• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    非洲菊PR-1基因的克隆與表達(dá)分析

    2021-08-26 08:58:41李乾玉王秀美倪珊珊王樂張舒婷夏朝水葉煒陳裕坤賴鐘雄
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:基因克隆根腐病激素

    李乾玉 王秀美 倪珊珊 王樂 張舒婷 夏朝水 葉煒 陳裕坤 賴鐘雄

    摘? 要:以非洲菊‘G088為材料,基于本研究所測(cè)序得到的非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRA: SRR9937065)的基礎(chǔ)上,采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得2個(gè)病程相關(guān)蛋白1(PR-1)基因,分別命名為GjPR-1-like1和GjPR-1-like2(GenBank登錄號(hào):MW057342和MW057343),GjPR-1-like1和GjPR-1-like2編碼序列長(zhǎng)度分別為534 bp和489 bp,可編碼177和162個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明,GjPR-1-like1屬于堿性不穩(wěn)定性蛋白,GjPR-1-like2屬于弱酸性穩(wěn)定蛋白;它們編碼的蛋白質(zhì)均含有CAP_PR-1和CAP superfamily保守結(jié)構(gòu)域,屬于富含半胱氨酸超家族蛋白,含有信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn);亞細(xì)胞定位表明均位于液泡中。PR-1基因在不同組織(葉、葉柄和根)、不同激素與逆境(SA、MeJA、ABA、NaCl)以及根腐病病原菌處理非洲菊的表達(dá)模式分析結(jié)果表明,GjPR-1-like1和GjPR-1-like2均在葉片中表達(dá)水平最高,在SA、MeJA、ABA和NaCl脅迫以及根腐病病原菌處理下,均顯著影響GjPR-1-like1和GjPR-1-like2的表達(dá)水平。研究表明,GjPR-1-like1和GjPR-1-like2可能參與調(diào)控非洲菊生長(zhǎng)發(fā)育過程,尤其是葉片的發(fā)育過程;且可能參與了非洲菊生物及非生物脅迫過程,尤其在響應(yīng)非洲菊根腐病的抗病防御過程中發(fā)揮了一定的作用。

    關(guān)鍵詞:非洲菊;病程相關(guān)蛋白1;基因克隆;激素;根腐病

    中圖分類號(hào):Q949.783.5????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    Cloning and Expression Analysis of PR-1 Genes in Gerbera jamesonii

    LI Qianyu1, WANG Xiumei1, NI Shanshan1, WANG Le1, ZHANG Shuting1, XIA Chaoshui2, YE Wei2, CHEN Yukun1*, LAI Zhongxiong1*

    1. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Sanming Academy of Agricultural Sciences, Sanming, Fujian 365000, China

    Abstract: In this study, based on the transcriptome database of Gerbera jamesonii (SRA: SRR9937065), we successfully cloned two PR-1 genes, named as GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 (GenBank accession number: MW057342 and MW057343), from G. jamesonii cv.‘G088 using the RT-PCR method. The coding sequence of GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 was 534 bp and 489 bp, encoding 177 and 162 amino acids. Bioinformatics analysis indicated that GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 were belonged to the basic unstable protein and acid stable protein; all the two GjPR-1s possessed CAP_PR-1 and CAP superfamily conserved domain, belonged to cysteine-rich secretory super family proteins and contained signal peptide, transmembrane structure and phosphorylation sites; subcellular localization indicated that they both located in the vacuole. The expression patterns of PR-1 in different tissues (including leaf, petiole and root), and under different adversity stresses (including SA, MeJA, ABA, NaCl treatments) and Phytophthora cryptogea treatments in Gerbera transplant seedlings, the results showed that both GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 showed the highest expression level in the leaf. Under stress conditions of SA, MeJA, ABA, NaCl treatments and P. cryptogea treatments, the expression level of GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 were significantly changed. GjPR-1-like1 and GjPR-1-like2 may participate in the regulation of the growth and development process of G. jamesonii particularly in leaf development, and were concerned with biotic stresses and abiotic stresses, especially play a certain role in the process of disease resistance and defense in response to the gerbera P. cryptogea interaction.

    Keywords: Gerbera jamesonii; pathogenesis-related protein 1; gene clone; hormone; Phytophthora cryptogea

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.006

    植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程中會(huì)面臨多種病毒、真菌以及外界脅迫的侵襲。為了保護(hù)自己免受侵襲,植物細(xì)胞壁硬化并產(chǎn)生抗菌化合物(植物抗毒素)和抗菌蛋白[1-2],啟動(dòng)體內(nèi)的防御機(jī)制。植物病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)是植物在受病原菌侵染過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的[3],在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)PRs蛋白家族的類型及特性主要?dú)w納為17個(gè)家族[4-5],其中PR-1家族是PRs家族中重要的多基因家族,屬于富含半胱氨酸的分泌蛋白、抗原5和病程相關(guān)蛋白1超家族(CAP superfamily)[6],并且進(jìn)化上高度保守。PR-1基因通常被認(rèn)為是植物抗病性和系統(tǒng)獲得性抗性的標(biāo)志基因[7-8],能夠參與植物防御病原菌攻擊的過程[9]。某些PR-1蛋白的防御功能通過在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)已得到證實(shí),如過表達(dá)PR-1會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)真菌[10]、卵菌[11]和細(xì)菌[12-13]的抗性,但對(duì)病毒的抗性沒有增加[14]。對(duì)于多基因家族PR-1蛋白的研究表明,并不是所有PR-1基因都能夠表現(xiàn)出一定的抗病性。番茄中與PR-1家族相關(guān)的3種不同的堿性14 kDa蛋白質(zhì)P14a、P14b和P14c在體外和體內(nèi)條件下均顯示出抗真菌活性[15],而在蘋果中轉(zhuǎn)入PR-1a、PR-1b和PR-1c后,蘋果幼苗并未表現(xiàn)出抗病特性[16]。PR-1蛋白除具有抗病功能以外,在植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)激素誘導(dǎo)和非生物逆境脅迫等過程也發(fā)揮著重要作用。例如,PR-1蛋白被證明主要在成花植物衰老的葉子中[17]以及在正在發(fā)育的花的萼片中積累[18]。研究發(fā)現(xiàn)水稻OsPR1a和OsPR1b基因不僅響應(yīng)茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、過氧化氫(H2O2)和稻瘟病菌(Magnapor theoryzae)等的誘導(dǎo),還能夠響應(yīng)化學(xué)試劑和環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)[19-21]。番茄PR-1家族在干旱脅迫下所有成員均上調(diào)表達(dá),表明SlPR-1基因積極響應(yīng)干旱脅迫并發(fā)揮了一定作用[22]。綜上所述,PR-1基因不僅能增強(qiáng)多種植物的抗病性,還能提高抵御生物或非生物脅迫的能力,具有重要的研究意義。

