EBV及PD-L1在局部晚期鼻咽癌中的研究進展

羅麗華 張思佳 向東華 易俊林

作者單位：445000 恩施 1恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤科；100021 北京 2中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院放療科；430021 武漢 3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院腫瘤中心

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）發(fā)病率具有明顯的地域特色，高發(fā)區(qū)主要分布在我國南方、東南亞和北非等國家和地區(qū)［1］。NPC發(fā)病隱匿，初診時70%～80%的患者已為局部晚期［2］。在復發(fā)/轉移性NPC患者中，以PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑為靶點的免疫治療取得了良好的臨床獲益。在以單藥免疫檢查點抑制劑作為復發(fā)/轉移性NPC挽救治療的KEYNOTE-028［3］、NCI-9742［4］、POLARIS-02［5］、SHR-1210［6］及CAPTAIN［7］研究中，有效率達20%～30%，顯示出了較好的抗腫瘤效應。在此基礎上，免疫治療聯合化療進一步提高了復發(fā)/轉移性NPC的療效，包括CAPTAIN-1st［8］和 JUPITER-02［9］等多項臨床研究已經證實“免疫治療+”模式能使更多的NPC患者獲益。然而，盡管單藥免疫檢查點抑制劑或聯合化療治療復發(fā)/轉移性NPC取得了一定療效，但仍然只有部分患者從中獲益，因此在臨床實踐中篩選出這部分獲益人群尤為重要，而尋找特異性的生物標志物成為當前研究的重點方向之一。

既往研究已證實NPC發(fā)病與EB病毒（epstein-barr virus，EBV）感染密切相關，90%以上的高發(fā)區(qū)NPC患者血漿EBV DNA呈陽性，尤其是局部晚期NPC患者因腫瘤負荷大，外周血中EBV DNA檢出率和拷貝數往往較高［10］。NPC的病理學特征主要表現為腫瘤病變周圍及瘤內免疫細胞高度浸潤，其中EBV誘導的鼻咽非角化癌與EBV陰性NPC相比PD-L1呈過表達，提示NPC的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）處于免疫抑制狀態(tài)［11］。目前已有研究探索EBV DNA拷貝數及PD-L1表達與腫瘤免疫微環(huán)境的關系及其作為篩選和指導局部晚期NPC治療決策指標的可能性，本文結合國內外相關文獻就此進行綜述。

1 鼻咽癌的腫瘤微環(huán)境

TME主要由腫瘤細胞、周圍的免疫和炎癥細胞、腫瘤相關的成纖維細胞、附近的間質組織、微血管及各種細胞因子和趨化因子構成，是一個復雜的綜合系統(tǒng)［12］。TME可以分成以免疫細胞為主的免疫微環(huán)境和成纖維細胞為主的非免疫微環(huán)境［13］。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞和TME往往是相互作用的，兩者共同介導了腫瘤的免疫耐受，TME中的免疫逃逸機制為惡性腫瘤的侵襲、轉移、治療抵抗及復發(fā)等提供了有利條件［14］。目前所知的腫瘤免疫逃逸機制主要包括腫瘤的直接免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境介導的免疫逃逸。NPC的發(fā)生發(fā)展與其腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關，其中與NPC相關的腫瘤的直接免疫逃逸主要包括腫瘤細胞表面MHC-Ⅰ類分子表達下降或缺失［15-17］、腫瘤細胞缺乏共刺激分子［18］以及Fas/FasL系統(tǒng)介導的免疫逃逸［19］。與NPC相關的TME介導的免疫逃逸則包括腫瘤相關免疫抑制分子和腫瘤相關免疫抑制性細胞［20］。在常規(guī)病理檢查中，腫瘤中免疫細胞浸潤極為常見，癌巢也通常被免疫細胞包繞［21］。GONG等［22］對14例NPC或鼻咽部淋巴結增生（nodular lymphoid hyperplasia，NLH）患者進行單細胞測序分析，發(fā)現T細胞和B細胞是NPC免疫微環(huán)境中最主要的免疫細胞類型，但其中1例分化型NPC患者表現為骨髓和B細胞浸潤異常，提示NPC分化程度可能影響TME免疫細胞浸潤；耗竭型和免疫抑制T細胞表型的富集是NPC微環(huán)境的腫瘤特異性表現。免疫檢查點分子PD-1及其配體PD-L1對腫瘤免疫逃逸和免疫治療至關重要，在NPC中，免疫檢查點分子的上調如PD-L1表達上調是關鍵的免疫逃逸機制［11］。除此之外，NPC還存在其他關鍵的免疫逃逸機制，如EBV通過慢性免疫激活顯著塑造NPC的TME，最終影響腫瘤進展和治療結果。

