凡納濱對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)可視化環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術方法的優(yōu)化與應用

葛 輝 ，吳建紹，楊章武，吳麗云，張 哲，杜秀萍，洪 偉，林克冰，林 琪，林嘉銘，周 宸*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，原產(chǎn)于厄瓜多爾和其他南美太平洋沿岸水域，俗稱南美白對蝦，是世界三大對蝦養(yǎng)殖種類之一[1]。由于生長迅速、抗逆性強、可高密度養(yǎng)殖、鹽度適應范圍大，因此其養(yǎng)殖產(chǎn)量在世界對蝦總產(chǎn)量中占有很大比例[2]。然而，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷提高，對蝦養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，導致對蝦養(yǎng)殖業(yè)病害日益嚴重。疾病的暴發(fā)已成為阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素之一[3]。

目前對蝦養(yǎng)殖業(yè)中大約有20種不同的病毒，已造成大量的對蝦死亡和嚴重的經(jīng)濟損失[4-5]。其中，傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)是蝦的主要病原之一。IHHNV是一種無包膜二十面體的單鏈線性DNA病毒，也稱細角濱對蝦濃核病毒(Penaeusstylirostrisdensovirus，PstDNV)[6]。IHHNV自1981年在美國夏威夷地區(qū)的細角濱對蝦(Penaeusstylirostris)中首次發(fā)現(xiàn)以來，迅速向世界各地傳播，在北美、南美、美洲中部、加勒比等印度洋和太平洋的許多地區(qū)均有報道[7]。

IHHNV宿主種類繁多，包括凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponensis)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、寬溝對蝦(Penaeuslatisulcatus)等[8]。雖然該病毒感染凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦后不會導致對蝦的大量死亡，但該病毒對對蝦仔蝦的危害較大[9]。仔蝦感染該病毒后，會出現(xiàn)生長緩慢，以及表皮崎形引起的觸角鞭毛皺起、額劍彎曲、表皮粗糙或殘缺、腹部甲殼病變、尾節(jié)彎曲，還有規(guī)格參差不齊等癥狀，稱為慢性矮小殘缺綜合征(Runt-deformity syndrome，RDS)，對養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[10]，因此，世界動物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health，OIE)將IHHNV導致的傳染性皮下及造血器官壞死病列為必須申報的甲殼類疾病之一[11]。

感染IHHNV的存活對蝦將終生攜帶該病毒，并能通過受精卵將病毒垂直傳播到下一代[12]，或通過水平傳播傳遞到其他個體[13]。因此，在還沒有有效的防治措施來控制IHHNV感染的情況下，早檢測早預防并控制疾病的傳播顯得尤為重要。

目前，動物疫病檢測方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學和生化方法、分離鑒定方法、免疫學方法、分子生物學方法、蛋白質指紋圖譜分析方法等[14-15]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)標準推薦的IHHNV檢測方法是熒光實時定量PCR方法和常用PCR方法。基于PCR的檢測方法靈敏、特異，但是需要昂貴的設備和相對復雜的步驟，耗時約2 h，在實際水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用明顯不足。病原體的快速檢測與鑒定需要一種真正簡單和快速的現(xiàn)場檢測方法。環(huán)介導等溫核酸擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本研究人員Notomi等于2000年首次開發(fā)的一種在體外等溫擴增特異核酸片段的新技術[16]。其基本原理是對靶基因的6個特異部位設計引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地擴增，不需要模板的熱變性和長時間溫度循環(huán)，對設備要求低[17-18]。這些優(yōu)點使得它在流行性細菌或病毒的定性和定量檢測等方面有著廣泛的應用[19]。因此，本研究根據(jù)IHHNV病毒基因中的一段序列，采用Primer Explorer V4軟件設計LAMP特異性引物組合，建立了一種IHHNV-LAMP檢測技術，以期為養(yǎng)殖現(xiàn)場的快速檢測IHHNV病毒提供快速高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

