高通量測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷中的應用

趙斯鈺，吳 言，鄭妍妍，高 蘭，賈珊珊

(陜西省西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710003)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是因病毒、真菌、細菌等各種致病微生物感染引起的腦實質(zhì)或脊髓炎癥性病變。因中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏淋巴管，蛛網(wǎng)膜下腔缺少毛細血管，感染后炎癥反應癥狀往往病情嚴重，病情進展迅速[1-2]。這就對疾病的早期診斷提出更高要求，以便針對性治療，避免延誤最佳治療時機。高通量測序，即二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)，利用現(xiàn)有微生物群基因信息群，采用生物信息學方法，與測序結果比對，進而鑒別微生物種類[3-4]。但目前有關NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的診斷價值，卻少有報道。本研究回顧性分析81例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒臨床資料，探討NGS的應用價值，報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 納入2019年2月—2020年8月我院收治的81例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒作為研究對象。納入標準：①中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷參照腦脊液病原體培養(yǎng)結果[5]；②患兒年齡0～14歲；③患兒病歷資料完整。排除標準：①凝血功能障礙者；②拒絕腰椎穿刺者；③合并有顱腦外傷、顱內(nèi)出血或腦腫瘤者；④肝腎功能不全或有嚴重心肺基礎性疾病者。根據(jù)腦脊液病原體培養(yǎng)結果將81例患兒分為A組(病毒性腦炎，20例)、B組(結核性腦膜炎，28例)、C組(化膿性腦膜炎，24例)及D組(隱球菌性腦膜炎，9例)。四組患兒基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組患兒基本資料比較

1.2儀器和試劑 Select BioProducts型渦旋震蕩儀(廣州菲羅門科學儀器有限公司)。蛋白酶K(上海云序生物科技有限公司)，裂解液(按GB：Carrier RNA=100∶1比例配置，杭州開泰生物技術有限公司)，洗脫緩沖液(赫澎生物科技有限公司)。

1.3腦脊液采集 在發(fā)病急性期(入院周內(nèi))行常規(guī)腰椎穿刺術：患者側臥、屈膝，脊柱后凸，以髂后上棘連線與脊柱后正中線交點為穿刺點(一般為第3～4腰椎棘突間隙)，采用2%利多卡因進行局部麻醉，麻醉起效后進針，進針深度4～6 cm，在患者感到有阻力消失的落空感時，緩慢抽出，留取3 mL腦脊液，冷凍保存?zhèn)溆茫?4 h內(nèi)送檢。

1.4NGS 檢查時先解凍，將樣本置于離心管內(nèi)，采用Select Bio Products型渦旋震蕩儀進行震蕩破壁，再次離心后取上清液。取600 μL樣本，加入10 μL蛋白酶K。加入300 μL裂解液，37 ℃溫浴1 h，加入無水乙醇。吸取樣本混合物，離心后棄濾液。依次向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD、600 μL漂洗液PW，離心后棄濾液。將吸附柱晾干，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入50 μL洗脫緩沖液TB，靜置后離心，取濾液，作為DNA溶液。采用SinapTec超聲波破碎儀將樣本DNA打斷至150～200 bp。采用Qubit dsDNA HS Assay Kit質(zhì)控DNA文庫濃度，采用BGISEQ-500/50 NGS系統(tǒng)進行測序。采用BWA去除人源性序列、低質(zhì)量序列及含N序列。與細菌庫、病毒庫及真菌庫比對，計算相關參數(shù)。

1.5診斷標準[6-7]以Unique reads條數(shù)≥2為NGS結果陽性，判定為病毒性腦膜炎；以結核分枝桿菌復合群種水平序列數(shù)(mycobacterium tuberculosis complex species level sequence number，MRN)≥1為結果陽性，判定為結核性腦膜炎；以Unique reads條數(shù)≥5為NGS結果陽性，判定為化膿性腦膜炎；以NGS發(fā)現(xiàn)隱球菌DNA為結果陽性。以腦脊液病原學檢測結果為金標準，病毒性腦炎：腦脊液檢測特異性病毒抗體，腦脊液中白細胞計數(shù)正?；驍?shù)十倍增高，臨床可見顱內(nèi)壓升高、發(fā)熱或意識障礙、驚厥；隱球菌性腦膜炎：腦脊液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病原菌，臨床可見發(fā)熱、漸進性頭痛、精神錯亂、嗜睡；結核性腦膜炎：以腦脊液病原學檢測出陽性結果為金標準，臨床可見間斷頭痛、發(fā)熱、驚厥、反射消失或肢體癱瘓；化膿性腦膜炎：以腦脊液病原學檢測出陽性結果為金標準，臨床可見顱內(nèi)壓升高，腦膜刺激征。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料組間比較采用F檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1NGS判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病價值分析 NGS檢測隱球菌性腦膜炎NGS診斷化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎的 Kappa值高于病毒性腦炎好結核性腦炎。見表2。

