艽龍膠囊對大鼠急性胃潰瘍的保護作用及機制研究

陳貴娥 唐天樂 唐源 董明芝 劉鐵明 梅其炳 孫陽△

(1.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)海軍第一醫(yī)院藥劑科，廣東 湛江 524005；2.空軍軍醫(yī)大學藥理教研室， 國家中藥胃腸藥理重點實驗室,陜西 西安 710032；3.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710032)

胃潰瘍是消化性潰瘍中最常見的類型，胃黏膜上皮的完整性、黏膜細胞更新、表皮生長因子、黏液-碳酸氧鹽屏障、黏膜血流、前列腺素等因素構成了黏膜的防御屏障[1-3]。幽門螺桿菌感染、應激、藥物等是導致潰瘍的攻擊因子與保護胃黏膜的防御因子失衡的主要因素，是胃潰瘍發(fā)生的主要原因[4-8]。中醫(yī)藥在防治胃潰瘍方面具有獨特優(yōu)勢，艽龍膠囊是首個從天然植物秦艽中提取出來的以龍膽苦苷為主要成份的純中藥制劑。本品具有清肝瀉熱之功效，用于治療功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見胃脘飽脹，脘部燒灼，口干口苦等。本研究通過建立無水乙醇誘發(fā)大鼠急性胃潰瘍模型，探討艽龍膠囊對胃潰瘍的預防作用，為該產品的臨床應用與深入研究提供實驗依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 阿司匹林，廠家：沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，貨號：170602。分析純酒精(安徽安特食品股份有限公司，批號：1610073301 )； 試劑盒： MPO試劑盒，南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100管/48樣，批號：20171007；SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100管/96樣，批號：20171026。肝糖原試劑盒，南京金益柏生物科技有限公司，規(guī)格：100管/48樣，批號：JEB-13992。儀器設備：電子天平(ME204，METTLER公司)；光學顯微鏡(Nikon H600L，日本Nikon公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf 5418R，德國Eppendorf公司)；實驗病理系統(tǒng)(HM34E，德國Ieiss公司)；酶標儀(Imark，美國伯樂)。實驗動物：SD大鼠，雌雄各半，體重200～225 g。購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(軍)2012-0007。單籠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內，濕度40%～50%，溫度(22±2℃)。顆粒飼料 (空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供) 喂養(yǎng)，自由飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)5天，造模實驗前1小時禁食。

1.2實驗方法 (1)動物分組及實驗性大鼠急性胃潰瘍模型的復制：分組：SD大鼠60只，適應環(huán)境飼養(yǎng)3d，按照隨機數字表法分為6組，每組10只，即空白對照組、模型對照組、雷尼替丁對照組、艽龍膠囊高、中、低3個劑量組。模型復制：采用乙醇 + 阿司匹林法，復制大鼠胃潰瘍模型[9,10,11]。給藥前禁食不禁水12 h，首日給藥前先灌胃無水乙醇1 ml/200g，1h后再灌胃阿司匹林200 mg/kg，此后每日1 次，連續(xù)給藥4 d，復制胃潰瘍模型。(2)給藥治療:劑量設置依據：艽龍膠囊的臨床劑量為每次2粒，1日3次，規(guī)格為0.08g/粒，故60 kg成人為0.48g/日，約8 mg/kg，折算到大鼠劑量約為50 mg/kg，作為中劑量，設高劑量100 mg/kg，低劑量為25 mg/kg。給藥：從實驗第1天開始，空白對照

組和模型對照組給予蒸餾水，10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)7d；艽龍膠囊+模型3個劑量組分別按100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg給藥，每日1次，連續(xù)7d。陽性對照藥雷尼替丁(30 mg/kg)給藥，每日1次，連續(xù)7d。(3)一般情況觀察：動物生長狀況、糞便性狀、被毛色澤、自主活動、行為活動，體重每日一次。(4)潰瘍面積測定：末次給藥后禁食12 h，用乙醚麻醉動物，腹主動脈采血處死動物，取胃，沿胃大彎側剪開鼠胃，用冰冷的生理鹽水洗滌胃體，在冰冷的紙上黏膜向上鋪平，按Guth[8]法計算：損傷長度≤1 mm( 包括糜爛點) 為1分；1 mm < 損傷≤2 mm 為2 分；2 mm < 損傷≤3 mm 為3 分；3 mm< 損傷≤4 mm 為4 分；損傷> 4 mm 為5 分；損傷寬度> 2 mm 者分值加倍，所有得分相加為潰瘍指數。取潰瘍及邊緣部分約0.5 cm2，用10%福爾馬林固定胃組織，進行病理組織學檢查。其余部分刮取粘膜，液氮速凍，轉入-80℃保存，待測MPO和SOD活性。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，數據用均數±標準差表示。對測定結果行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1大鼠一般情況：正常組大鼠活潑，色澤光滑，主動飲食，飲食正常，大便濕潤，呈橢圓形或條索狀。實驗過程中，除正常對照組以外其余各組均在造模第3d開始出現體重減輕或增長緩慢，毛發(fā)不光滑，蓬松，精神萎靡，活動減少，喜歡群集。艽龍膠囊大劑量組(100 mg/kg)對大鼠體重與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，大鼠體重明顯改善。上述結果可見，艽龍膠囊能改善酒精引起的胃潰瘍大鼠一般情況，包括行為活動、體重。見表1、表2。

