低溫脅迫下不同咖啡生理生化指標(biāo)的變化及耐寒性評價

黃麗芳 李金芹 龍宇宙 董云萍 王曉陽 林興軍 孫燕 陳鵬 閆林

摘? 要：以咖啡主栽品種大粒種、中粒種和小粒種咖啡為材料，進(jìn)行8 ℃低溫脅迫，研究其在脅迫條件下植株的傷害情況和生理生化指標(biāo)變化，并利用隸屬函數(shù)法對3種咖啡進(jìn)行綜合評價。結(jié)果表明：低溫脅迫條件下，3種咖啡葉片受害程度差異顯著，小粒種咖啡比大粒種和中粒種咖啡具有明顯的耐寒表型;小粒種咖啡的可溶性糖和可溶性蛋白含量在脅迫72 h時，較大粒種和中粒種的高。3種咖啡的抗氧化酶變化趨勢都是先升后降，大粒種和中粒種咖啡的抗氧化酶在各處理間都處于較低的水平，小粒種咖啡在脅迫48、72 h時仍表現(xiàn)活躍;咖啡的丙二醛和相對電導(dǎo)率的變化幅度與其抗寒性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。通過隸屬函數(shù)法綜合評價，3種咖啡抗寒性由強(qiáng)到弱排序依次為：小粒種>大粒種>中粒種。

關(guān)鍵詞：咖啡;抗寒性;生理生化;隸屬函數(shù)法

中圖分類號：S571.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Changes of Physiological， Biochemical and Evaluation of Cold Tole-rance in Coffea

HUANG Lifang1， LI Jinqin2， LONG Yuzhou1， DONG Yunping1， WANG Xiaoyang1， LIN Xingjun1， SUN Yan1， CHEN Peng1， YAN Lin1*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 2. College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665099， China

Abstract： Coffea liberica， Coffea canephora and Coffea arabica， treated with 8 ℃， were used to study the leaf physiological responses， and the cold tolerance of the cultivars was comprehensively evaluated using membership function. Under low temperature stress， C. arabica showed stronger cold-tolerance than C. liberica and C. canephora， and the damage degree of the leaves was significant. The content of soluble sugar and protein of C. arabica was higer than of that of C. liberica and C. canephora under 8 ℃ for 72 h. The antioxidant enzymes of the cultivars increased first and then decreased. The antioxidant enzymes of C. liberica and C. canephora were in a low level among all treatments， while that of C. arabica was still active under 48 and 72 h stress. Malondialdehyde and relative electrical conductivity was negatively correlated with cold resistance.The Evaluation on the cold tolerance of the cultivars was in the order C. arabica>C. liberica>C. canephora.

Keywords： coffea; cold resistance; physiology and biochemistry; subordinate function （SF）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.017

咖啡起源于非洲中北部熱帶亞熱帶地區(qū)，為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木，為世界三大飲料作物（咖啡、茶葉、可可）之一?？Х葘儆?24種，其中商業(yè)栽培的主要有阿拉比卡咖啡（Coffea arabica L.，俗稱小粒種咖啡）、羅布斯塔咖啡（Coffea Canephora Pierre，俗稱中粒種咖啡）和利比利卡咖啡（C. liberica Bull ex Hiern，俗稱大粒種咖啡）?？Х雀缓扇苄缘鞍住⒅?、蛋白質(zhì)、糖類、天然物質(zhì)和天然解毒物，研究發(fā)現(xiàn)咖啡主要成分咖啡因、綠原酸、阿魏酸等，有阻止因高脂食物導(dǎo)致的體重增加、記憶障礙認(rèn)知損傷[1]、預(yù)防老年癡呆阻止細(xì)胞死亡[2]和有效抵抗抑郁癥[3]的功效?？Х葮浞N植2～3年左右就會有一定的收獲，管理成本較低，總體產(chǎn)值高[4]，是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一，在國內(nèi)具有不可替代的特色和優(yōu)勢，對促進(jìn)熱區(qū)政府稅收、企業(yè)增效和農(nóng)民增收發(fā)揮著重要的作用[5]。

