雙瓣茉莉JsCYP71A基因的克隆和真核表達(dá)

袁媛 劉予涵 李建昆 萬(wàn)超 張?jiān)? 陳清西 伍炳華

摘? 要：基于雙瓣茉莉[Jasminum sambac （L.） Aiton]的花、葉轉(zhuǎn)錄組，篩選了一個(gè)在花朵中高表達(dá)且與香氣釋放規(guī)律對(duì)應(yīng)的P450基因進(jìn)行克隆和表達(dá)模式分析。利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得該基因的5?cDNA序列，與轉(zhuǎn)錄組中序列進(jìn)行拼接并驗(yàn)證，顯示該基因是一個(gè)含1545 bp的開(kāi)放閱讀框、編碼514個(gè)氨基酸殘基的蛋白。此P450蛋白具有特征性的亞鐵血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸殘基，與油橄欖、小葉咖啡等其他植物CYP71A氨基酸序列同源性較高，將其命名為JsCYP71A。遺傳進(jìn)化分析顯示，該蛋白與擬南芥P450家族中CYP82亞族CYP82G親緣關(guān)系最近。CYP71A和CYP82G多個(gè)成員與萜類香氣代謝相關(guān)，推測(cè)JsCYP71A蛋白有相似功能。JsCYP71A在茉莉花白花苞里的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量較低，在葉片中幾乎不表達(dá)，茉莉花開(kāi)放過(guò)程中，JsCYP71A在夜間11點(diǎn)和1點(diǎn)表達(dá)量高，白天表達(dá)量低，與萜類香氣物質(zhì)釋放呈正相關(guān)。JsCYP71A定位于細(xì)胞質(zhì)中。為獲得異源表達(dá)蛋白，構(gòu)建真核表達(dá)載體，在酵母BY4742株系中表達(dá)JsCYP71A，經(jīng)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)株系能成功表達(dá)大小約60 kDa的蛋白，為后續(xù)JsCYP71A酶學(xué)功能分析奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為分析JsCYP71A在茉莉花萜類香氣合成代謝中的作用提供參考。

關(guān)鍵詞：茉莉花;P450;基因克隆;亞細(xì)胞定位;真核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S685.16????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Eukaryotic Expression of JsCYP71A from Jasminum sambac

YUAN Yuan， LIU Yuhan， LI Jiankun， WAN Chao， ZHANG Yue， CHEN Qingxi， WU Binghua

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Based on the flower and leaf transcriptome of Jasminum sambac， a P450 gene with high expression in flowers and corresponding to the pattern of volatile fragrance release was screened for cloning and expression pattern analysis. The 5?cDNA sequence of this gene was obtained by RACE technology， which was aligned with the sequence in the transcriptome and verified by PCR. JsCYP71A contained an open reading frame at 1545 bp and encoded a protein with 514 amino acid residues. JsCYP71A had characteristic heme binding domains and cysteine residues. JsCYP71A had a high homology with the amino acid sequence of CYP71A in olive， coffee and other plants， therefore this gene was named as JsCYP71A. Phylogenetic analysis showed that JsCYP71A was closely related to CYP82G in the family of Arabidopsis thaliana P450. Multiple members of CYP71A and CYP82G subfamily were related to the aroma metabolism of terpenoids， so it is speculated that JsCYP71A has similar functions. The expression level of JsCYP71A was the highest in the white bud of jasmine， lower in the stem， and very low in the leaf. During the flowering process of jasmine， the expression level of JsCYP71A was high at 11 oclock and 1 oclock at night and low at daytime， which was positively correlated with the release of flower aroma. JsCYP71A was located in the cytoplasm of the cells. Eukaryotic expression vector of JsCYP71A was constructed and expressed in yeast BY4742 strain， and Western Blot showed that a protein about 60 kDa was successfully expressed. The result would lay a foundation for the subsequent enzymatic function analysis of JsCYP71A and for the future analysis of the role of JsCYP71A in the metabolism of terpenoids of jasmine.