    非洲菊(Gerbera jamesonii)是多年生的草本花卉,屬菊科(Compositae)大丁草屬(Gerbera)。因花朵大、顏色艷麗等特點(diǎn)深受人們喜愛,但是隨著其種植面積的擴(kuò)大和管理粗放,病蟲害問題也日益凸顯。研究表明根腐病是影響非洲菊生長(zhǎng)的重要病害之一[23],因此,研究非洲菊抗病相關(guān)基因有助于進(jìn)一步解決非洲菊抗病機(jī)理的相關(guān)難題,對(duì)非洲菊根腐病防治策略的選擇有重要意義。本研究以非洲菊‘G088移栽苗為材料,結(jié)合本研究所的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,對(duì)非洲菊2個(gè)PR-1基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析,采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)在不同組織、不同激素、不同逆境處理和隱地疫霉菌處理下非洲菊PR-1基因的表達(dá)水平,以期為非洲菊抗病機(jī)制的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    實(shí)驗(yàn)所用‘G088非洲菊移栽苗由福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院夏朝水提供。非洲菊根腐病病原菌隱地疫霉由本實(shí)驗(yàn)室從非洲菊病株分離鑒定[24]。

    非洲菊不同處理試驗(yàn)方法如下:(1)分別取同一株非洲菊根、莖和葉片,備用。(2)水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脫落酸(ABA)處理:分別使用5 mmol/L的SA、100 μmol/L的MeJA和100 μmol/L的ABA溶液噴施于非洲菊葉片,直至葉片滴水,于處理后0、6、12、24、48、72 h取葉片。(3)鹽脅迫處理:使用200 μmol/L的NaCl溶液一次性澆灌移栽苗,于處理后0、4、8、12、48 h取葉片。(4)根腐病菌接種非洲菊:參考郝向陽等[25]的方法,將非洲菊移栽苗置于隱地疫霉菌液中2 h后移栽,并于處理后0、2、4、6 d取根系。所有處理材料取樣后均置于液氮中,存放于?80 ℃冰箱中備用。

    1.2? 方法

    1.2.1? 總RNA的提取及cDNA合成? 采用Trizol試劑盒提取非洲菊根、葉柄和葉片的總RNA,使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及吸光值(OD值),以O(shè)D500nm值1.8~2.0為最佳。參照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈用于PCR擴(kuò)增;參照TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成不同處理樣品的cDNA用于qRT-PCR反應(yīng)。

    1.2.2? 基因克隆? 利用本實(shí)驗(yàn)室非洲菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),通過轉(zhuǎn)錄組NT、NR和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)鍵詞“Pathogenesis-related protein 1”的檢索,獲得2條PR-1基因序列c33369_g1和c40036_g1,并設(shè)計(jì)用于基因PCR擴(kuò)增的引物(表1)。以非洲菊‘G088葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增獲得目的條帶后,使用Gel/PCR Extraction Kit試劑盒進(jìn)行膠產(chǎn)物回收,pMD18-T載體連接目的片段后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α的轉(zhuǎn)化,隨后挑選陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.3? 生物信息學(xué)分析? 使用在線軟件對(duì)克隆的2個(gè)PR-1基因編碼蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析(Expasy,https://web.expasy.org/protparam/)、保守結(jié)構(gòu)域分析(CDD,https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/cdd.shtml)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)(SignalP 5.0 Server,http://www.cbs.dtu.dk/ser?vi?ces/SignalP/)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(Plant-mPLoc Server,http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant- multi/#)、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(TMpred,http://www.cbs. dtu.dk/ services/TMHMM/)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(NetPhos 3.1 Sever,http://www.cbs.dtu.dk/serv?ices/Net?Phos/)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(SOPMA,https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma. pl)。通過在線網(wǎng)站NCBI分析2個(gè)非洲菊PR-1基因的氨基酸序列;從TAIR下載擬南芥、萵苣、葡萄等14種物種的PR-1蛋白序列,其次利用在線網(wǎng)站NCBI Blastp比對(duì)并下載與非洲菊PR-1高度同源的12個(gè)不同物種的PR-1蛋白序列,利用MEGA-X軟件,使用鄰近法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.2.4? 非洲菊PR-1基因熒光定量表達(dá)分析? 參照郝向陽等[25]的方法,以非洲菊18sRNA為內(nèi)參基因,以克隆獲得的序列設(shè)計(jì)qRT-PCR的上、下游引物(表1),采用羅氏480(Light?Cycler480)儀器進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)程序設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù),檢測(cè)不同處理下兩個(gè)PR-1基因在非洲菊中的表達(dá)情況。相對(duì)表達(dá)量用2?CT法計(jì)算得出,并使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、SPSS 24.0軟件的Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)及Graphpad軟件進(jìn)行繪圖。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 非洲菊PR-1基因克隆