表1 艽龍膠囊對酒精引起的胃潰瘍大鼠(雌)體重的影響

表2 艽龍膠囊對酒精引起的胃潰瘍大鼠(雄)體重的影響

2.2胃粘膜潰瘍指數 按Guth[3]法計算潰瘍指數，圖1可見，空白對照組小鼠胃粘膜呈現正常肉色，粘膜皺襞光滑，未見出血點；模型組可見彌散性出血點，胃部粘膜出現充血、水腫、出血及糜爛點；艽龍膠囊各組均可抑制潰瘍形成。經胃潰瘍指數分

析，結果顯示，模型組大鼠胃粘膜潰瘍指數明顯增高；與模型組相比較，艽龍膠囊低、中、高劑量組和雷尼替丁組大鼠胃粘膜潰瘍指數明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，隨著劑量的增加，其作用效果更為顯著。見圖1、表3。

圖1 艽龍膠囊對酒精引起的大鼠胃潰瘍的影響

表3 艽龍膠囊對酒精引起的大鼠胃潰瘍的影響

2.3胃黏膜MPO和SOD的水平 胃粘膜MPO

和SOD水平測定結果顯示，模型組大鼠粘膜組織中MPO明顯升高，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．01)，艽龍膠囊50、100 mg/kg劑量組胃粘膜組織中MPO水平較模型組、雷尼替丁明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組大鼠胃粘膜組織中SOD表達明顯降低，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．01)，艽龍膠囊50 mg/kg、100 mg/kg劑量組胃粘膜組織中SOD表達較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．01)，雷尼替丁組與艽龍膠囊100 mg/kg劑量組比較，SOD表達降低，有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。見表4。

表4 艽龍膠囊對酒精引起的胃潰瘍大鼠胃粘膜組織MPO、SOD水平的影響

2.4病理組織學檢查 胃組織做HE病理檢測，正常組大鼠胃粘膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，未見明顯病理改變，無充血水腫。模型組粘膜上皮見局灶性脫落，見充血水腫，粘膜腺體萎縮，腺體呈囊狀擴張，同時粘膜固有層、粘膜肌層變薄且肌層紊亂、下緣缺損。艽龍膠囊對胃潰瘍大鼠胃病理損傷程度的影響，實驗結果顯示，艽龍膠囊大、中劑量給藥組能明顯減輕胃潰瘍大鼠的胃黏膜損傷程度，并具有明顯的量效關系。見圖2。

注：A:正常組；B：模型組；C：雷尼替丁組；D：艽龍大劑量組；E：艽龍中劑量組；F：艽龍小劑量組。圖2 艽龍膠囊對酒精引起的胃潰瘍大鼠胃粘膜HE病理形態(tài)觀察(×100)

3 討 論

乙醇誘導的急性胃潰瘍模型制備方法可靠、周期短、損傷機制明確，有利于研究藥物對胃潰瘍防治機制的研究[12-14]。本實驗利用無水乙醇誘導大鼠胃潰瘍模型結果顯示：肉眼觀察模型組大鼠胃黏膜可見散在出血點、條索樣出血帶和點狀潰瘍面鏡下觀察可見胃黏膜組織破損、不完整、伴出血和炎細胞浸潤。這表明胃潰瘍大鼠模型復制成功。

從中藥及天然藥物中尋找療效確切、成分單一、易于觀察的有效活性成分是防治胃潰瘍的有效途徑之一。本實驗以酒精聯合阿司匹林方法成功復制大鼠胃潰瘍模型，表現為大鼠胃肉眼可見潰瘍，粘膜組織中MPO水平的升高和SOD水平的降低，胃粘膜組織病理形態(tài)學改變。MPO是中性粒細胞產生的一種重要的過氧化物酶，其數值能夠提示中性粒細胞的數目與中性粒細胞的浸潤情況，也可反應炎癥損傷的程度[15]。SOD，是胃粘膜的保護因子之一，能夠抑制胃部的壁細胞通過氧化磷酸化產生大量ATP 和ROS，進而發(fā)揮保護胃黏膜的作用[16]。給予艽龍膠囊25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg治療7d后，觀察到：艽龍膠囊給藥50 mg/kg、100 mg/kg劑量組大鼠體重較正常組大鼠體重下降無統(tǒng)計學差異；艽龍膠囊各劑量組大鼠胃粘膜潰瘍指數較模型組比較有顯著意義(P<0.01)，胃潰瘍程度有明顯的改善。與雷尼替丁組比較，艽龍膠囊100 mg/kg劑量組對大鼠胃潰瘍程度改善無顯著差異；胃粘膜組織MPO和SOD水平結果顯示：艽龍膠囊使胃潰瘍大鼠粘膜組織中MPO表達較模型組降低，SOD表達水平達較模型組升高； HE結果顯示艽龍膠囊100 mg/kg劑量組明顯改善大鼠胃粘膜組織病理形態(tài)。此外，本實驗采用雌性和雄性不同性別大鼠為研究對象，是為探討大鼠胃潰瘍模型及給藥治療是否存在性別差異。我們的結果表明，雌性和雄性各組在模型復制和給藥治療效果方面均無顯著差異，提示，艽龍膠囊治療大鼠胃粘膜損傷的作用與性別因素無顯著相關性。

綜上所述，預防應用艽龍膠囊可減輕無水乙醇聯合阿司匹林誘導的胃黏膜損傷，同時可以改善胃黏膜中壁粘膜組織中MPO及SOD表達水平，抑制粘膜損傷。