溫度是限制植物生長發(fā)育的主要因素之一，也是限制咖啡向高緯度、高海拔推廣的主要限制因子。較高海拔種植的咖啡樹病蟲害輕，咖啡果發(fā)育期變長，咖啡品質(zhì)提高[6-7]，但高海拔地區(qū)霜凍時有發(fā)生，咖啡樹易受寒害?？Х冗m宜生長在平均溫度18 ℃～25 ℃氣候環(huán)境下，最適宜花芽發(fā)育溫度為16 ℃～20 ℃，氣溫過低不利于開花或授粉，氣溫過高不利于正常開花，花量少進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果少[8-9]。目前關(guān)于煙草[10]、玉米[11]、茶樹[12]等的抗寒性研究相繼報道，但是咖啡抗寒方面的研究卻很少，也沒有選育出高抗寒性的咖啡品種，抑制了咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[13]。國外主要從種質(zhì)資源的生理生化方面進(jìn)行了初步的抗寒鑒定。Ramalho等[14-15]研究了冷脅迫條件下不同基因型咖啡的礦物質(zhì)含量動態(tài)變化，以及不同冷脅迫時期咖啡植株的氧化應(yīng)激反應(yīng)等。Fortunato等[16]以小粒種和中粒種以及2份雜交種的咖啡苗為材料，研究了在冷條件下抗氧化系統(tǒng)的生物化學(xué)及分子特性，結(jié)果表明，中小粒種雜交種的冷馴化能力最強(qiáng)，小粒種次之。國內(nèi)學(xué)者研究了咖啡在受寒時的防寒御寒措施，以及寒害后的防治方法[17-19]。然而，關(guān)于咖啡種質(zhì)資源抗寒性鑒定，低溫脅迫對咖啡苗生理生化的影響尚未見報道。因此，本研究選取生產(chǎn)上常見的3個不同種的咖啡作為試材，研究其在低溫脅迫下生理生化指標(biāo)的變化，利用隸屬函數(shù)法綜合評價其抗寒性，為咖啡抗寒品種的選擇提供理論依據(jù)，也為進(jìn)一步探索咖啡的抗寒機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為1年生大粒種、中粒種和小粒種3種咖啡苗，株高50.0～60.0 cm，莖粗約1.0 cm，分枝對數(shù)2對。小粒種咖啡為云南省主栽品種‘卡蒂姆（CIFC7963），中粒種咖啡為海南省主栽品種‘熱研4號咖啡，大粒種咖啡為‘大韓，材料均來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，材料統(tǒng)一栽植在泥炭土和沙土混合基質(zhì)的塑料盆中，選取生長正常，無病蟲害和機(jī)械損傷的苗木放入人工培養(yǎng)箱中，每種咖啡各選取15株，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)5株，進(jìn)行低溫脅迫處理。

1.2? 方法

試驗(yàn)設(shè)置8 ℃低溫脅迫處理，以25 ℃為對照（CK），光照強(qiáng)度為10 000 lx，光周期為晝夜12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。分別在脅迫12、24、36、48、72 h時采集葉片并迅速置于液氮中冷凍，–80 ℃冰箱保存，用于測定葉片生理指標(biāo);各處理3次重復(fù)。

生理指標(biāo)測定：采用南京建成生物技術(shù)研究所測定試劑盒分別測定葉片的過氧化物酶（POD）、總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛（MDA）含量等生理生化指標(biāo)，具體操作參照說明書，每個處理測定3次重復(fù)。

相對電導(dǎo)率測定：選擇8 ℃處理0、24、48、72 h后的第三或第四片完全展開葉片，避開主脈剪成0.2 cm長寬的碎片，稱取0.2 g碎片加入20 mL去離子水，抽真空，放入三角瓶中并蓋上封口膜，在室溫下振蕩8 h，振蕩頻率80 r/h。采用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定浸泡液的電導(dǎo)率R1，再將盛有浸泡液的三角瓶置于沸水浴30 min，冷卻至室溫，再測定浸泡液的電導(dǎo)率R2，3次重復(fù)。相對電導(dǎo)率按以下公式計算：

相對電導(dǎo)率R=（R1/R2）×100%。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，生理生化指標(biāo)用LSD法進(jìn)行多重比較。采用模糊綜合評判方法中的隸屬度公式綜合評價不同咖啡品種的抗寒性。參照陳明輝等[20]和何雪銀等[21]的方法計算隸屬函數(shù)值和平均隸屬度，分析評價不同咖啡品種抗寒性。其中，與抗寒性呈正相關(guān)指標(biāo)用公式（1）計算，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)指標(biāo)用公式（2）計算：