Keywords： Jasminum sambac L.; P450; gene cloning; subcellular localization; eukaryotic expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.005

植物細(xì)胞色素P450是一種加單氧氧化酶，可切割進(jìn)入底物活性位點(diǎn)并與血紅素鐵結(jié)合的氧分子的雙鍵斷裂，將其中的一個(gè)氧原子添加到底物的氧化位點(diǎn)，使底物發(fā)生氧化[1-2]。植物P450蛋白能結(jié)合和催化分子體積不同、結(jié)構(gòu)多樣的底物，并能催化多種類型的化學(xué)反應(yīng)，如烷基的羥化、烯基的環(huán)氧化、烴基的氧化、氮/硫/氧位的脫烷基化、氮位的羥化和氧化、硫位的氧化、氧化性脫氨、氧化性的碳碳鍵斷裂等，因而也被稱為萬(wàn)能的生物催化劑[3]。P450蛋白廣泛參與植物特化化合物，如萜類、苯丙烷類及含氮化合物的合成和代謝過(guò)程[4]，對(duì)這些次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性起關(guān)鍵作用[5]。苯丙烷的生物合成途徑中，己報(bào)道的P450蛋白超過(guò)16個(gè)，如肉桂酸-4-羥化酶（C4H，CYP73）、類黃酮-3?-羥化酶（F3?H，CYP73B）、類黃酮-3?，5?-羥化酶（F3?5?H，CYP75A）、2-羥基異黃酮酶（IFS，CYP93C）、松柏醛-5-羥化酶（coniferylalcohol 5-hydroxylase，CYP84）等[1];萜類化合物生物合成中單萜（monoterpene）、倍半萜（sesquiterpenes）、雙萜（diterpenes）、三萜（triterpenoids）等都可成為P450蛋白的底物，如擬南芥中CYP71A和CYP71R專一性地參與了單萜的代謝，CYP71AV、CYP71BA、CYP71BL、CYP706B參與倍半萜代謝，CYP71Z、CYP76M、CYP99A、CYP720B參與雙萜代謝，CYP708A和CYP716A參與三萜代謝[1]。棕桐酸、油酸、亞油酸等長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成也有P450蛋白參與進(jìn)行羥化反應(yīng)[2， 6]，表明P450蛋白在植物特化代謝中尤其是萜烯類、苯丙烷類的合成與轉(zhuǎn)化的重要作用正在模式植物中得到逐步明晰。

茉莉花[Jasminum sambac （L.） Aiton]為福州市市花，屬于木犀科素馨屬灌木，原產(chǎn)于南亞和中亞地區(qū)[7]。茉莉花是福州傳統(tǒng)名茶“茉莉花茶”窨制的香原[8]，同時(shí)也是香料工業(yè)提取精油浸膏的重要原料[9]。茉莉花香氣物質(zhì)主要為單萜、倍半萜、苯丙烷/苯環(huán)類（benzenoids/phenylpropanoids）和其他微量物質(zhì)[10-11]。盡管對(duì)于茉莉花的香氣成分以及個(gè)別合成酶、水解酶有過(guò)諸多研究[12-13]，也報(bào)道過(guò)栽培環(huán)境因素對(duì)花香的影響以及不同品種間的成分差異[14-15]，但是有關(guān)茉莉花香氣成分尤其是芳樟醇、乙酸芐酯等優(yōu)勢(shì)成分的代謝途徑的了解并不全面。本研究基于前期茉莉花、葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GenBank登錄號(hào)GHOY00000000）[16]，獲得若干在花朵中高量表達(dá)且與香氣釋放規(guī)律一致的P450基因。本研究選擇其中一個(gè)表達(dá)量最高的P450序列（c61299_g1），克隆其編碼序列并且分析其時(shí)空表達(dá)模式，并了解其亞細(xì)胞定位并在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，為其功能研究提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 以三年生雙瓣茉莉花為材料。選擇剛開(kāi)放不久的花朵用于基因編碼序列克隆，選擇第2天會(huì)開(kāi)放的黃花苞、當(dāng)天會(huì)開(kāi)放的緊實(shí)白花苞、盛開(kāi)的花朵（開(kāi)放8 h）、衰老的花朵（開(kāi)放36 h左右）、嫩葉、老葉、嫩莖等7種組織用于分析基因在不同組織中的表達(dá)水平（圖1）。分析基因在花朵在開(kāi)放過(guò)程中的表達(dá)水平時(shí)，從17：00（緊實(shí)白花苞）到第3天15：00（花朵衰老發(fā)紫），每隔2 h采集花朵。所有樣品用剪刀剪下后用鋁鉑紙包好投入液氮中，然后保存在–80 ℃超低溫冰箱中。