凡納濱對蝦采自于漳浦縣佛曇鴻達水產(chǎn)育苗場。IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、魚核酸(斜帶石斑魚總核酸)、沙門氏菌、綠膿桿菌和檸檬酸桿菌等核酸均-80℃保存于本實驗室。BstDNA聚合酶購自紐英倫(NEB)生物技術(北京)有限公司；pUC19載體購自寶生物工程(大連)有限公司；序列合成和DNA測序委托上海捷瑞生物工程有限公司完成；其余試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 傳染性皮下及造血組織壞死病毒LAMP引物篩選

根據(jù)GenBank發(fā)布的IHHNV基因組序列及相關文獻資料，選取高度保守序列區(qū)的一段序列，按照LAMP引物的設計原則，采用PrimerExplorer V4軟件設計LAMP引物。共設計了5套引物，經(jīng)篩選后選用其中一套共6條引物，選用的引物序列如表1所示。

表1 實驗所用引物

1.3 LAMP反應體系

將IHHNV-2引物以IHHNV病毒的核酸和水為模板，在63℃下進行LAMP反應60 min，其中，各引物的用量分別為FIP(40 μmol/L)、BIP(40 μmol/L)各1.0 μL，F(xiàn)3(5 μmol/L)、B3(5 μmol/L)各1.0 μL，環(huán)引物(20 μmol/L)1.0 μL；以NNV的總RNA為模板的反應體系中添加逆轉錄酶1.0 μL，反應結束后，通過觀察擴增曲線分析擴增結果。其中，引物擴增體系如表2所示。

表2 IHHNV-LAMP擴增引物的篩選體系

1.4 傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性質粒的構建及質量檢測

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的IHNNV病毒基因，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成該病毒的部分核酸序列。將該合成的核酸序列與克隆載體PUC19連接，轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。細胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上。從平板挑選40個單菌落進行菌落PCR鑒定重組子(PUC19-IHNNV)，產(chǎn)物經(jīng)由1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由上海捷瑞生物工程有限公司測序，鑒定重組質粒PUC19-IHNNV中的插入序列。

IHHNV-2引物分別以IHHNV病毒核酸、PUC19-IHHNV和水為模板，進行LAMP反應，在63℃下進行LAMP反應60 min。同時IHHNV-2引物分別以PUC19-IHHNV和稀釋100倍的PUC19-IHHNV模板，進行LAMP反應，每組做2個平行，以檢測質粒稀釋前后質量。

1.5 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物特異性實驗

采用篩選后的引物組，分別以IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、魚核酸(斜帶石斑魚總核酸)、沙門氏菌、綠膿桿菌和檸檬酸桿菌等核酸為模板，在63℃下進行LAMP反應60 min，以檢測本研究建立的IHHNV-LAMP檢測方法的特異性。反應結束后，通過觀察擴增曲線分析擴增結果。

1.6 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物靈敏度檢測

用濃度為315 ng/μL(5.29×1010copies/μL)的IHHNV病毒陽性質粒為實驗模板，按10倍梯度稀釋，做靈敏度實驗。

采用篩選后的引物組，分別以濃度為3.15 ng/μL(5.29×108copies/μL)、315 pg/μL(5.29×107copies/μL)、31.5 pg/μL(5.29×106copies/μL)、3.15 pg/μL(5.29×105copies/μL)、315 fg/μL(5.29×104copies/μL)、31.5 fg/μL(5.29×103copies/μL)、3.15 fg/μL(529 copies/μL)、315 ag/μL(52.9 copies/μL)、31.5 ag/μL(5.29 copies/μL)、3.15 ag/μL(0.529 copies/μL)的IHHNV病毒陽性質粒作為模板；每個體系中加入2 μL模板，水作為陰性對照組，在63℃下進行LAMP反應60 min，反應結束后，通過觀察擴增曲線分析擴增結果。

1.7 不同IHHNV檢測方法的靈敏度比較分析

為確定本研究建立的IHHNV-LAMP檢測方法的靈敏度，以構建的pUC19-IHHNV質粒，用QuantusTMFluorometer測定1∶100稀釋的pUC19-IHHNV質粒濃度。根據(jù)計算的拷貝數(shù)梯度稀釋質粒，使稀釋倍數(shù)分別為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109倍。按OIE推薦的普通PCR、qPCR的要求進行擴增反應。普通PCR、qPCR的擴增產(chǎn)物均進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