隸屬函數(shù)=（Xi–Xmin）/（Xmax–Xmin）??? （1）

反隸屬函數(shù)=1–（Xi–Xmin）/（Xmax–Xmin）?? （2）

公式中，Xi為指標(biāo)測定值，Xmin、Xmax為該指標(biāo)內(nèi)的最小值和最大值。隸屬函數(shù)平均隸屬度值越大，則抗寒性越強(qiáng)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 低溫脅迫對咖啡葉片表型的影響

由圖1可以看出，通過觀察咖啡葉片的寒害表型發(fā)現(xiàn)，8 ℃低溫處理對不同咖啡品種葉片具

有差異性，在處理12 h時3種品種咖啡葉片受害較輕，主要表現(xiàn)為葉片輕度受害，出現(xiàn)萎焉性狀，大粒種葉片在處理24 h時受害較其他2個品種要嚴(yán)重，其葉片局部變褐;處理36 h時，大粒種咖啡和小粒種咖啡葉肉組織輕微褐化，中粒種葉片從主脈附近變褐，葉片輕度失水;處理48 h和72 h時，大粒種葉片褐化程度加重、葉片嚴(yán)重失水，出現(xiàn)卷曲、發(fā)黃;中粒種咖啡從80%的葉片褐化到整片褐化，失水嚴(yán)重，變干;小粒種咖啡葉片60%中度褐化，輕微的失水。從8 ℃處理對3種咖啡葉片的表型可以看出小粒種咖啡葉片受害較輕，中粒種和大粒種咖啡葉片受害較重。

2.2? 低溫脅迫對咖啡葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2A可知，經(jīng)8 ℃低溫脅迫后，3種咖啡品種葉片Pro含量均顯著性升高，隨著低溫脅迫

時間的延長其變化趨勢和幅度均不相同，大粒種和中粒種咖啡Pro含量的變化趨勢是先升后降，均在48 h時達(dá)到393.17和228.79的峰值，與CK相比，差異均達(dá)顯著（P<0.05），而小粒種咖啡的變化趨勢為持續(xù)升高，處理組均與CK差異顯著（P<0.05）;在處理72 h時，3個品種較CK相比分別增加了1.36、1.29和0.58倍，可以看出，大粒種和中粒種在受到脅迫后會產(chǎn)生大量的Pro來平衡細(xì)胞代謝，但隨著時間的延長，植物受害較為嚴(yán)重，導(dǎo)致Pro含量的合成受到影響。

低溫脅迫對3種咖啡葉片可溶性糖含量的測定結(jié)果見圖2B，隨著8 ℃處理時間的延長，3種咖啡的可溶性糖含量均呈上升趨勢，在72 h時達(dá)到最大值，與CK相比均呈顯著狀態(tài)（P<0.05）。從3種咖啡的可溶性糖含量的上升幅度中可以看出，小粒種咖啡在遇到低溫脅迫后，能夠產(chǎn)生較多的糖來提高葉片細(xì)胞液的滲透濃度從而起到降低冰點(diǎn)提高抗寒性的作用。大粒種和中粒種咖啡在處理12 h和24 h時與CK差異不顯著，說明在低溫脅迫過程中，這2種咖啡合成可溶性糖的速度較慢，使得植株受害較為嚴(yán)重;大粒種、中粒種和小粒種咖啡在8 ℃處理72 h的可溶性糖含量較CK相比，分別上升了67.55%、34.42%和126.23%，說明小粒種咖啡具有較強(qiáng)的抗寒性。

圖2C可溶性蛋白含量變化表明，3種咖啡在低溫脅迫過程中的可溶性蛋白含量趨勢的變化趨勢相同，均是先下降后上升再下降，處理12 h時都為最低值，大粒種和中粒種在48 h時達(dá)第二峰值，小粒種在36 h時達(dá)到第二峰值，說明此時對3種咖啡造成嚴(yán)重脅迫，超過咖啡葉片可溶性蛋白含量的調(diào)節(jié)能力;大粒種48 h與CK差異顯著（P<0.05），中粒種和小粒種咖啡的第二峰值與CK差異不顯著，而處理72 h時較CK相比差異均達(dá)顯著（P<0.05），分別降低了23.73%、25.96%和25.05%。