1.1 EBV與鼻咽癌的腫瘤微環(huán)境

NPC是與EBV感染密切相關的惡性腫瘤，NPC的TME中存在大量浸潤性白細胞，其中中性粒細胞［23］、自然殺傷（natural killer，NK）細胞［24］、單核細胞［25］和樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）［26］代表EBV感染的第一道防線。EBV與其主要包膜糖蛋白gp350結合到中性粒細胞表面并刺激抗病毒細胞因子的產生，包括IL-1α、IL-1β、IL-8和巨噬細胞炎癥蛋白1（macrophage inflammatory protein-1，MIP-1）［27-28］。由 于 EBV 的gp85-gp25-gp42復合物可以直接與NK細胞上的HLA-Ⅱ類分子結合［29］。因此，NK細胞是EBV感染的潛在靶點。EBV的dUTP焦磷酸酶通過MyD88依賴性激活NF-κB誘導巨噬細胞表達并分泌TNF-α、IL-1β和IL-6［30-31］。對于單核細胞，除了由活化的巨噬細胞產生的炎性細胞因子外，EBV還刺激干擾素誘導蛋白-10（IFN-inducible protein-10，IP-10）、MIP-1、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）及IL-8等趨化因子的產生［32-33］。NPC細胞常表達EBV抗原如潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）、潛伏性膜蛋白2（latent membrane protein 2，LMP2）、EB病毒核抗原1（epstein-Barr nuclearantigen1，EBNA1）等，EBV相關的NPC細胞則表達CD4+T細胞、CD8+T細胞的靶蛋白，這些靶蛋白可誘導免疫細胞浸潤到癌組織中，進而參與形成腫瘤免疫微環(huán)境，并在腫瘤早期發(fā)揮免疫監(jiān)視作用［34-35］。TME處于依賴于腫瘤期別的動態(tài)演變過程中，腫瘤細胞突破機體自身免疫監(jiān)視，TME會呈現免疫抑制狀態(tài)。EBV感染的NPC通過激活特定的機制形成和塑造有利于腫瘤自身生長的環(huán)境。LIU等［36］研究發(fā)現EBV感染誘導了人單核細胞來源的巨噬細胞（monocyte-derived macrophages，MDMS）中的IDO表達，從而抑制了T細胞增殖并損害了CD8+T細胞毒活性。該研究結果提示EBV誘導巨噬細胞IDO表達并導致巨噬細胞極化為促腫瘤形態(tài)，從而抑制T細胞的抗腫瘤功能，最終促進免疫抑制微環(huán)境形成。此外，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）與EBV感染的NPC細胞共存也代表了NPC獨特的TME，它參與了腫瘤早期的免疫防御［37］。有研究顯示，EBV編碼的病毒產物可改變宿主細胞信號，從而促進腫瘤的發(fā)展和進展［38］。而隨著EBV病毒基因產物的大量增加，淋巴細胞調控失衡會導致后期的免疫逃逸及腫瘤的發(fā)生發(fā)展［37］。在細胞間，EBV感染的腫瘤細胞通過分泌細胞因子和趨化因子或通過釋放腫瘤外泌體來抑制間質細胞，從而抑制免疫監(jiān)視和促進轉移［39］。EBNA1是EBV編碼的核抗原，在EBV基因組的維持和復制中起關鍵作用［35］。HUO等［40］研究發(fā)現EBNA1作為腫瘤加速劑通過TGFβ1-SMAD3-PI3K-AKT-c-JUN-miR-200a-CXCL12-CXCR4軸增強Treg細胞的趨化遷移而促進NPC的免疫逃逸。ZHAO等［41］對19例EBV DNA陽性NPC患者組織和7例非惡性鼻咽活檢組織中約104 000個細胞進行單細胞測序，同時分析了NPC細胞、EBV DNA、間質和免疫細胞的轉錄組學數據，發(fā)現NPC細胞具有上皮/免疫細胞雙重特征，且與不良預后有關。腫瘤細胞的雙重特征也與CD8+T細胞表面共抑制受體的表達呈正相關［42］。此外，具有雙重特征的腫瘤細胞能抑制T細胞產生IFN-γ，造成腫瘤免疫抑制微環(huán)境［36］。ALIYAH等［43］回顧性（n=27）和前瞻性（n=23）收集了50例NPC組織標本，發(fā)現在EBV相關NPC的TME中，M2型巨噬細胞的存在與Treg細胞相關，且兩種類型細胞都與腫瘤大小和臨床分期緊密聯系?？傊珽BV通過促進EBV感染細胞的生長和防止細胞凋亡來影響TME，還會通過調控眾多細胞信號轉導通路及免疫效應分子來抵消宿主免疫而促進NPC的免疫逃逸。