根據(jù)如下公式計算1∶100稀釋pUC19-IHHNV質粒的拷貝數(shù)：

質?？截悢?shù)/μL=

(1)

2 結果與分析

2.1 傳染性皮下及造血組織壞死病毒LAMP引物篩選

結果顯示引物IHHNV-1能夠在33 min左右將陽性核酸擴增出來，引物IHHNV-2能夠在25 min左右將陽性核酸擴增出來，引物IHHNV-4能夠在43 min左右將陽性核酸擴增出來，所以含有環(huán)引物的IHHNV-1、IHHNV-2、IHHNV-4引物初步能夠使用，待后續(xù)繼續(xù)驗證；本實驗中，取IHHNV-2為實驗引物。引物IHHNV-3在60 min內(nèi)不能擴增出陽性核酸，引物IHHNV-5雖然能夠在55 min左右將陽性核酸擴增出來，但時間太長，因此IHHNV-3、IHHNV-5均舍棄。

2.2 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物特異性實驗

實驗結果如圖2和圖3所示，只有IHHNV病毒的核酸出現(xiàn)擴增，其他對照病毒、細菌和水均未檢測出擴增結果，顯色結果與曲線圖一致。這說明建立的以IHHNV-2為引物的IHHNV-LAMP檢測方法具有良好的特異性。

注：1.IHHNV陽性核酸；2.水；3.NNV核酸；4.魚核酸；5.沙門桿菌；6.綠膿桿菌；7.檸檬酸桿菌。

2.3 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物靈敏度檢測

2.3.1 重組質粒pUC19-IHHNV的質量檢測

引物在檢測時，質粒均在10～16 min出現(xiàn)擴增，比提取的IHHNV病毒核酸(36～40 min)擴增速度快，這說明本研究制備的IHHNV病毒陽性質粒優(yōu)良，符合實驗要求。稀釋100倍的IHHNV病毒陽性質粒與未稀釋的質粒原液均在16 min左右出現(xiàn)擴增，這說明本實驗制備的IHHNV病毒陽性質粒符合實驗要求。

2.3.2 IHHNV-2靈敏度檢測實驗

用濃度為315 ng/μL(5.29×1010copies/μL)的PUC19-IHHNV質粒為實驗模板，依次10倍梯度稀釋，做靈敏度實驗。第一孔濃度為3.15 ng/μL，每管加入2 μL，以此類推。

引物IHHNV-2的靈敏度檢測的實驗結果如圖5和圖6所示：IHHNV病毒陽性質粒含量在63 ag～6.3 ng均能檢測到擴增，陰性對照未見擴增，可見IHHNV-2引物組的最低檢測限為63 ag，約10.3 copies。

注：1為3.15 ng/μL；2：315 pg/μL；3：31.5 pg/μL；4：3.15 pg/μL；5：315 fg/μL；6：31.5 fg/μL；7：3.15 fg/μL 8：315 ag/μL；9：31.5 ag/μL；10：3.15 ag/μL；11：水。

2.3.3 不同IHHNV檢測方法的靈敏度比較

用1∶100稀釋的pUC19-IHHNV質粒進行后續(xù)梯度稀釋，使稀釋倍數(shù)分別為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109倍，拷貝數(shù)分別為5.04×107copies/μL、5.04×106copies/μL、5.04×105copies/μL、5.04×104copies/μL、5.04×103copies/μL、5.04×102copies/μL、5.04×101copies/μL。梯度稀釋后進行qPCR和普通PCR的產(chǎn)物電泳結果對比如圖7所示。qPCR至少可檢測到的稀釋度為109，又因為使用了8 μL質粒，則拷貝數(shù)為50.4 copies×8=403.2 copies。同樣的，PCR至少可檢測到稀釋度為109，拷貝數(shù)為403.2 copies。而從qPCR Cq值數(shù)據(jù)上分析，理論可檢測到的拷貝數(shù)至少為7.84 copies。