表2 NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病結果 (例數(shù)，%)

2.2NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病價值比較 NGS診斷病毒性腦炎、結核性腦膜炎、化膿性腦膜炎及隱球菌性腦炎的特異度、陽性預測值及陰性預測值比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中NGS診斷隱球菌性腦膜炎的特異度、準確度及陰性預測值顯著高于其診斷病毒性腦炎和結核性腦炎的價值，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 NGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的價值比較 (例數(shù)，%)

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病發(fā)病范圍廣泛，多發(fā)生于老年和兒童，尤其以兒童最為多見，且兒童機體功能尚未發(fā)育成熟，自身免疫抵抗能力低下，病情進展迅速，部分患兒可造成后遺癥，甚至致殘致死，導致不良預后的發(fā)生[8]。近年來研究顯示，因顱腦有創(chuàng)檢查的開展、免疫功能降低及抗生素的濫用等原因，兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病發(fā)生率有上升趨勢[9]。早期準確診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是有效治療和改善預后的關鍵，因而本研究重點探討NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患兒診療中的應用價值。

病毒性腦炎多因帶狀皰疹病毒和單純皰疹病毒感染引發(fā)，是臨床最常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病類型之一[10]。腦組織病毒分離檢測是目前病毒性腦炎的金標準，但腦組織活檢創(chuàng)傷大、耗時長[11]，難以在臨床廣泛推廣。而NGS則無需使用特異性病原體引物，實現(xiàn)了對病原體的無靶向、無偏移篩查[12]。因RNA易降解，本研究采用DNA進行測序，對于感染累及軟腦膜的患兒，因血腦屏障的存在，病原體先進入腦脊液，然后隨腦脊液回收進入血液循環(huán)[13]，因而以腦脊液為實驗標本進行病原體檢測，敏感度更高。另外，對于病毒性腦炎疑似患兒，經(jīng)抗生素干預治療后，病毒核酸逐漸被降解，這可能是NGS陽性檢出率較低的原因[14]，因而對于疑似患兒應盡早進行NGS檢查，以實現(xiàn)病毒性腦炎的早診斷和早處理，改善患兒預后?；撔阅X炎可經(jīng)血行感染、醫(yī)源性感染等多途徑感染導致，病情兇險。腦脊液細菌培養(yǎng)作為診斷化膿性腦炎的金標準，雖然特異度高，但敏感度僅0.25[15]。而隱球菌性腦膜炎雖然發(fā)病率低，但隱球菌性腦膜炎影像檢查結果和臨床癥狀缺乏特異性，具有多變性。既往多依靠實驗室進行診斷，但此種方法陽性率低，且結果依賴與操作者技術水平，臨床推廣受到局限。NGS根據(jù)酶級聯(lián)化學發(fā)光反應原理，獲得互補鏈序列信息，完成樣品分析，為臨床診斷提供依據(jù)[16-17]。本研究采用NGS進行，發(fā)現(xiàn)NGS判斷化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎的Kappa值較為滿意，準確度分別為82.72%和90.12%。本研究以Unique reads≥5為陽性判斷依據(jù)，結果顯示其判斷化膿性腦炎的敏感度和特異度均尚可。而NGS診斷隱球菌性腦膜炎的特異度和陰性預測值分別達90.28%和98.48%，高于對其他類型疾病的識別率，提示NGS對診斷隱球菌性腦膜炎價值較高，這與Zhang等[18]結果一致。NGS可對病原體進行分子診斷，與腦脊液病原菌培養(yǎng)相比，診斷時間也顯著縮短，這為早期診斷和治療創(chuàng)造條件，有助于改善患兒預后。目前有關NGS在結核性腦膜炎診療中的專項報道還較為少見，本研究顯示NGS診斷結核性腦膜炎的敏感度、特異度及準確度均低于65.00%，提示NGS診斷結核性腦膜炎的價值有限，這可能是因在提取腦脊液上清液標本過程中，大量胞內(nèi)寄生的結核分枝桿菌被遺漏有關[19]。這說明NGS可能作為結核性腦膜炎的輔助檢查手段。

但NGS需要檢測醫(yī)師具備一定專業(yè)技能和知識。另外，人源性核酸和共存微生物核酸數(shù)量較大，可影響致病菌在提取核酸中的比例，進而降低NGS的敏感度[20]。因而，減少外源性污染可能有助于提高NGS的應用價值。有學者提出宏基因組NGS技術，以縮短檢測時間，提高病原體檢測敏感度，但該技術在人源性序列干擾、定植及致病菌鑒別方面缺乏標準化依據(jù)[21]，這可稱為NGS未來發(fā)展方向。

綜上所述，NGS對診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病具有重要價值，尤其是對于化膿性腦膜炎和隱球菌性腦膜炎，診斷準確度高。