    以非洲菊cDNA為模板,利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳結(jié)果顯示(圖1),在500 bp

    左右處均有1條清晰的條帶,大小與預(yù)期結(jié)果一致,膠回收、TA克隆、挑取單克隆后進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN 6軟件,將測(cè)序獲得的2條PR-1基因序列分別與非洲菊轉(zhuǎn)錄組對(duì)應(yīng)的c33369_g1

    和c40036_g1基因序列比對(duì)分析,相似度分別達(dá)99.26%和98.98%,CDS長(zhǎng)度分別為534 bp和501 bp,預(yù)測(cè)可分別編碼177和162個(gè)氨基酸(圖2)。利用NCBI Blastn比對(duì)發(fā)現(xiàn),c33369_g1與大薊PR-1-like相似度最高,達(dá)到80.43%;c40036_g1與萵苣PR-1 type-like的相似度最高,達(dá)到80.90%,將c33369_g1和c40036_g1基因分別命名為GjPR-1-like1和GjPR-1-like2,GenBank登錄號(hào)分別為MW057342、MW057343。利用軟件DANMAN對(duì)擬南芥、水稻、番茄、向日葵和橡膠樹等5種植物PR-1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)(圖3),盡管不同植物PR-1蛋白的N末端氨基酸序列存在較大差異,但在其C末端氨基酸序列高度保守,均含有標(biāo)志PR-1家族的6個(gè)保守的半胱氨酸,且不同植物PR-1基因的長(zhǎng)度相差不大,進(jìn)一步表明了PR-1基因在進(jìn)化上的保守性。

    2.2? 生物信息學(xué)分析

    蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析表明,GjPR-1-like1蛋白分子式為C898H1371N263O239S12,蛋白分子量為20 060.10 Da,原子總數(shù)為2783,不穩(wěn)定系數(shù)53.03,脂肪指數(shù)62.94,等電點(diǎn)為10.15,平均親水系數(shù)為?0.356,屬于堿性不穩(wěn)定性蛋白。GjPR-1-like2蛋白分子式為C785H1176N222O239S10,蛋白分子量為17 867.92 Da,原子總數(shù)為2432,不穩(wěn)定系數(shù)22.86,脂肪指數(shù)71.67,等電點(diǎn)為5.60,平均親水系數(shù)為?0.301,屬于弱酸性穩(wěn)定蛋白。推測(cè)GjPR-1-like1和GjPR-1-like2均屬于親水性蛋白。GjPR-1-like1蛋白的甘氨酸(Gly)含量最高,達(dá)10.2%,其次是精氨酸(Arg)為9.6%;GjPR-1-like2蛋白的甘氨酸(Gly)含量最

    高,達(dá)10.2%,其次是精氨酸(Arg),為9.6%。

    由表2可知,GjPR-1-like1和GjPR-1-like2蛋白均有信號(hào)肽,GjPR-1-like1的信號(hào)肽序列在第1~26個(gè)氨基酸,GjPR-1-like2的信號(hào)肽序列在第1~23個(gè)氨基酸。蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GjPR-1-like1和GjPR-1-like均定位于液泡。GjPR-1-like1和GjPR-1-like2均有由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示,GjPR-1-like1共有13個(gè)磷酸位點(diǎn),GjPR-1-like2共有20個(gè)磷酸位點(diǎn)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GjPR-1-like1和GjPR-1-like2的主要組成原件均為α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲。

    保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)(圖4),GjPR-1- like1和GjPR-1-like2都包含1個(gè)CAP_PR-1結(jié)構(gòu)域,也包含1個(gè)CAP superfamily結(jié)構(gòu)域,2個(gè)非洲菊PR-1蛋白均屬于富含半胱氨酸超家族蛋白。對(duì)非洲菊GjPR-1-like1和GjPR-1-like2的motif預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),2個(gè)PR-1蛋白質(zhì)含有相同的9個(gè)motif,推測(cè)非洲菊PR-1可能存在功能冗余。

    系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖5),非洲菊GjPR-1-like1基因編碼的蛋白與擬南芥PR-1-like聚類在一起,GjPR-1-like2基因編碼的蛋白與煙草PRP-1聚類在一起;非洲菊PR-1與擬南芥PR-1親緣關(guān)系更近,而與水稻和玉米2種單子葉植物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),推測(cè)在生物學(xué)功能上有著一定聯(lián)系。

    2.3? GjPR-1-like1和GjPR-1-like2基因在不同組織的表達(dá)分析

    為明確2個(gè)PR-1基因在非洲菊不同組織的表達(dá)情況,采用熒光定量PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。由圖6A分析發(fā)現(xiàn),在非洲菊不同組織中GjPR-1- like1和GjPR-1-like2的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。GjPR-1-like1和GjPR-1-like2基因均在葉片中表達(dá)水平最高,葉柄次之,根最少。GjPR-1-like1在葉柄和根的表達(dá)量約為葉片中的70.82%和26.21%,GjPR-1-like2在葉柄和根的表達(dá)量約為葉片中的40.38%和15.29%。