2.3? 低溫脅迫對咖啡葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3A可知，8 ℃低溫脅迫下POD活性變化可以看出，3種咖啡的變化趨勢和變化幅度不同。隨著低溫處理時間的延長，小粒種咖啡的POD活性急劇增加，在24 h時達(dá)峰值0.63（U/m），顯著高于CK（P<0.05），比CK提高了1.16倍，大粒種和中粒種咖啡也在24 h時出現(xiàn)峰值，分別比CK提高了0.49、0.57倍，大粒種低溫處理24 h時較72 h相比呈顯著差異（P<0.05），中粒種咖啡低溫處理組較CK相比均未達(dá)顯著差異。

從圖3B可以看出，在8 ℃低溫處理下，隨著脅迫時間的延長，3種咖啡的SOD活性較對照CK相比均有不同程度的增加，其變化趨勢均是先升后降，且都在48 h時達(dá)到峰值;在低溫脅迫處理時間延長的情況下，中粒種咖啡的變化幅度較大，低溫處理組均顯著高于CK（P<0.05）;小粒種咖啡的變化幅度次之，在低溫處理48 h時，SOD含量最高，為3.60 U/mg，與CK達(dá)顯著差異（P<0.05）;大粒種咖啡的變化幅度最小，處理之間差異均不顯著。大粒種、中粒種和小粒種SOD活性在低溫處理72 h時，較CK相比分別提高了16.80%、415.59%和25.82%。

由圖3C可知，在低溫處理中，3種咖啡葉片CAT活性均呈先升后降的趨勢，大粒種咖啡上升幅度比較大，而中粒種咖啡上升幅度最小。從CAT活性變化中可知，大粒種、中粒種和小粒種咖啡分別在36 h、24 h和48 h時達(dá)到峰值，且均顯著高于CK（P<0.05），中粒種的峰值較為往前，在低溫脅迫后中粒種咖啡產(chǎn)生了大量的CAT來分解低溫過程中所產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2），隨著低溫處理時間的延長，H2O2的產(chǎn)生速度超過了中粒種咖啡CAT的合成速度，因此導(dǎo)致CAT活性降低，說明中粒種咖啡的抗寒性相對較弱。小粒種咖啡在低溫處理72 h時與CK差異達(dá)顯著（P<0.05），其他2種咖啡差異均不顯著（P< 0.05）。

2.4? 低溫脅迫對咖啡葉片細(xì)胞膜的影響

由圖4A可知，經(jīng)過8 ℃低溫脅迫后，3種咖啡葉片MDA含量呈持續(xù)上升趨勢，其中大粒種咖啡的MDA含量變化幅度比中粒種和小粒種的

變化幅度大，大粒種和中粒種咖啡的所有低溫處

理均顯著高于CK（P<0.05），低溫處理72 h與CK相比，大粒種、中粒種和小粒種分別增加了177.78%、113.40%和76.52%，從上升幅度中可以看出，在8 ℃低溫處理下，大粒種咖啡受害情況較為嚴(yán)重，MDA積累較為嚴(yán)重。

相對電導(dǎo)率是反映咖啡葉片在逆境條件下細(xì)胞原生質(zhì)膜透性的重要指標(biāo)。由圖4B可知，隨著低溫脅迫處理時間的延長，3種咖啡葉片的相對電導(dǎo)率均有不同程度的上升，在處理24 h時，大粒種和中粒種咖啡的增加幅度較大，相對電導(dǎo)率的值為84.57%和67.38%，比CK分別升高了94.55%和101.53%，小粒種的變化幅度較小，比CK升高了17.74%;3種咖啡低溫處理72 h的相對電導(dǎo)率與CK差異顯著（P<0.05），分別增加了177.68%、170.07%和198.99%。

2.5? 應(yīng)用隸屬函數(shù)法對3種咖啡抗寒性的綜合評價

MDA含量和相對電導(dǎo)率對咖啡品種抗寒性起到反向作用，其值越高，抗寒性越低，用反隸屬函數(shù)法，而其他指標(biāo)對咖啡抗寒起正向作用。采用隸屬函數(shù)法，3種咖啡抗寒指標(biāo)的平均隸屬度，小粒種咖啡的最高為0.54，說明小粒種咖啡的抗寒性較強(qiáng)，大粒種和中粒種咖啡為0.30和0.28，說明這2種咖啡的抗寒性相近，都較弱?？购跃C合評價：為小粒種>大粒種>中粒種。