1.1.2? 表達(dá)載體、菌株及培養(yǎng)基? Gateway系統(tǒng)植物表達(dá)載體pK7FWG2.0（35 S啟動(dòng)子，GFP報(bào)告基因）、真核表達(dá)載體pDRTxa、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tunmefaciens）GV3101株系、酵母（Saccharomyces cerevisiae）By4742株系[17]為本實(shí)驗(yàn)室保存。感受態(tài)大腸桿菌（E. coli）DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

用于酵母培養(yǎng)的SD+KHL液體培養(yǎng)基配置參見(jiàn)伍炳華等[17]方法。SD+KHL固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20%（W/V）瓊脂粉。

1.2? 方法

1.2.1? RNA提取及cDNA獲得? 稱取約0.1 g組織（不同器官組織或不同開(kāi)放時(shí)期花苞和花朵），參照TranZol UP試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）方法進(jìn)行RNA進(jìn)行提取。使用超微量紫外分光光度計(jì)（Nano drop 2000）測(cè)定所提取RNA的濃度，并使用電泳檢測(cè)其完整性。使用EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Su-perMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）獲得第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系按說(shuō)明書(shū)要求。用于獲得擴(kuò)增編碼序列的cDNA反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?2 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。用于熒光定量的cDNA的反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?2 ℃ 15 min，85 ℃，5 s。

1.2.2? 茉莉JsCYP71A編碼序列擴(kuò)增? 轉(zhuǎn)錄組中需克隆的目標(biāo)P450基因序列僅為3?端序列，因此采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中P450基因序列，設(shè)計(jì)RACE引物（表1）擴(kuò)增其5?端序列。PCR的擴(kuò)增體系按說(shuō)明書(shū)要求。PCR程序：94 ℃ 30 s，92 ℃ 5 min，5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物使用AxyPrepTM PCR Clean up Kit（Axygen）純化回收、連接到pEASY-blunt Cloning Vector載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司），并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性后送測(cè)序。將獲得的5?序列與轉(zhuǎn)錄組中的序列進(jìn)行拼接，獲得編輯全長(zhǎng)序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證其編輯序列。PCR的擴(kuò)增體系按說(shuō)明書(shū)要求。PCR程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物連接克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性后送測(cè)序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.2.3? 生物信息學(xué)分析? 將測(cè)序之后得到的核酸序列用生物軟件網(wǎng)的SMS在線工具（http：//www. bio-soft.net/sms/index.html）中的DNA Figures進(jìn)行序列翻譯，Protein Figures進(jìn)行多重序列比對(duì);運(yùn)用NCBI中的BLASTX進(jìn)行P450間的同源性比對(duì);使用NCBI中的Conserved Domain Search Service（CD Search）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析;用MEGA4軟件分析茉莉花P450基因與其他物種中P450基因的親緣關(guān)系;使用Protparam在線軟件，對(duì)P450蛋白分子量、等位點(diǎn)（pI）、正負(fù)電荷量等數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4? 茉莉JsCYP71A的時(shí)空表達(dá)特征? 根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），采用熒光定量PCR分析JsCYP71A在不同組織和開(kāi)放期間的表達(dá)水平。按照TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒體系每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 15? s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平使用2–ΔΔCT法[18]進(jìn)行計(jì)算，茉莉花JsActin基因[19]為內(nèi)參基因。

1.2.5? 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化? 為分析JsCYP71A的亞細(xì)胞定位，將JsCYP71A構(gòu)建植物表達(dá)載體pK7FWG2.0，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），將JsCYP71A基因的編碼序列連接到TOPO入門載體（pENTR/SD/D-TOPO， Invitrogen）連接完成后測(cè)序正確的TOPO-JsCYP71A與pK7FWG2.0植物表達(dá)載體進(jìn)行LR反應(yīng)（Gateway LR Clonase II Enzyme mix， Invitrogen），使得JsCYP71A基因的編碼序列置于35S啟動(dòng)子下，并與GFP融合。將測(cè)序正確的pK7FGW2.0-JsCYP71A通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101株系，PCR檢測(cè)無(wú)誤后備用。TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)體系及程序參見(jiàn)其說(shuō)明書(shū)。