    2.4? 非生物脅迫下GjPR-1-like1和GjPR-1-like2的表達(dá)情況

    SA處理下(圖6B),GjPR-1-like1和GjPR- 1-like2基因的表達(dá)受SA顯著誘導(dǎo),總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),且均高于對(duì)照組(0 h)的表達(dá)水平。GjPR-1-like1和GjPR-1-like2于處理后12 h表達(dá)量均達(dá)到峰值,分別約為對(duì)照組的6倍和7.8倍(P<0.05),隨后逐漸降低。

    MeJA處理下(圖6C),GjPR-1-like1和GjPR-1-like2基因的表達(dá)均受到促進(jìn)作用,但在響應(yīng)MeJA的時(shí)間上存在差異。GjPR-1-like1于處理后6 h表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的9.5 倍(P<0.05),后逐漸下降,總體呈現(xiàn)出逐漸降低趨勢(shì)。GjPR-1-like2于處理后12 h表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的5.3倍(P<0.05),總體呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)??梢?,GjPR-1-like1較GjPR-1-like2響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)表達(dá)更迅速。

    ABA處理下(圖6D),GjPR-1-like1的表達(dá)受到顯著促進(jìn),12 h表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的6.6倍(P<0.05)。GjPR-1-like2在6 h時(shí)表達(dá)受抑制,表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的62.86%,表達(dá)水平在處理12 h后開始回升,于24 h表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的5.73倍(P<0.05)。

    鹽脅迫條件下(圖6E),GjPR-1-like1在表達(dá)早期受抑制,于處理8 h后回升達(dá)到表達(dá)量峰值,約為對(duì)照組的2.15倍(P<0.05),隨后逐漸降低且24 h和48 h的表達(dá)量均低于對(duì)照組。GjPR-1-like2的表達(dá)總體呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),處理4 h和8 h的表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.65倍和1.52倍,之后表達(dá)水平顯著受到抑制作用且均低于對(duì)照組。

    2.5? 隱地疫霉處理下GjPR-1-like1和GjPR-1- like2的表達(dá)情況

    非洲菊接種根腐病病原菌隱地疫霉不同時(shí)間后,GjPR-1-like1和GjPR-1-like2基因的表達(dá)均受顯著誘導(dǎo)(圖6F),且表達(dá)量均高于對(duì)照組。GjPR-1-like1于處理2 d的表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的14.8倍(P<0.05),GjPR-1-like2于處理4 d的表達(dá)量達(dá)到峰值,約為對(duì)照組的31.5倍(P<0.05),GjPR-1-like1較GjPR-1-like2響應(yīng)隱地疫霉脅迫更迅速。以上結(jié)果說明GjPR-1-like1和GjPR-1-like2參與了非洲菊的抗病反應(yīng)過程。

    3? 討論

    近年來,PR-1基因已在多種植物中被克隆得到,如小麥[26]、玉米[27]、牡丹[28]、桑樹[29]和白菜[30]等,本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆得到2個(gè)非洲菊基因GjPR-1-like1和GjPR-1-like2,可分別編碼177和162個(gè)氨基酸,均含有標(biāo)志PR-1家族的6個(gè)保守的半胱氨酸,且經(jīng)同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),非洲菊GjPR-1-like1和GjPR-1-like2序列與擬南芥、番茄和單子葉植物水稻都高度同源,這些結(jié)果進(jìn)一步表明PR-1基因在不同植物中具有較高的保守性。本研究推測(cè)GjPR-1-like1蛋白為堿性,GjPR-1-like2蛋白為酸性,理論上PR-1家族中的堿性蛋白具有較強(qiáng)的抗真菌活性[5],如胡椒[31]中等電點(diǎn)約為8.5的堿性PR-1蛋白對(duì)病原體和生物逆境脅迫的抗性顯著增強(qiáng),而Niderman等[15]的研究表明番茄中的抗病PR-1蛋白是酸性蛋白。因此,不同物種中PR-1蛋白存在功能多樣性,PR-1蛋白的抗病特性不能僅依據(jù)pI值或序列同源性來判斷。

    PR-1基因在許多植物的不同組織及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)情況存在差異。如在水稻正常葉片生長(zhǎng)過程中PR-1家族蛋白分為苗期表達(dá)量最高及最低2種表達(dá)模式[32];在番茄根部和衰老葉片中SlPR-1基因的表達(dá)量相對(duì)較高,在莖、幼葉和成熟葉片中表達(dá)量相對(duì)較低[33]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),非洲菊GjPR-1-like1和GjPR-1-like2基因在葉片中表達(dá)量相對(duì)較高。侯麗霞等[34]研究表明的葡萄葉片中VvPR-1表達(dá)量最高。2個(gè)非洲菊PR-1基因表達(dá)的組織特異性,表明其可能參與調(diào)控非洲菊的生長(zhǎng)發(fā)育過程,在非洲菊葉片生長(zhǎng)或免疫防御過程中可能發(fā)揮比較重要的作用。

    PR-1是SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的SAR抗病機(jī)制的標(biāo)志基因[35],該基因不僅能夠響應(yīng)植物激素(SA、JA和ABA等)和鹽等多種非生物脅迫條件,還能夠被病原菌誘導(dǎo)表達(dá),在植物抗病防御過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),SA、JA和ABA均能誘導(dǎo)葡萄VvPR-1的表達(dá),且對(duì)于3種植物激素存在響應(yīng)速度的差異[34];Gao等[36]研究表明小麥PR-1基因能夠積極響應(yīng)乙烯(EH)、脫落酸(ABA)以及茉莉酸甲酯(MeJA)的誘導(dǎo)表達(dá);此外,在費(fèi)爾干豬毛菜研究中也同樣顯示出SfPR1a基因在脫落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前體(ACC)等相關(guān)激素脅迫及鹽處理下能夠被誘導(dǎo)表達(dá)[37]。以上研究結(jié)果均表明PR-1基因參與了植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示,在SA、MeJA、ABA和鹽脅迫條件下GjPR-1-like1和GjPR-1-like2確實(shí)能夠積極響應(yīng)表達(dá),這與許多植物PR-1基因積極響應(yīng)以上非生物脅迫的反應(yīng)一致[38],推測(cè)PR-1基因可能在不同信號(hào)途徑的復(fù)雜應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起到聯(lián)結(jié)作用,但不同植物的PR-1基因響應(yīng)植物激素和脅迫條件的表達(dá)模式存在一定差異,推測(cè)可能與PR基因參與不同調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