1.2 PD-L1與鼻咽癌免疫微環(huán)境

NPC的腫瘤免疫微環(huán)境非常復雜。TIL中包括CD4+T、CD8+T和CD57+NK細胞等，這些細胞起到免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤細胞作用［44］。TME中也存在抑制腫瘤免疫反應的成分，如髓源性抑制細胞（myeloidderived suppressor cells，MDSCs）增加，PD-L1過表達，以及與T細胞耗竭和失能相關的各種共刺激因子包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4），淋巴細胞激活基因3（LAG-3），T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域（TIGIT）以及T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域（TIM3）等的表達［45-46］。NPC的TME呈現免疫抑制狀態(tài)，其中免疫檢查點PD-1/PD-L1通路是非常重要的免疫抑制機制。腫瘤細胞表面常表達PD-L1，當其與腫瘤浸潤T淋巴細胞上的PD-1結合時可導致T細胞功能耗竭，從而出現免疫抑制狀態(tài)［47］。免疫檢查點PD-1/PD-L1通路的調控非常復雜，腫瘤細胞膜上PD-L1表達可以是一種適應性免疫現象，也可以是一種內源性的癌基因事件［48］。PD-L1的調節(jié)機制有腫瘤抑癌基因PTEN基因突變或丟失，促癌基因PI3K通路激活，AKT/mTOR、NF-κB和MAPK信號通路下調等，當PD-L1的表達依賴于某些致癌信號通路激活或者不依賴于T細胞浸潤時，通常被認為是一個不良預后因素［42，49］。PD-L1的表達也可以通過T細胞分泌的IFN-γ誘導的JAK2/STAT1信號通路進行調節(jié)，當PD-L1表達由外部信號導致時，其CD8+T細胞浸潤會增加，此時IFN-γ誘導的PD-L1表達可能是一種對抗適應性免疫系統(tǒng)的機制［50］。DENG等［51］分析了212例NPC患者，發(fā)現NPC中腫瘤細胞的PD-L1表達率較高，表達率達61.3%，而且在PD-L1表達患者腫瘤中CD68+巨噬細胞（P=0.001）和CD163+巨噬細胞（P＜0.0001）密度明顯高于PD-L1陰性表達者，CD68+巨噬細胞和CD163+巨噬細胞的密度與PD-L1表達呈正相關且與預后相關，其中PD-L1高表達和CD163+巨噬細胞密度高的患者預后較好。ONO等［52］分析了66例NPC的TME與其預后的關系，同樣發(fā)現腫瘤細胞表達PD-L1和高CD8+TIL密度患者具有較好的預后，腫瘤細胞表達PD-L1和低CD8+TIL密度提示患者預后差。由此可見，PD-L1可能介導了NPC的免疫逃避，但是單個分子PD-1或PD-L1表達可以表現為不同的病理生理意義及不同的預后價值，因此免疫微環(huán)境還需要進行綜合評估。

2 EBV及PD-L1在鼻咽癌中的作用

2.1 EBV基因與PD-1/PD-L1免疫檢查點通路

有研究［34］發(fā)現EBV誘導的LMP1和IFN-γ通路共同調控NPC的PD-L1表達，PD-L1在EBV陽性NPC細胞中的表達高于EBV陰性NPC細胞，而誘導外源性和內源性LMP1均可增加PD-L1的表達。該研究還發(fā)現LMP1通過STAT3、AP-1和NF-κB信號通路上調PD-L1，而PD-L1通過與免疫細胞上的PD-1結合抑制人體免疫系統(tǒng)反應，逃避人體免疫系統(tǒng)監(jiān)視與殺傷，從而促進腫瘤細胞生長［34］。因此，同時阻斷LMP1致癌通路和PD-1/PD-L1免疫檢查點可能成為治療EBV陽性NPC患者的一種潛在手段。此外，PD-L1的其他組合表達（如MHC-Ⅱ和PD-L1）也被提示能更好地篩選出NPC免疫治療獲益人群，值得進一步深入研究。

