中，Wza基因在莢膜多糖的轉運中起著重要作用[6]，Wza是完整的外膜蛋白，可為大分子量莢膜多糖的輸出提供通道[7]。Wza蛋白是由340 kDa大分子物質組成的八聚體蛋白，其跨膜區(qū)為α螺旋，其結構與三個新的細胞質區(qū)域相連，被認為是一種新的具有代表性的外膜蛋白[8]。它位于該基因簇的11～12 kb之間，大小約為1 200 bp，G+C含量約為37 %。它屬于外膜跨膜通道蛋白。它嵌合在脂多糖的外部，并與其他蛋白質如Wzc相互作用，把組裝的莢膜多糖分子運輸?shù)郊毦谋砻?。因此，本試驗以副豬嗜血桿菌為研究對象，對Wza基因進行真核載體的構建與表達，并對表達蛋白的結構進行預測分析，旨在為進一步揭示W(wǎng)za蛋白的功能和機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和基因 pcDNA3.1（+）為本實驗室保存。Wza基因序列由南京金斯瑞公司合成。

1.1.2 主要試劑 質粒小提試劑盒，DNA回收純化試劑盒購自天根（TIANGEN）生化科技（北京）有限公司；限制性核酸內切酶購自Thermo Scientific，T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Wza基因引物的設計與合成 根據(jù)NCBI上Wza基因（GenBank登錄號為KC795491.1）序列，N端添加6×-His標簽，由南京金斯瑞公司合成，引物由長春庫美有限公司合成。

1.2.2 Wza基因的PCR擴增與克隆 以合成的PUC57-Wza為模板，利用引物Wza-F：5'-GCATGCATCATCACCATC-3'，Wza-R：5'-CCCTCGAGTTACCAATTCCTCACTCTTA A-3'進行PCR擴增。利用常規(guī)分子克隆方法對Wza目的基因片段進行純化回收，并克隆至pcDNA3.1（+）載體連接，PCR鑒定、雙酶切鑒定，均為陽性的克隆質粒送往吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.2.3 Wza蛋白表達與鑒定 重組質粒pcDNA3.1-Wza脂質體轉染293細胞后48 h收集細胞沉淀并破碎，12 000 rpm 2 min離心，收集上清，Western blot鑒定蛋白表達情況。

1.2.4 Wza蛋白理化性質分析與二級結構預測 應用DNAStar軟件對Wza蛋白理化性質進行分析，并預測其二級結構。

1.2.5 Wza蛋白三級結構預測 應用SWISS-model（https://swissmodel.expasy.org/）在線預測Wza蛋白的三級結構。

2 結果與分析

2.1 Wza基因PCR擴增與克隆

以合成質粒為模板，經(jīng)PCR擴增得到大小為1180bp的Wza目的基因片段（圖1），與預期大小相同?；厥漳康臈l帶并克隆至pcDNA3.1（+）載體，PCR鑒定和雙酶切鑒定兩種方法鑒定重組真核表達質粒（圖2），在1 000 bp ～ 2 000 bp處可見單一條帶，表明pcDNA3.1（+）-Wza質粒構建成功。

2.2 Wza蛋白表達

Western blot方法鑒定目的蛋白的表達，結果表明Wza蛋白成功表達，與預期大小一致（約43 kDa）（見圖2）。

圖1 Wza基因的PCR擴增結果和雙酶切鑒定

M1.DL-2000；1-2.Wza基因的PCR擴增產物；3.水對照；M2. DL-5000；4-5.Nhel和Xhol雙酶切結果；6.pcDNA3.1（+）-Wza

圖2 Wza蛋白表達結果

M.蛋白Marker；1-2.Wza蛋白

2.3 Wza蛋白理化性質分析

DNAStar軟件分析顯示：Wza蛋白分子質量約為43 kDa；其親水指數(shù)>0；抗原指數(shù)>0；表面可能性>1；肽鏈的可塑性好、活動性強，容易與抗體結合。Wza蛋白具有較高的抗原指數(shù)，存在多個潛在抗原表位位點，見圖3。

2.4 Wza蛋白二級結構預測

Wza蛋白的結構中有22個α-螺旋且分布均勻，29個β-折疊，19個β-轉角和17個無規(guī)則卷曲，見圖4。

2.5 Wza蛋白三級結構預測

SWISS-model軟件預測結果見圖5，圖6，Wza蛋白三級結構預測結果與二級結果預測結果相符。

圖3 Wza蛋白抗原表位預測結果

圖4 Wza蛋白二級結構預測結果

圖5 Wza單體三級結構預測結果

圖6 Wza八聚體三級結構預測結果

3 討論與結論

副豬嗜血桿菌是常見的條件致病細菌，通常定植在上呼吸道。它的主要特征是漿膜發(fā)炎反應，包括胸膜炎，心包炎和腹膜炎。它通常會引起腦膜炎和關節(jié)炎和肺炎[9]，稱為格拉瑟氏病（Glasser's disease）。格拉瑟氏病在生產商品豬的國家中更為普遍。目前，該病已成為保育仔豬死亡的主要原因之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。鑒于莢膜多糖在革蘭氏陰性菌中是一個很重要的毒力因子，而HPs危害的嚴重性及其在這方面研究的貧乏，因此很有必要對莢膜多糖相關基因的功能進行研究。副豬嗜血桿菌Wza基因編碼的蛋白與Wzb、Wzc等蛋白相互作用來運輸莢膜多糖分子，Wza蛋白的外膜蛋白通常是開放的，但在其胞質區(qū)域存在可變的環(huán)結構，可以調節(jié)通道的打開和關閉。這種結構為研究極性大分子莢膜多糖通過細胞膜的分子機理提供了理論基礎。

本試驗成功構建并表達了Wza基因，并通過DNAStar軟件分析得出，Wza蛋白存在多個抗原表位，Wza蛋白的二級結構多為β-折疊，三級結構為一個完整的八聚體外膜蛋白[10]，這些研究為副豬嗜血桿菌疫苗或者拮抗劑的進一步探究提供了依據(jù)。

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S852.61+2

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1007-1733（2021）08-0009-04

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