    在植物抗病方面,研究證實(shí)將PR1-a轉(zhuǎn)入煙草能顯著增強(qiáng)煙草對(duì)霜霉病菌和黑脛病菌的抗性[11];將辣椒CaBPR1在煙草中過表達(dá)后能增強(qiáng)煙草對(duì)多種病菌的抵抗能力[12];轉(zhuǎn)入桑樹MuPR1-2基因的擬南芥對(duì)灰霉菌有較強(qiáng)的抗性[29]。本研究中,用根腐病病原菌隱地疫霉接種非洲菊,發(fā)現(xiàn)GjPR-1-like1和GjPR-1-like2均受隱地疫霉顯著誘導(dǎo),分別在接種2 d和4 d時(shí)的表達(dá)量達(dá)峰值,GjPR-1-like1較GjPR-1-like2響應(yīng)隱地疫霉脅迫更迅速,說明它們均能響應(yīng)根腐病病原菌的誘導(dǎo)表達(dá),但這2個(gè)基因是否具有抗根腐病的功能,還需進(jìn)一步研究PR-1基因在非洲菊抗根腐病中的作用機(jī)制。

    綜合以上研究表明:GjPR-1-like1和GjPR-1- like2基因主要在葉片中表達(dá),可能參與調(diào)控非洲菊的生長(zhǎng)發(fā)育過程,其還能對(duì)植物激素SA、MeJA和ABA、鹽脅迫和隱地疫霉脅迫作出應(yīng)答,推測(cè)GjPR-1-like1和GjPR-1-like2可能參與了非洲菊生物及非生物脅迫過程,但在非洲菊抗逆抗病反應(yīng)中的具體功能與調(diào)控機(jī)制等需要進(jìn)一步研究,以期為PR-1基因在非洲菊抗病育種研究中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1]? Hammond-Kosack K E, Jones J D. Resistance gene- dependent plant defense responses[J]. Plant Cell, 1996, 8(10): 1773-1791.

    [2]? Yang Y, Shah J, Klessig D F. Signal perception and transduction in plant defense responses[J]. Genes and Deelopment, 1997, 11(13): 1621-1639.

    [3]? Van Loon L C, Rep M, Pieterse C M J. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants[J]. Annual Review of Phytopathology, 2006, 44: 135-162.

    [4]? Van Loon L C, Pierpoint W S, Boller T, et al. Recommendations for Naming plant pathogenesis-related proteins[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(3): 245-264.

    [5]? Van Loon L C, Van Strien E A. The family of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1999, 55(2): 85-97.

    [6]? Gibbs G M, Roelants K, Obryan M K. The CAP superfamily: cysteine-rich secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 proteins-roles in reproduction, cancer, and immune defense[J]. Endocrine Reviews, 2008, 29(7): 865-897.

    [7]? 牛吉山, 劉? 瑞, 鄭? 磊. 小麥PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)分析及白粉病抗性研究[J]. 麥類作物學(xué)報(bào), 2007, 27(6): 1132-1137.

    [8]? Xie X Z, Xue Y J, Zhou J J, et al. Phytochromes regulate SA and JA signaling pathways in rice and are required for developmentally controlled resistance to Magnaporthe grisea[J]. Molecular Plant, 2011, 4(4): 688-696.

    [9]? Seo P J, Lee A K, Xiang F N, et al. Molecular and functional profiling of Arabidopsis pathogenesis-related genes: Insights into their roles in salt response of seed germination[J]. Plant Cell Physiology, 2008, 49(3): 34-344.

    [10]????? Kiba A, Nishihara M, Nakatsuka T, et al. Pathogenesis-related protein 1 homologue is an antifungal protein in Wasabia japonica leaves and confers resistance to Botrytis cinerea in transgenic tobacco[J]. Plant Biotechnology, 2007, 24(2): 247-253.

    [11]????? Alexander D, Goodman R M, Gut-Rella M, et al. Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein 1a[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90(15): 7327-7331.

    [12]????? Sarowar S, Kim Y J, Kim E N, et al. Overexpression of a pepper basic pathogenesis-related protein 1 gene in tobacco plants enhances resistance to heavy metal and pathogen stresses[J]. Plant Cell Reports, 2005, 24(4): 216-224.

    [13]????? Shin S H, Pak J H, Kim M J, et al. An acidic PATHOGENESIS-RELATED1 gene of Oryza grandiglumis is involved in disease resistance response against bacterial infection[J]. Plant Pathology Journal, 2014, 30(2): 208-214.

    [14]????? Cutt J R, Harpster M H, Dixon D C, et al. Disease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis-related PR1b gene[J]. Virology, 1989, 173(1): 89-97.

    [15]????? Niderman T, Genetet I, Bruyère T, et al. Pathogenesis-related PR-1 proteins are antifungal. Isolation and characterization of three 14-kilodalton proteins of tomato and of a basic PR-1 of tobacco with inhibitory activity against Phytophthora infestans[J]. Plant Physiology, 1995, 108(1): 17-27.