T細胞抗原受體與抗原呈遞細胞上的MHC分子結合后，T細胞可以識別和消除癌細胞并執(zhí)行免疫監(jiān)視功能。然而，腫瘤細胞通過各種機制逃避免疫監(jiān)視［53-54］。例如，腫瘤細胞表現出高PD-L1表達，并在T細胞表面與PD-1相互作用，以阻止腫瘤抗原特異性T細胞的有效激活，從而導致腫瘤免疫逃逸［55］。PD-L1表達受轉錄前、轉錄、翻譯和翻譯后修飾過程的多層次調節(jié)，其中轉錄調節(jié)因子，如HIF1α、STAT1/STAT3、NF-κB、IRF1/IRF3、c-Myc及BRD4等均可與PD-L1啟動子結合并上調PD-L1的表達［56］。EBV編碼44種成熟的miRNA，WANG等［57］發(fā)現EBV-miR-BART11和EBV-miR-BART17-3p可上調EBV相關NPC的PD-L1表達并分別抑制FOXP1和PBRM，從而增強PD-L1的轉錄，進而促進腫瘤免疫逃逸，這為EBV相關腫瘤的免疫治療提供了潛在靶點。EBV還能編碼多種circRNA。GE等［58］研究發(fā)現EBV編碼的circBART2.2在NPC中高度表達且在體外和體內上調PD-L1表達并抑制T細胞功能，而circBART2.2可能通過結合RIG-I的解旋酶結構域并激活轉錄因子IRF3和NF-κB促進PD-L1的轉錄，從而導致腫瘤免疫逃逸。LI等［59］發(fā)現溴結構域和末端外抑制劑JQ1能優(yōu)先抑制EBV陽性NPC細胞的生長，JQ1在NPC細胞，尤其是EBV陽性細胞中通過c-Myc依賴性地誘導細胞凋亡，減少細胞增殖并增強放射敏感性，此外JQ1還下調NPC中PD-L1的表達。

盡管目前的研究顯示EBV基因可以調節(jié)PD-L1在腫瘤細胞上的表達，但血漿中EBV DNA的拷貝數或濃度與PD-L1表達的關系及其與預后的關系尚未明確。HU等［60］在198例患者中分析了外周血單核細胞中EBV DNA濃度和腫瘤組織浸潤T淋巴細胞上的PD-L1表達與預后的關系，分別以外周血EBV DNA對數值1.98 log IU/mL以及15%腫瘤組織浸潤T淋巴細胞PD-L1表達作為區(qū)分臨界值，結果發(fā)現，高外周血EBV DNA濃度和低TIL上的PD-L1表達亞組患者是高?；颊撸屯庵苎狤BV DNA濃度和高TIL上的PD-L1表達亞組患者是低?；颊?，且高危組和低危組5年無進展生存（progression-free survival，PFS）率差異顯著（0%vs91.9%，P＜0.001）。然而，也有研究得出不同的結果，如ZHOU等［61］分析了99例NPC患者中PD-L1的表達，盡管發(fā)現PD-L1可能是NPC患者的潛在預后生物標志物，但是未發(fā)現PD-1/PD-L1的表達水平與血漿EBV DNA拷貝數之間的相關性，因此未來仍需要進一步研究闡明PD-1/PD-L1軸誘導的免疫抑制過程中EBV狀態(tài)的潛在機制。

2.2 EBV DNA及PD-L1與鼻咽癌治療療效的相關性

血漿EBV DNA拷貝數能反映腫瘤負荷，與NPC分期及治療療效密切相關。俞霞等［62］比較了152例初診NPC和675例健康體檢者血漿EBV DNA情況，結果顯示血漿EBV DNA診斷晚期NPC的靈敏度達88.8%，且伴隨分期的升高，EBV DNA陽性率呈上升趨勢。在臨床分期基礎上，有研究顯示EBV DNA拷貝數與治療療效密切相關，ZHANG等［63］發(fā)現治療前EBV DNA＞4 650 copies/mL時，誘導化療在總生存期（overall survival，OS）、無病生存期（disease free survival，DFS）和無遠處轉移生存（distant metastasis-free survival，DMFS）率上均獲益。LU 等［64］發(fā)現除了血漿EBV DNA水平，治療前腫瘤體積也是NPC腫瘤控制和生存的獨立預后因素，但血漿EBV DNA的預后意義優(yōu)于腫瘤負荷，其中腫瘤負荷較大和EBV DNA拷貝數較低的患者預后較好。也有研究發(fā)現將治療前的血漿EBV DNA合并到NPC的分期系統(tǒng)中，對生存具有更好的預測作用。LEUNG等［65］根據治療前的血漿EBV DNA水平，將Ⅱ期NPC患者分為中低和高EBV DNA組，結果顯示中低EBV DNA組患者的5年生存率顯著高于高EBV DNA組（90%vs63%）。因此，血漿EBV DNA可用于預測NPC患者的治療療效，也可作為綜合治療方案制定和實時調整的可靠指標。