1.2.6? 亞細(xì)胞定位分析? 使用煙草葉片和茉莉花原生質(zhì)體分析JsCYP71A的亞細(xì)胞定位。使用煙草葉片時(shí)，將驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性克隆菌液使用含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L的慶大霉素、利福平、壯大霉素）28 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再取出適量菌液接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.8～1.0。5000 r/min離心10 min收集菌體，加入重懸液（1/2 MS+200 μmol/L乙酰丁香酮+10 mmol/L MES），暗培養(yǎng)3 h用無(wú)菌注射器向葉背面輕柔地注入菌液，暗培養(yǎng)24～30 h。使用茉莉花原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析時(shí)，茉莉花原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化方法見(jiàn)前期研究[20]。用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）觀察判斷GFP是否表達(dá)，觀察GFP時(shí)Ex=488 nm，Em=507 nm，觀察葉綠素時(shí)Ex=488 nm，Em=681 nm。

1.2.7? 茉莉JsCYP71A真核表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化酵母及蛋白提取? 根據(jù)pDRTxa載體上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的帶酶切位點(diǎn)的引物（表1），以cDNA為模板擴(kuò)增JsCYP71A基因編碼序列，通過(guò)酶切連接的方法連接到pDRTxa載體。連接完成后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑搖菌后送測(cè)序。使用PEG、AcLi和鮭魚(yú)精DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化酵母方法[21]將pDRTxa-JsCYP71A轉(zhuǎn)化至酵母株系BY4742。

酵母總蛋白的提取參考伍炳華等[17]的方法。介于P450蛋白的亞細(xì)胞定位特點(diǎn)，將總蛋白用Storage buffer（20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA，10% glycerol，100 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，pH 7.5）稀釋到40 mL，100 000 ×g，4 ℃超速離心45 min，獲得含有包涵體蛋白沉淀并用100 μL緩沖液和20 ?L蛋白酶抑制劑溶解。

1.2.8? SDS-PAGE電泳及茉莉JsCYP71A蛋白的Western Blot檢測(cè)? 將酵母中提取的總蛋白和包涵體蛋白按照Super-Bradford蛋白定量試劑盒（Bio-Rad）測(cè)定蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)（碧云天生物技術(shù)）。蛋白樣品10 μg，Marker 6 ?L，在10 V，30 mA條件下進(jìn)行電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)束后切除濃縮膠，將獲得的膠進(jìn)行染色、脫色，觀察考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。在凝膠的適當(dāng)位置做好標(biāo)記，置于轉(zhuǎn)移Buffer（2.9 g/L甘氨酸，5.8 g/L Tris，0.7 g/LSDS，20%甲醇）中。剪裁與膠大小相同的6張濾紙和1張膜（3 M），在轉(zhuǎn)移槽中從下往上依次放入3張濾紙、膜、膠、3張濾紙，每層之間不能有氣泡，在0.8 mA/cm下轉(zhuǎn)移蛋白1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成后，取出膜做好標(biāo)記，用去離子水漂洗1次、TTBS（8.8 g/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.05% Tween-20）漂洗3次（每次5 min，水平搖床）。將膜依次通過(guò)漂洗、封閉、結(jié)合一抗（anti-his mouse monoclonal antibody）、結(jié)合二抗（goat anti-mouse IgG（H+L），HRP Conju-gate）、漂洗等幾個(gè)流程[17]。在洗好的膜上均勻涂布200 ?L的顯影液放入顯影儀器（Bio- rad，molecular imager? ChemiDoc TM XRS+）中進(jìn)行顯影。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 茉莉JsCYP71A基因CDS序列克隆的結(jié)果

通過(guò)RACE技術(shù)得到茉莉花此P450序列的5′RACE片段600 bp（圖2A），將這段序列與已有序列進(jìn)行拼接，得到起始密碼子和終止密碼子，根據(jù)起始和終止密碼子位置設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的引物，擴(kuò)增獲得1545 bp的片段（圖2B）。

此序列的CDS長(zhǎng)度為1545 bp，編碼514個(gè)氨基酸殘基（圖3）。用Protparam在線軟件預(yù)測(cè)P450基因分子總量為58.5 kDa，等電點(diǎn)為6.75，分子式為C2675H4193N683O748S21。正負(fù)電氨基酸的殘基數(shù)相差不大，帶正電的氨基酸64個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸65個(gè)。其不穩(wěn)定系數(shù)為44.52，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2? 茉莉JsCYP71A基因序列分析