    [16]????? Bonasera J M, Kim J F, Beer S V. PR genes of apple: identification and expression in response to elicitors and inoculation with Erwinia amylovora[J]. BMC Plant Biology, 2006, 6: 23.

    [17]????? Fraser R S S. Evidence for the occurrence of the “pathogenesis-related” proteins in leaves of healthy tobacco plants during flowering[J]. Physiological Plant Pathology, 1981, 19(1): 69-76.

    [18]????? Lotan T, Ori N, Fluhr R. Pathogenesis-related proteins are developmentally regulated in tobacco flowers[J]. Plant Cell, 1989, 1(9): 881-887.

    [19]????? Agrawal G K, Jwa N S, Rakwal R. A novel rice (Oryza sativa L.) acidic PR1 gene highly responsive to cut, phytohormones, and protein phosphatase inhibitors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2000, 274(1): 157-165.

    [20]????? Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S. Rice (Oryza sativa L.) OsPR1b gene is phytohormonally regulated in close interaction with light signals[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 278(2): 290-298.

    [21]????? Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S, et al. Signaling molecules and blast pathogen attack activates rice OsPR1a and OsPR1b genes: a model illustrating components participating during defence/stress response[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2001, 39(12): 1095-1103.

    [22]????? Akbudak M A, Yildiz S, Filiz E. Pathogenesis related protein-1 (PR-1) genes in tomato (Solanum lycopersicum L.): Bioinformatics analyses and expression profiles in response to drought stress[J]. Genomics, 2020, 112(6): 4089-4099.

    [23]????? 李? 越, 李? 凡, 劉云龍, 等. 云南非洲菊根腐病病原鑒定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(3): 21-24, 28.

    [24]????? 郝向陽, 林? 覓, 孫雪麗, 等. 福建非洲菊產(chǎn)區(qū)根腐病病原菌的分離與鑒定[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 33(4): 391-395.

    [25]????? 郝向陽, 孫雪麗, 劉? 范, 等. 非洲菊4個(gè)POD基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2018, 38(10): 1777-1786.

    [26]????? 高? 琳. 2個(gè)小麥PR蛋白基因的抗葉銹病相關(guān)性分析[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

    [27]????? 王? 靜, 劉? 麗, 張志明, 等. 玉米病程相關(guān)蛋白1基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2012, 38(1): 35-42.

    [28]????? 楊德翠, 張玉喜, 鄭國(guó)生. 牡丹病程相關(guān)蛋白1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2013, 40(8): 1583-1590.

    [29]????? 張華梁, 王? 紅, 劉? 琪, 等. 桑樹病程相關(guān)蛋白基因MuPR1-2的克隆及功能分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2015, 41(6): 979-988.

    [30]????? 王彥華, 侯喜林, 申書興. 白菜病程相關(guān)蛋白1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆與分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2006, 33(5): 985-988.

    [31]????? Kim Y, Hwang B K. Pepper gene encoding a basic pathogenesis-related 1 protein is pathogen and ethylene inducible[J]. Physiologia plantarum, 2000, 108(1): 51-60.

    [32]????? 李雪姣, 范? 偉, 牛東東, 等. 水稻病程相關(guān)PR1家族蛋白質(zhì)在葉片生長(zhǎng)及與白葉枯病菌互作反應(yīng)中的表達(dá)[J]. 植物學(xué)報(bào), 2014, 49(2): 127-138.

    [33]???? 胡宗利, 鄧? 磊, 姚? 楠, 等. 番茄PR-1和PR-5基因的表達(dá)特性分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 31(8): 67-72.

    [34]????? 侯麗霞, 高? 超, 車永梅, 等. 葡萄病程相關(guān)蛋白1基因的克隆和表達(dá)分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2012, 48(1): 57-62.

    [35]????? 趙淑清, 郭劍波. 植物系統(tǒng)性獲得抗性及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36(7): 781-787.

    [36]????? Gao L, Wang S, Li X Y, et al. Expression and functional analysis of a pathogenesis-related protein 1 gene, TcLr19-PR1, involved in wheat resistance against leaf rust fungus[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2015, 33(4): 797-805.

    [37]????? 衡友強(qiáng), 游西龍, 王? 艷. 費(fèi)爾干豬毛菜病程相關(guān)蛋白SfPR1a基因的異源表達(dá)增強(qiáng)了煙草對(duì)干旱、鹽及葉斑病的抗性[J]. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46(4): 503-512.

    [38]????? Wang L, Guo Z, Zhang Y, et al. Characterization of LhSorTGA2, a novel TGA2-like protein that interacts with LhSorNPR1 in oriental hybrid lily Sorbonne[J]. Botanical Studies, 2017, 58(1): 46.

