硫氧還蛋白系統(tǒng)研究進(jìn)展

劉自華 周鵬 李曉娟 唐冬榮 王雯 任依甜 王建林

1蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)系730000；2蘭州大學(xué)第二醫(yī)院輸血科730030

0 引言

硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）系統(tǒng)由Trx、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase,TR）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）組成。Trx和TR在腫瘤患者中高表達(dá)。Trx系統(tǒng)催化時(shí)，NADPH將電子轉(zhuǎn)移至TR，還原Trx，被還原的Trx主要通過(guò)疏基和二硫鍵的相互交換來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同大分子的功能，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、衰老及死亡等。Trx系統(tǒng)作用圖見(jiàn)圖1。

圖1 Trx系統(tǒng)與蛋白分子作用圖

TR是含硒蛋白質(zhì)，在生理?xiàng)l件（pH7.4）下，硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）主要以硒負(fù)離子的形式存在，具有較高的反應(yīng)活性，同時(shí)Sec暴露在還原態(tài)的TR表面，很容易與小分子化合物發(fā)生相互作用。Trx系統(tǒng)是NADPH依賴性還原酶系統(tǒng)。在哺乳動(dòng)物中主要存在細(xì)胞質(zhì)和線粒體兩大Trx系統(tǒng)。Trx3在睪丸所分泌的精子中表達(dá)。值得注意的是，TR是Trx的唯一還原劑。TR1與TR2均為黃素蛋白，包含兩個(gè)同型二聚體，且每個(gè)單體包含兩個(gè)活性位點(diǎn)。TR2進(jìn)入線粒體后經(jīng)剪切生成成熟蛋白，TR2與TR1的結(jié)構(gòu)相似，也含有C末端的Sec活性區(qū)域[1]。

1 Trx

Trx可保護(hù)抵抗多種應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡。1964年，Laurent等[2]首先從大腸桿菌中分離出了Trx。其保守活性位點(diǎn)為-Cys-Gly-Pro-Cys-（CGPC）[3]。Trx不僅可與過(guò)氧化物酶、H2O2結(jié)合來(lái)還原氧化的蛋白質(zhì)，還可與其他蛋白質(zhì)結(jié)合從而調(diào)節(jié)蛋白功能。

Trx在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮著突出作用[4]。Trx最初是作為大腸桿菌的核糖核酸還原酶電子供體而被發(fā)現(xiàn)的。文獻(xiàn)報(bào)道，Trx具有降血壓作用[5]。Trx存在于原核和真核生物中，由α螺旋和β折疊連接組成，熱穩(wěn)定性極高，在植物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的抗氧化作用[6]。在NADPH存在下氧化態(tài)的Trx可被TR還原，從而形成氧化還原系統(tǒng)[4]。Trx在許多信號(hào)通路中發(fā)揮作用，可調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，作為一種生長(zhǎng)因子與硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）相互作用調(diào)節(jié)免疫功能[7]。Trx可清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，調(diào)節(jié)其他酶，減少氧化應(yīng)激。文獻(xiàn)報(bào)道，Trx可保持細(xì)胞內(nèi)的正常氧化還原平衡[4]、還原Gpx3[8]、通過(guò)活性氧清除單線態(tài)氧和羥基自由基[9]、調(diào)節(jié)p53和Nrf2基因表達(dá)[10]、調(diào)節(jié)核因子κB信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)[11]、調(diào)控ASK1進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12]。

2 TR

TR為硒酶，與肺癌關(guān)系密切[13]。TR能清除體內(nèi)活性氧使細(xì)胞內(nèi)外相對(duì)處于平衡，細(xì)胞癌變后，TR表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

2.1 TR結(jié)構(gòu)與種類

大分子TR主要存在于高等真核生物體內(nèi)，相對(duì)分子質(zhì)量為55 ku，主要有3種形式：TR1（主要分布在胞質(zhì)）、TR2（主要分布在線粒體）和TR3（主要分布在睪丸）。人TR1含有接口域、NADPH結(jié)合域和黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）結(jié)合域3個(gè)結(jié)合域。人體各組織均含有TR1，含量為（0．7～1．7）g/kg。其啟動(dòng)子位于-116~+168 bp之間，缺乏TATA盒和CAAT盒，且GC堿基數(shù)目增加。TR1具有很多重要作用包括氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化作用[14]。TR1可為核糖核苷酸還原酶提供還原當(dāng)量，從而參與維持三磷酸脫氧核糖核苷酸庫(kù)[15]。此外，小鼠腦組織中TR1表達(dá)水平較高[16]。