近年來，以PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑為主的免疫治療給復發(fā)/轉移性NPC的治療帶來了突破。免疫檢查點單藥作為復發(fā)/轉移性NPC二線或二線以上的挽救治療，有效性達到20%以上［3-5，7］。近年兩項隨機、雙盲、安慰劑對照、國際多中心的Ⅲ期臨床研究證實了免疫治療聯合化療作為復發(fā)/轉移性NPC一線治療的療效［5，9］。其中，WANG等［5］發(fā)起的POLARIS-02研究探索了特瑞普利單抗用于一線治療失敗后的復發(fā)/轉移性NPC患者的療效和安全性。該研究入組190例患者，結果ORR達20.5%，中位OS達17.4個月，且PD-L1陽性患者ORR更高（27.1%），PD-L1陰性患者也同樣有近20.0%的ORR，表明PD-L1表達陰性人群同樣獲益。此外，基線EBV滴度＜10 000 IU/mL、基線LDH水平≤2×ULN及PD-L1陽性患者更有可能從特瑞普利單抗治療中獲益。該項臨床研究提示血漿EBV DNA水平和PD-L1的表達在一定程度上可預測NPC的免疫治療療效。MAI等［9］發(fā)起的另一項JUPITER-02研究是一項隨機、雙盲、安慰劑對照、國際多中心的Ⅲ期臨床研究，旨在比較特瑞普利單抗聯合吉西他濱/順鉑與安慰劑聯合吉西他濱/順鉑作為組織學/細胞學證實的復發(fā)性或轉移性NPC患者一線治療的療效和安全性。該研究共納入289例患者，結果顯示：特瑞普利單抗聯合化療組的中位PFS顯著改善，中位PFS為11.7個月，高出安慰劑組3.7個月，患者的無進展生存時間明顯延長；特瑞普利單抗聯合化療組1年PFS率為49.4%，近半數患者超1年未發(fā)生疾病進展，比安慰劑聯合化療組提高了21.5%；中位緩解持續(xù)時間為10.0個月，比安慰劑組的5.7個月延長近1倍，說明聯合組具有更持久的緩解。亞組分析顯示，不論患者年齡、性別、體力狀況、復發(fā)或轉移、EBV DNA定量情況以及PD-L1表達陰性或陽性，在特瑞普利單抗聯合化療組均能觀察到PFS的改善。免疫檢查點抑制劑單獨或聯合化療在復發(fā)和轉移性NPC治療中的作用以及PD-L1表達與療效的相關性在更多的臨床研究中也顯示了同樣的結論（表1）?？傊?，以上臨床研究結果提示血漿EBV DNA水平和PDL1的表達在一定程度上可幫助判斷NPC免疫治療療效，但目前可用于證實EBV DNA水平及PD-L1表達與NPC治療療效相關性的臨床證據仍有限，兩者在NPC治療中確切的作用尚無定論，需更多后續(xù)研究闡明。

表1 復發(fā)/轉移性鼻咽癌免疫治療相關臨床試驗Tab.1 Clinical trials of immunotherapy for recurrent/metastatic nasopharyngeal carcinoma

3 小結

隨著調強放療技術的普及和綜合治療的應用，NPC患者的局部控制率達90%以上，5年生存率超過80%，與其他實體腫瘤相比，療效甚是鼓舞。然而仍有10%～20%的患者在放療后局部復發(fā)或遠處轉移，特別常見于局部晚期NPC患者。越來越多的研究顯示免疫治療在晚期NPC治療中具有良好的前景，因此對患者進行個體化評估，深入了解不同免疫治療方式及其聯合治療方式，給患者帶來最大獲益成為目前重要的研究方向。近年來，EBV DNA及PD-L1表達作為有效利器在NPC的診斷、治療及預后中展現出潛在臨床應用價值，兩者與NPC的免疫微環(huán)境也顯示了密切的關系，因此未來繼續(xù)深入研究并明確兩者在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用，有望將其作為潛在生物標志物對NPC進行分子分型，從而為篩選免疫治療優(yōu)勢人群以及指導晚期NPC患者的精準治療提供新思路。