3? 討論

脯氨酸（Pro）作為植物細(xì)胞體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抵抗低溫脅迫時主要起了平衡細(xì)胞代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)水合，維持細(xì)胞運(yùn)輸，調(diào)節(jié)滲透壓等作用[22]。在8 ℃低溫過程中，3種咖啡的Pro含量顯著上升，其中大粒種和中粒種72 h處理較48 h處理Pro含量略微下降，說明在受到脅迫后會產(chǎn)生大量的Pro來平衡細(xì)胞代謝，但隨著時間的延長，植物受害較為嚴(yán)重，導(dǎo)致Pro含量的合成受到影響。小粒種咖啡的Pro含量持續(xù)上升，處理間差異達(dá)到顯著水平，說明小粒種咖啡滲透調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，很大程度的抵御脅迫所帶來的危害?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍资怯绊懼参锛?xì)胞滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，在低溫脅迫過程中，可溶性糖和可溶性蛋白含量可以增強(qiáng)細(xì)胞保水能力，非結(jié)冰水增加，在一定程度上可抵抗低溫對細(xì)胞造成的損傷[23-24];本研究中3種咖啡的可溶性蛋白和可溶性糖含量均有不同程度的上升，隨著處理時間的延長含量越來越高，表明咖啡進(jìn)行了蛋白質(zhì)合成和可溶性糖含量的積累來抵御脅迫，其中可溶性蛋白的變化趨勢是降-升-降，說明隨著處理時間的延長，該物質(zhì)含量降低，細(xì)胞滲透率升高，造成咖啡植株失水。

低溫脅迫下植物會產(chǎn)生能夠破壞細(xì)胞成分如蛋白質(zhì)、脂類、膜、核酸等的活性氧[25]，植株會通過產(chǎn)生POD、SOD、CAT等低分子量抗氧化酶，使得氧自由基維持在一個穩(wěn)定的水平上，從而阻止活性氧對植物的傷害。本試驗(yàn)中，經(jīng)過低溫脅迫處理后，3種咖啡葉片的POD、SOD、CAT活性呈先升后降趨勢，說明低溫誘導(dǎo)咖啡抗氧化酶活性的提高，從而緩解低溫帶來的損害，但隨著脅迫作用的不斷增強(qiáng)，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，酶活性下降，膜脂過氧化程度加大[26]。與POD和CAT相比，咖啡SOD防御系統(tǒng)低溫耐受時間更長，在低溫過程中，3種咖啡的SOD活性均在處理48 h時達(dá)到峰值，POD活性及中粒種咖啡CAT活性在24 h時達(dá)到峰值，中粒種的POD和CAT活性峰值較為往前，說明在低溫脅迫前期中粒種咖啡產(chǎn)生了大量的保護(hù)酶來抵抗低溫所帶來的影響，隨著時間的延長，保護(hù)酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活性降低，這也說明中粒種咖啡的抗寒性相對較弱。

在逆境條件中植物器官會破壞細(xì)胞膜的組成物質(zhì)和導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，相對電導(dǎo)率升高，生理代謝功能紊亂，發(fā)生膜脂過氧化[27]。丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量累積可作為植物受傷害的程度。本研究中通過相對電導(dǎo)率和MDA兩個指標(biāo)來反映葉片受寒害程度。在8 ℃低溫處理下，隨著處理時間的延長，MDA含量呈顯著性上升，在處理24 h時，大粒種和中粒種相對電導(dǎo)率增加幅度較大，這與劉英等[28]和孫凌霄等[29]的研究結(jié)果一致;在觀察咖啡葉片的寒害表型發(fā)現(xiàn)，小粒種植株受寒程度明顯低于另外2種咖啡，而此時MDA含量變化幅度較小;大粒種和中粒種MDA含量變化較大，其葉片變褐、失水嚴(yán)重，說明MDA含量能夠明顯呈現(xiàn)出植株受害情況，大粒種和中粒種葉片受害程度較小粒種咖啡嚴(yán)重。

在低溫脅迫過程中，3種咖啡的抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等均有較顯著的差別，抗寒性較弱的大粒種和中粒種咖啡隨著低溫脅迫持續(xù)進(jìn)行，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，植株的抗氧化酶系統(tǒng)和代謝失活，植株抗寒性表現(xiàn)出明顯降低趨勢。本研究得出的咖啡抗寒性滲透物質(zhì)含量、抗氧化酶活性、丙二醛及相對電導(dǎo)率變化應(yīng)答規(guī)律，以及利用隸屬函數(shù)法綜合評價咖啡的抗寒性，為后續(xù)開展咖啡抗寒品種的培育及抗寒基因的挖掘等提供可靠的依據(jù)。

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