TR2通過(guò)其N末端的線粒體序列經(jīng)胞穿作用進(jìn)入線粒體中，而后被剪切生成成熟蛋白。人TR2基因位于染色體22q11.2，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1566 bp，編碼521個(gè)氨基酸。TR2的相對(duì)分子質(zhì)量為56 ku，由α螺旋及β片層構(gòu)成。TR2與TR1在很大程度上具有相似性，不同之處在于TR2不僅可依靠NADPH作為輔助因子，同時(shí)還可與NADPH參與多種生物化學(xué)反應(yīng)。Nalvarte等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TR2在HEK-293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，較正常組細(xì)胞能更強(qiáng)抵抗外界物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性作用。Conrad等[18]發(fā)現(xiàn)TR2在心臟病發(fā)展、造血功能及心臟功能方面均具有不可替代的作用。TR2在腎臟、心臟、肝臟和腦等器官中表達(dá)量較豐富[19]。Lee等[20]研究發(fā)現(xiàn)，由TR2、NADPH和Trx2構(gòu)成的二硫化物蛋白還原系統(tǒng)對(duì)清除線粒體呼吸鏈過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2起到相當(dāng)大的作用。Jurado等[16]研究發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸組織中TR1和TR2的mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于心臟、肺和腦等其他器官組織。

TR3又稱為硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶，與TR1和TR2的不同之處在于其主要存在于睪丸中。TR3的相對(duì)分子質(zhì)量為57 ku，與TR1和TR2的相對(duì)分子質(zhì)量相近。TR3包括一個(gè)附加的N-谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，其可不依賴NADPH而能直接催化Trx和還原型谷胱甘肽。TR3與TR1、TR2具有51%~54%的同源性。TR3在纖毛組織和肺中亦有表達(dá)。有研究結(jié)果表明，TR3與睪丸癌和男性不育相關(guān)[21]。

TR存在FAD結(jié)合和作用位點(diǎn)，其N端含有相對(duì)保守的活性位點(diǎn)Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys，具有氧化還原催化活性；C端則含有Gly-Cys-Sec-Gly。TR含有NADPH和FAD結(jié)合域，無(wú)作用區(qū)域，具有活性位點(diǎn)。NADPH和FAD結(jié)合域通過(guò)折疊鏈連接。TR在催化下作用位點(diǎn)發(fā)生變化，結(jié)合域從NADPH向FAD旋轉(zhuǎn)67°，底物暴露，因此TR結(jié)合底物有限。

2.2 TR生物學(xué)功能

TR中含有Sec，其為發(fā)揮TR酶活性的重要位點(diǎn)。TR可作用于氧化型Trx，使其變?yōu)檫€原型Trx，Trx的—S2變?yōu)椋ā猄H）2。Trx被還原后，可還原其他蛋白二硫鍵，從而發(fā)揮生物學(xué)活性。此外，TR還能還原其他重要的抗氧化劑和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶[22]。TR1可催化再生輔酶Q10，從而發(fā)揮抗氧化效應(yīng)[23]。TR還可還原脂質(zhì)過(guò)氧化物和H2O2[24]。

TR1存在于細(xì)胞質(zhì)中。人TR1基因位于染色體12q23-q24.1，含有3826 bp的互補(bǔ)DNA，其中包含1650 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼497個(gè)氨基酸[25]。

在通常情況下，UGA是終止密碼子。Sec結(jié)合至含硒蛋白多肽鏈上時(shí)，需要硒代半胱氨酸插入序列（s elenocysteine insertion sequence，SECIS）元件、SECIS結(jié)合蛋白2（SBP2）等生物元件及其他細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)化合物的共同作用。Sec的結(jié)合效率會(huì)影響TR的活性。Sec合成元件的缺乏亦會(huì)改變TR的存在形態(tài)。哺乳動(dòng)物TR的N端存在氧化還原催化位點(diǎn)，C端存在氧化還原活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)；而細(xì)菌的TR是較小的內(nèi)生二聚黃素蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為33 ku。

TR1的酶活性失活可導(dǎo)致早期胚胎死亡[26]，表明TR1是胚胎發(fā)育中極其重要的物質(zhì)。Nrf2可調(diào)節(jié)TR1，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖[27]。Trx可維持細(xì)胞的正常氧化還原狀態(tài)，而TR是Trx的唯一還原劑，因此通過(guò)Trx或TR的特異性底物，TR可發(fā)揮氧化還原作用。

3 Trx系統(tǒng)與疾病關(guān)系

3.1 Trx系統(tǒng)與腫瘤及神經(jīng)退行性疾病關(guān)系

白血病、實(shí)體腫瘤和淋巴癌癌細(xì)胞的TR表達(dá)明顯偏高[28]。在腫瘤早期，Trx可防御癌癥。Welsh等[29]發(fā)現(xiàn)Trx可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和功能。

阿爾茨海默病、帕金森病及亨廷頓病是主要的神經(jīng)退行性疾病。人體大腦需要氧，容易發(fā)生氧化損傷，且隨著年齡增大越易發(fā)生，因此氧化損傷被認(rèn)為是老年人群神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的主要因素[30]。Trx和TR主要位于胞質(zhì)，與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體損傷有關(guān)，可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和蛋白錯(cuò)誤折疊。阿爾茨海默病患者腦中的Trx1水平較低，β-淀粉樣肽（amyloidβ-protein，Aβ）大量累積[31]。過(guò)表達(dá)Trx1可保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗Aβ產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Aβ可降低TR的表達(dá)和活性，從而使Trx1缺乏還原底物的能力[32]。上述研究結(jié)果表明，Trx或TR功能缺失很有可能使神經(jīng)元偏向衰退[33]，但具體作用機(jī)制尚不明確。