將茉莉JsCYP71A基因P450序列編碼的氨基酸序列經(jīng)Blast比對(duì)（表2），發(fā)現(xiàn)其與油橄欖、小果咖啡和苦瓜中的cytochrome P450 71A1-like蛋白，以及大麻和河岸葡萄中TMTT合成酶（trimethyltridecatetraene synthase）的相似度較高，將此基因命名為JsCYP71A。將茉莉花JsCYP71A氨基酸序列與擬南芥中P450序列進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析（圖4），發(fā)現(xiàn)JsCYP71A與擬南芥CYP82家族最近，其中與CYP82G1親緣關(guān)系最近。

將茉莉花JsCYP71A蛋白和其他物種中相應(yīng)蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列中的42～501 aa為P450超級(jí)家族（圖5A）。此外，序列含有P450蛋白典型的脯氨酸富集區(qū)、Helix C、Helix K、Meander 以及Heme-binding 結(jié)構(gòu)域（圖5B）。

2.3? 茉莉JsCYP71A基因的空間和時(shí)間表達(dá)特征

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了茉莉JsCYP71A基因在不同組織中表達(dá)水平。結(jié)果顯示，JsCYP71A基因在白花苞中的相對(duì)表達(dá)量最高，達(dá)到38.39，其次是衰老的花朵，再其次為嫩莖和老葉，在黃花蕾和嫩葉中的表達(dá)量最低，其中JsCYP71A基因在黃花苞的表達(dá)量?jī)H有0.13（圖6）。

在花朵開(kāi)放釋香過(guò)程中，JsCYP71A基因在夜間（如第1天的21：00—3：00，第2天的19：00— 23：00）表達(dá)量高，在白天（如第1天03：00— 17：00，第2天01：00—15：00）表達(dá)量低。第1天19：00—23：00這段時(shí)間為P450表達(dá)量的增長(zhǎng)期，其相對(duì)表達(dá)量在首日晚上23：00點(diǎn)之后達(dá)到最高，為120.74，隨后開(kāi)始下降，然后保持低表達(dá)量，第2天19：00又開(kāi)始升高，在21：00左右達(dá)到第2次高峰，為101.43，而后開(kāi)始下降，之后維持較低水平（圖7）。

2.4? 茉莉JsCYP71A的亞細(xì)胞定位

從圖8可知，根據(jù)煙草葉片中熒光的位置可以判斷JsCYP71A在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)未在葉綠體中表達(dá)，與GFP對(duì)照相比，可發(fā)現(xiàn)JsCYP71A未在細(xì)胞核中表達(dá)，即在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);進(jìn)一步在茉莉花原生質(zhì)體中進(jìn)行驗(yàn)證可發(fā)現(xiàn)，JsCYP71A的亞細(xì)胞定位區(qū)域?yàn)榧?xì)胞質(zhì)中，因此茉莉JsCYP71A的亞細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)。

2.5? 茉莉JsCYP71A在酵母中的表達(dá)

根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=2.9031X-0.1064，X為酶標(biāo)儀測(cè)定的數(shù)據(jù)，Y為稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度）換算轉(zhuǎn)化了JsCYP71A基因以及空載體后酵母中分離的包涵體蛋白濃度分別為0.820 ?g/?L和1.255 ?g/?L。

SDS-PAGE膠體考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示從轉(zhuǎn)化了P450的酵母菌液中提取的包涵體蛋白條帶均勻分散，條帶清晰，表明總蛋白和包涵體蛋白成功得到提取并在凝膠中進(jìn)行了很好的分離（圖9A）。

JsCYP71A蛋白通過(guò)生物信息學(xué)分析大小為59.39 kDa（包含6個(gè)His），Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化了JsCYP71A基因的酵母的總蛋白中在60 kDa處附近出現(xiàn)了條帶（圖9B），表明提取的總蛋白中確實(shí)含有目標(biāo)JsCYP71A蛋白，即JsCYP71A在酵母中成功表達(dá)。

3? 討論

細(xì)胞色素P450是高等植物中最大的酶蛋白家族[1]，動(dòng)物中的P450成員一般少于100，但開(kāi)花植物P450家族龐大，一般超過(guò)250個(gè)，如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）為245個(gè)、番茄（Lycopersicon esculentum）457個(gè)、水稻（Oryza sativa）343個(gè)、葡萄（Vitis vinifera）416個(gè)[1]。本研究中，JsCYP71A基因長(zhǎng)度1545 bp，編碼514個(gè)氨基酸，氨基酸序列中有P450超級(jí)家族特征序列和脯氨酸富集區(qū)、Helix C、Helix K、Meander 以及Heme-binding 結(jié)構(gòu)域基序，初步說(shuō)明本研究克隆的這個(gè)基因是P450基因。