注：A為qPCR；B為普通PCR；M為DNA marker。

3 討論

目前暫無有效的治療對蝦病毒病的手段，對蝦病毒病的防治與控制是一個復雜且系統(tǒng)性的工程，涉及到蝦池的消毒殺菌、投飼、使用藥物增強防病能力、藥物治療等諸多方面。近幾年來隨著檢測技術的發(fā)展以及病毒的研究，IHHNV的檢測技術也越來越成熟且多樣化，其中主要包括普通PCR方法、qPCR方法、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、組織病理學切片等[20-21]。而在現(xiàn)場的檢測中，要選擇最適合且便捷的檢測方法，才能在實際運用中得到更好的結果。

目前國內(nèi)外對蝦IHHNV最常用的檢測方法是聚合酶鏈式反應(PCR)，需要復雜的操作步驟和條件，以及昂貴的儀器，而LAMP反應僅在恒溫條件下便可進行，只需具有穩(wěn)定熱源的裝置即可，極大地降低了操作難度和儀器成本，更加有利于現(xiàn)場快速檢測。

環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)，最初在2000年由日本研究人員Notomi發(fā)明。該技術可結合特定的熒光染料從而出現(xiàn)肉眼可見的顯色反應，檢測人員可以根據(jù)顏色的變化來得出結果。因此，LAMP方法已被成功用于多種病毒、真菌、細菌等病原的分子生物學檢測和診斷，甚至在性別鑒定、各種疫病、食品安全的檢測中也得到應用[14，21-22]。LAMP技術本身也在改進和提高，并與其他技術合并應用，如熒光LAMP技術[23]、Stem Primers在LAMP中的應用[24]、橫向流動試紙條檢測方法(LFD)[25]、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分型研究[26]等。由此可見，LAMP方法得到了眾多科研人員的認可。而在其他輔助條件下，LAMP方法將有更多更廣泛的應用。本研究開發(fā)的IHHNV-LAMP檢測方法是一種適用于現(xiàn)場快速檢測的非常有前途的檢測方法。

本研究對GenBank收錄的IHHNV基因組序列進行比對并選取高度保守序列區(qū)的一段約1 447 bp的序列。針對該序列設計6條引物，其中包括1對環(huán)引物，從而把反應時間縮短到30 min以內(nèi)，并以此判別陰陽性。與普通PCR相比，本研究在恒溫熱水浴即可完成操作，不需要對模板進行熱變性處理，節(jié)省了因溫度循環(huán)而消耗的時間，對儀器依賴性小。在63℃下進行25～33 min的LAMP檢測，比李紅梅等的快[23]。很多報道中曾提到過，使用PCR診斷IHHNV經(jīng)常有假陽性結果的出現(xiàn)，原因主要是IHHNV的部分序列插入到宿主對蝦的基因組中。在本研究中以水、石斑魚核酸、NNV病毒等6種核酸為模板，均未檢測到任何IHHNV的擴增，表明本方法能夠滿足檢測需求，也說明了本研究所選擇的檢測序列片段合理。目前為止，對IHHNV的檢測已應用了多種技術，其中靈敏度相對較高的技術都是基于PCR的擴增技術，包括傳統(tǒng)的PCR技術和qPCR技術。為了驗證IHHNV-LAMP檢測體系的檢測性能，筆者又構建了普通PCR-IHHNV和qPCR-IHHNV檢測體系。將三者進行比較。結果顯示，三個體系都顯示出了很優(yōu)越的檢測性能。但是，IHHNV-LAMP檢測體系的靈敏度和特異性優(yōu)于普通PCR-IHHNV檢測技術；其次反應由于借助了從dNTPs中解離出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子結合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，用肉眼即可觀察到反應結果，借助濁度儀可獲得精確的結果；并且本體系在反應體系中添加了鈣黃綠素，有核酸擴增的反應產(chǎn)物在紫外光下可觀察到黃綠色熒光，不需要復雜的加熱系統(tǒng)和成像系統(tǒng)；僅需在63℃、25 min內(nèi)就可得出肉眼檢測結果，更適合于養(yǎng)殖現(xiàn)場的實地診斷。

綜上所述，本研究基于GenBank收錄的IHHNV基因組序列所建立的LAMP檢測方法，不僅操作簡單，反應速度快，特異性好，靈敏度高，成本低廉，而且可以直觀地觀察反應的進行情況，可用于實驗室快速分析，也適用于對蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場的診斷。