文獻(xiàn)報(bào)道，TR和Trx對(duì)Aβ引起的神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用[31]；而Aβ介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)毒作用包括Trx系統(tǒng)的損害和TR活性的降低[32]。Kudin等[34]證實(shí)Trx2系統(tǒng)在大鼠海馬區(qū)H2O2解毒中具有重要作用。這些研究結(jié)果突出顯示了TR是腦中還原當(dāng)量的重要來(lái)源。TR可保持細(xì)胞內(nèi)還原狀態(tài)，在NADPH作用下，TR可清除脂質(zhì)過(guò)氧化物和H2O2[35]。Lovell等[31]將Aβ與海馬神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Aβ單獨(dú)與海馬神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，神經(jīng)細(xì)胞存活率較低；而Aβ、TR與海馬神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，神經(jīng)細(xì)胞存活率升高，表明TR對(duì)Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性具有保護(hù)效應(yīng)。

3.2 Trx系統(tǒng)與其他疾病關(guān)系

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲(chóng)含有TR1，且TR1在紅細(xì)胞內(nèi)期發(fā)揮重要作用[36]。在血吸蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了TR及相關(guān)的Trx、谷氧還蛋白還原酶等[37]。獲得性免疫缺陷綜合征的發(fā)生與人體內(nèi)氧化損傷，特別是與體內(nèi)抗氧化硒蛋白TR1合成的減少和谷胱甘肽過(guò)氧化酶及小分子硒化合物的增加有很大關(guān)系，但具體原因尚不明確。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液及組織中Trx和TR顯著升高，而血漿中變化不明顯。臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的含金化合物金硫葡萄糖和金蘭諾芬是TR的高效抑制劑[38]。文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）使線粒體產(chǎn)生過(guò)多活性氧，引起線粒體功能損傷，活性氧增加細(xì)胞凋亡信號(hào)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，形成高血壓病[39]。TR2存在線粒體中，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)高血壓起著重要保護(hù)作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TR2的大鼠其心肌損傷后預(yù)后較好[40]；高表達(dá)TR2的轉(zhuǎn)基因大鼠可使NO的生物利用度增加，從而保持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能[41]。心臟中的TR基因沉默后會(huì)增加氧化應(yīng)激和心肌肥厚的概率[42]，抑制TR可消除心肌保護(hù)效應(yīng)。心肌炎與活性氧密切相關(guān)，活性氧清除劑能改善心肌炎。此外，低硒能降低許多臟器的TR活性。低硒飼料喂養(yǎng)大鼠的心肌TR活性下降，表明心肌TR對(duì)硒較敏感[36]。心肌TR表達(dá)和活性降低，導(dǎo)致TR的還原功能減弱，心肌抗氧化能力下降，易導(dǎo)致心肌炎。而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可增加心肌Trx的表達(dá)，減輕大鼠自身免疫性心肌炎[43]。

常用的幾種TR抑制劑包括：①鉑類化合物，如奧沙利鉑、順鉑、卡鉑、金諾芬[44]。②三氧化二砷，為T(mén)R的不可逆抑制劑[45]。③莫特沙芬釓（motexafin gadolinium,MGd），為卟啉類化合物，其目標(biāo)分子為胞質(zhì)中的TR1[46]。MGd可阻滯TR1的還原活性，從而生成過(guò)氧化物等[47]。④硝基芳香族化合物，其中最典型的是1-葉綠素-2，4-二硝基苯。⑤黃酮類和姜黃化合物，二者長(zhǎng)期被用于腫瘤治療，其作用由TR系統(tǒng)介導(dǎo)。姜黃化合物能抑制TR；黃酮對(duì)假結(jié)核棒狀桿菌硫氧還蛋白A1具有抑制作用[48]。

4 TXNIP

TXNIP在細(xì)胞水平影響氧化平衡狀態(tài)[49]。其為調(diào)節(jié)糖代謝的一種重要物質(zhì)，可調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能，因此與1型和2型糖尿病關(guān)系密切[50-51]。TXNIP下調(diào)能導(dǎo)致乳腺癌的高增殖活性和雌激素依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)[52]。在前列腺癌中，TXNIP與糖酵解關(guān)系密切[53]。不僅如此，TXNIP還與炎癥因素導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病信號(hào)通路有關(guān)[54]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)TXNIP激活子癇前期NLRP3炎性體[55]。

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，Trx系統(tǒng)是體內(nèi)的一種重要抗氧化還原系統(tǒng)，與細(xì)胞的增殖、分化和死亡關(guān)系密切，與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓和心肌炎等疾病相關(guān)聯(lián)。Trx系統(tǒng)能清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，使細(xì)胞內(nèi)外處于平衡，且其與TXNIP相互作用，對(duì)于糖代謝調(diào)節(jié)和腫瘤治療具有重要作用。對(duì)Trx系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)是許多疾病藥物治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突