JsCYP71A與同一科植物油橄欖CYP71A相似性和同源性最高。CYP71亞族很多成員參與萜類物質(zhì)的合成，如CYP71D和CYP71A成員參與薄荷屬植物單萜檸檬烯形成后各衍生物的合成[22-24]，CYP71B參與了葡萄莎草酮（rotundone）的氧化合成[25]，煙草CYP71D參與倍半萜capsidol的合成[26-27]等。此外，JsCYP71A與大麻和河岸葡萄中TMTT（一種半萜）合成酶的相似度較高，TMTT和DMNT是一種在植物防御中十分重要的半萜，在棉花[28]、擬南芥[29-30]、玉米[31]等重要作物中均有報(bào)道，這些結(jié)果均暗示茉莉JsCYP71A可能具有相似的參與萜類代謝的功能。進(jìn)一步的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明JsCYP71A與擬南芥CYP82G1親緣關(guān)系最近，擬南芥CYP82G1催化橙花叔醇與香葉基芳樟醇分別轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的萜烯同系物DMNT（C11）與TMNT（C16），這二者均為夜間開(kāi)花的花香物質(zhì)，也能影響外界刺激調(diào)控半萜的合成[29-30]。進(jìn)一步提示JsCYP71A可能參與了萜類的合成。

茉莉花在夜間開(kāi)放釋香，白天香氣較夜間更弱[32]，我們分析了JsCYP71A基因在花朵開(kāi)放48 h過(guò)程中的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)JsCYP71A基因在夜間花朵開(kāi)放時(shí)表達(dá)量急速增高，而白天表達(dá)低，與茉莉花香氣以及萜類香氣的釋放規(guī)律一致[32-33]，此外，JsCYP71A基因在當(dāng)晚會(huì)開(kāi)放的白花苞中表達(dá)量最高，在莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量較低，由于花苞開(kāi)放過(guò)程是釋放香氣物質(zhì)的主要時(shí)期，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推測(cè)JsCYP71A可能參與了茉莉花朵開(kāi)放過(guò)程中花朵香氣的合成及釋放過(guò)程。

茉莉花香氣的主要組成分為芳樟醇、法呢烯、乙酸芳香酯、甲苯酸甲酯芐酯，其中芳樟醇屬于單萜類化合物，占茉莉花單萜類香氣物質(zhì)總含量的90%以上[12]，是茉莉花的特征香氣組成[34]，其含量的變化對(duì)茉莉花香氣和精油的品質(zhì)有重要影響。擬南芥中的研究表明芳樟醇生成后，可通過(guò)氧化反應(yīng)生成各類環(huán)吡喃型（cyclic pyranoid）或呋喃型化合物的氧化衍生物（furanoid oxygenated derivatives），這些物質(zhì)可分為揮發(fā)性和溶解性兩類，其中芳樟醇及其揮發(fā)性氧化物是香氣的主要成分[35]，另一大部分溶解性芳樟醇氧化物以糖苷軛合物的形式存在于植物組織內(nèi)[36]。這些反應(yīng)的催化酶屬于細(xì)胞色素P450家族，包括CYP76C1、CYP76C2、CYP76C3、CYP76C4、CYP71B31[35， 37-38]。相比之下，關(guān)于P450在茉莉花萜類香氣，特別是芳樟醇合成后代謝的研究尚較少，本研究中JsCYP71A在茉莉花中具有明顯的花特異性，并與芳樟醇這類萜類的釋放規(guī)律具有一致性，暗示JsCYP71A可能參與了萜類的代謝。

茉莉花JsCYP71A蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，作為一種氧化酶，與大部分已報(bào)道的P450基因的亞細(xì)胞定位一致[25，28，39]，為后期JsCYP71A選擇真核表達(dá)而非原核表達(dá)提供基礎(chǔ)。后期我們將JsCYP71A在酵母中表達(dá)，分離包涵體蛋白并通過(guò)Western Blot進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)JsCYP71A可通過(guò)酵母成功表達(dá)，為后期測(cè)定JsCYP71A催化特定底物，特別是萜類物質(zhì)的酶學(xué)特征分析奠定基礎(chǔ)。

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