    責(zé)任編輯:黃東杰

    猜你喜歡
    基因克隆根腐病激素
    番茄萎蔫膨果慢 當(dāng)心根腐病
    直面激素,正視它的好與壞
    寧波第二激素廠
    茴香根腐病 防治有辦法
    飼用南瓜根腐病的發(fā)生原因及防治措施
    絕經(jīng)治療,該怎么選擇激素藥物
    備孕需要查激素六項(xiàng)嗎
    三個(gè)小麥防御素基因的克隆及序列分析
    番茄根腐病的發(fā)生與防治
    上海蔬菜(2016年5期)2016-02-28 13:18:10
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達(dá)
    av天堂久久9| 国产精华一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线观看免费视频网站a站| 啦啦啦免费观看视频1| 色在线成人网| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男女午夜视频在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人舔女人的私密视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 动漫黄色视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲av熟女| 亚洲人成电影观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 91字幕亚洲| 精品国产亚洲在线| 妹子高潮喷水视频| 老汉色∧v一级毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 免费在线观看影片大全网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人三级黄色视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女大奶头视频| 亚洲第一av免费看| 成人三级黄色视频| 精品人妻在线不人妻| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 在线永久观看黄色视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄片小视频在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久久久精品吃奶| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人影院久久av| 男人的好看免费观看在线视频 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美成人午夜精品| 妹子高潮喷水视频| 亚洲专区中文字幕在线| 村上凉子中文字幕在线| 一a级毛片在线观看| 午夜免费观看网址| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 极品教师在线免费播放| 国产高清有码在线观看视频 | 国产高清videossex| 国产高清videossex| 99精品在免费线老司机午夜| 国产激情欧美一区二区| netflix在线观看网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 一级黄色大片毛片| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 免费在线观看影片大全网站| 午夜影院日韩av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品,欧美在线| www.999成人在线观看| 天堂动漫精品| 视频区欧美日本亚洲| 大陆偷拍与自拍| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲avbb在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 九色国产91popny在线| 中文字幕av电影在线播放| 一区二区三区国产精品乱码| 又黄又粗又硬又大视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 美女午夜性视频免费| 99在线人妻在线中文字幕| 制服丝袜大香蕉在线| 18禁美女被吸乳视频| 国产色视频综合| 十分钟在线观看高清视频www| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久久久久免费视频了| 久久精品国产综合久久久| 岛国在线观看网站| 不卡一级毛片| 男人舔女人的私密视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| x7x7x7水蜜桃| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产欧美网| 亚洲最大成人中文| 亚洲电影在线观看av| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色在线成人网| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品精品国产色婷婷| av超薄肉色丝袜交足视频| 在线观看日韩欧美| 精品日产1卡2卡| 欧美乱色亚洲激情| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲专区字幕在线| 日本黄色视频三级网站网址| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜免费观看网址| 亚洲九九香蕉| 长腿黑丝高跟| 大陆偷拍与自拍| 欧美在线一区亚洲| 亚洲七黄色美女视频| 久久久精品欧美日韩精品| www.999成人在线观看| 宅男免费午夜| 国产一卡二卡三卡精品| videosex国产| 性色av乱码一区二区三区2| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产欧美日韩一区二区精品| aaaaa片日本免费| svipshipincom国产片| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一级a爱视频在线免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 此物有八面人人有两片| 国产免费av片在线观看野外av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美在线一区亚洲| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 最新在线观看一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 一区二区三区精品91| 日本在线视频免费播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲色图av天堂| 精品电影一区二区在线| 欧美黑人精品巨大| 久久久国产精品麻豆| 夜夜爽天天搞| 久99久视频精品免费| 在线播放国产精品三级| 一级毛片精品| 亚洲最大成人中文| 免费在线观看影片大全网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本 欧美在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 校园春色视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 一夜夜www| 高清黄色对白视频在线免费看| 久9热在线精品视频| www国产在线视频色| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品一区二区精品视频观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av视频在线观看入口| 在线观看午夜福利视频| 午夜精品在线福利| 成熟少妇高潮喷水视频| 热re99久久国产66热| 老司机靠b影院| 波多野结衣高清无吗| 丰满的人妻完整版| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品久久蜜臀av无| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲专区中文字幕在线| 国产私拍福利视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜a级毛片| 亚洲无线在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 校园春色视频在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 一级a爱视频在线免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| av有码第一页| tocl精华| 欧美成人免费av一区二区三区| 中文字幕久久专区| 麻豆成人av在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 色综合站精品国产| 1024视频免费在线观看| 精品日产1卡2卡| 又黄又粗又硬又大视频| 黄色 视频免费看| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂动漫精品| 又大又爽又粗| 大码成人一级视频| 精品国产国语对白av| ponron亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产区一区二久久| 亚洲美女黄片视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本a在线网址| 操美女的视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 人人妻人人澡人人看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄色成人免费大全| 国产精品综合久久久久久久免费 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产av精品麻豆| 操美女的视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线观看66精品国产| 国产又爽黄色视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 女人精品久久久久毛片| 在线观看舔阴道视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 天堂动漫精品| 香蕉国产在线看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 精品国产一区二区三区四区第35| 91av网站免费观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 久久天堂一区二区三区四区| a级毛片在线看网站| 欧美中文综合在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产男靠女视频免费网站| 女性生殖器流出的白浆| 成年人黄色毛片网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品不卡国产一区二区三区| 久热这里只有精品99| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本vs欧美在线观看视频| 99国产精品99久久久久| 身体一侧抽搐| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲五月婷婷丁香| 精品第一国产精品| 亚洲精品国产区一区二| 免费高清视频大片| a在线观看视频网站| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线视频色国产色| a在线观看视频网站| 国产精品电影一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩欧美三级三区| 久99久视频精品免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲,欧美精品.| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久国产成人免费| 丁香六月欧美| 999久久久国产精品视频| 露出奶头的视频| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日本视频| 日本欧美视频一区| 大型av网站在线播放| 伦理电影免费视频| 岛国在线观看网站| 久久亚洲精品不卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产亚洲精品一区二区www| 在线视频色国产色| 夜夜爽天天搞| 天堂影院成人在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品影院6| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线视频色国产色| а√天堂www在线а√下载| 久久伊人香网站| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品国产清高在天天线| 色综合欧美亚洲国产小说| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 69av精品久久久久久| 日本vs欧美在线观看视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产不卡一卡二| 国产成人精品久久二区二区91| 一区二区三区精品91| 国产成人啪精品午夜网站| 曰老女人黄片| 亚洲 国产 在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲在线自拍视频| ponron亚洲| 成在线人永久免费视频| 人妻久久中文字幕网| 少妇 在线观看| 日本 av在线| 亚洲人成电影观看| 一级毛片高清免费大全| 99国产极品粉嫩在线观看| 满18在线观看网站| 最近最新中文字幕大全电影3 | 黄色毛片三级朝国网站| 99re在线观看精品视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩欧美在线二视频| 不卡一级毛片| 在线免费观看的www视频| 精品国产一区二区久久| 99国产精品一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产激情欧美一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费 | 女警被强在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产免费av片在线观看野外av| 波多野结衣一区麻豆| 精品高清国产在线一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美成人性av电影在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 嫩草影视91久久| 亚洲人成77777在线视频| 校园春色视频在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 99国产精品免费福利视频| av片东京热男人的天堂| 国产乱人伦免费视频| 免费在线观看完整版高清| 久久午夜亚洲精品久久| 日日爽夜夜爽网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人影院久久av| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品精品国产色婷婷| 成人三级做爰电影| 午夜福利高清视频| 久久中文字幕一级| 老司机福利观看| 亚洲熟女毛片儿| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 两人在一起打扑克的视频| 丝袜美足系列| 久久久久久人人人人人| 黄色视频不卡| 亚洲免费av在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品九九99| 欧美中文综合在线视频| 黄色 视频免费看| 久久中文字幕一级| 日韩欧美在线二视频| 亚洲 国产 在线| av视频在线观看入口| 精品久久久久久久久久免费视频| 此物有八面人人有两片| av网站免费在线观看视频| xxx96com| av天堂在线播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线国产一区二区在线| 久热这里只有精品99| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 岛国在线观看网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 怎么达到女性高潮| 国产xxxxx性猛交| 黄片大片在线免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 搡老岳熟女国产| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一本久久中文字幕| 91九色精品人成在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日韩高清综合在线| 91在线观看av| 1024香蕉在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 免费无遮挡裸体视频| 久久久精品欧美日韩精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线观看www视频免费| 免费看美女性在线毛片视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲美女黄片视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产免费男女视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 天堂影院成人在线观看| 午夜福利欧美成人| 免费不卡黄色视频| 国产一区二区三区视频了| 国产成人精品无人区| 日日爽夜夜爽网站| 久久中文看片网| 在线av久久热| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美成人免费av一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 91大片在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品亚洲一级av第二区| 91九色精品人成在线观看| 两个人免费观看高清视频| bbb黄色大片| 久久香蕉精品热| а√天堂www在线а√下载| 午夜日韩欧美国产| 亚洲视频免费观看视频| 性少妇av在线| 亚洲 国产 在线| 久99久视频精品免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 黄频高清免费视频| 在线国产一区二区在线| 免费在线观看完整版高清| 禁无遮挡网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品九九99| 欧美久久黑人一区二区| 嫩草影视91久久| 午夜精品在线福利| 欧美日韩精品网址| 久久中文字幕一级| 国产成人免费无遮挡视频| 国产av一区二区精品久久| 中出人妻视频一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 波多野结衣巨乳人妻| 免费在线观看完整版高清| 日韩欧美在线二视频| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 一级片免费观看大全| 欧美日本视频| 亚洲中文av在线| 看免费av毛片| 宅男免费午夜| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲第一av免费看| 桃色一区二区三区在线观看| 97碰自拍视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜福利在线观看吧| 美女国产高潮福利片在线看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人欧美在线观看| 精品久久久久久,| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一本久久中文字幕| 一二三四在线观看免费中文在| а√天堂www在线а√下载| 久久精品国产综合久久久| 久久久久久国产a免费观看| 脱女人内裤的视频| 免费高清视频大片| 9色porny在线观看| av视频免费观看在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品国产区一区二| 1024视频免费在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久久久久久久中文| 午夜福利免费观看在线| 热re99久久国产66热| 99国产精品免费福利视频| av天堂久久9| 国产av一区二区精品久久| 校园春色视频在线观看| 国产三级在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 老司机靠b影院| 操出白浆在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 青草久久国产| 国产精品国产高清国产av| 精品免费久久久久久久清纯| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| www国产在线视频色| 国产精品影院久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品在线美女| 丝袜人妻中文字幕| 久热爱精品视频在线9| 夜夜爽天天搞| 国产乱人伦免费视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久中文字幕一级| 久久久久久久久中文| 国产三级黄色录像| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品二区激情视频| 最新美女视频免费是黄的| 国产av一区二区精品久久| 国产精品 欧美亚洲| 国产主播在线观看一区二区| 欧美中文综合在线视频| 婷婷六月久久综合丁香| 婷婷丁香在线五月| 一a级毛片在线观看| 欧美中文综合在线视频| 日本 av在线| 成人18禁在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机福利观看| 99re在线观看精品视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄色女人牲交| 黄色丝袜av网址大全| 欧美黑人精品巨大| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲,欧美精品.| 国内精品久久久久精免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产1区2区3区精品| 国产成人精品在线电影| 波多野结衣巨乳人妻| videosex国产| 美国免费a级毛片| 亚洲九九香蕉| 老司机深夜福利视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色成人免费大全| 在线观看午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 青草久久国产| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 99riav亚洲国产免费| 999久久久精品免费观看国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 热99re8久久精品国产| 日韩视频一区二区在线观看| 在线国产一区二区在线| 久久久国产精品麻豆| 精品国产国语对白av| 亚洲av熟女| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品福利观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品在线美女| bbb黄色大片| 亚洲国产精品999在线| 久久草成人影院| av欧美777| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美久久黑人一区二区|