DFO通過HIF-1α/VEGF信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)*

王卓 陳俊 郝杰 彭志財(cái) 付福建 陳吉 陳勇

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川區(qū)中醫(yī)院骨科，重慶 402160；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬南川區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 408400；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山中醫(yī)院脊柱骨科，江蘇 昆山 215300)

由于神經(jīng)組織自我修復(fù)能力有限，脊髓損傷患者的臨床康復(fù)往往難以達(dá)到預(yù)期效果[1-2]。作為臨床上廣泛用于治療脊髓損傷的含鐵螯合劑藥物：去鐵胺(Deferoxamine, DFO)，可以清除自由基，并通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α，HIF-1α)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)[3-4]。本研究通過探討DFO對(duì)HIF-1α/VEGF表達(dá)的調(diào)控作用，及因此對(duì)脊髓損傷產(chǎn)生的促進(jìn)修復(fù)作用，旨在探討脊髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 分組與造模 將40只SD雄性大鼠(體重200～240 g)隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組10只，對(duì)照組10只，DFO 30 mg/Kg腹腔注射組(DFO 30組)10只以及100 mg/Kg腹腔注射組(DFO 100組)10只。術(shù)前1周內(nèi)在相同的條件下喂養(yǎng)，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，對(duì)所有大鼠通過腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，將背部剃毛，顯露背部，以胸10棘突為中心取正中切口，剝離椎旁肌肉，暴露椎板及棘突，小心切除椎板及棘突，暴露脊髓，在脊髓處放置直徑為2.5 mm墊板，隨后將10 g重砝碼從4.0 cm高處自由墜落并撞擊硬膜，以40 g.cm勢(shì)能對(duì)脊髓造成損傷，將砝碼迅速移除，止血后關(guān)閉創(chuàng)口。假手術(shù)組僅暴露脊髓，不予以神經(jīng)損傷。術(shù)后所有大鼠予以每日兩次膀胱功能訓(xùn)練，直至大鼠獲得膀胱自我控制功能。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 DFO注射 將DFO(美國(guó)Sigma公司)溶解于磷酸鹽緩沖液并使用0.45 um過濾器過濾。根據(jù)以往報(bào)告，DFO 30 mg/Kg及100 mg/Kg劑量給藥均對(duì)嚙齒類動(dòng)物安全[5-6]。因此，為了評(píng)價(jià)DFO給藥的效果，30 mg/Kg及100 mg/Kg濃度的DFO通過腹腔注射的方式在神經(jīng)損傷術(shù)后兩周內(nèi)分別對(duì)DFO 30組及DFO 100組大鼠給藥。

1.3 指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.3.1 行為學(xué)檢查 使用BBB評(píng)分(Basso Beattie and Bresnahan Locomotor Rating Scale)和斜板實(shí)驗(yàn)對(duì)術(shù)前、術(shù)后1、7、14、21及28 d時(shí)大鼠的行為學(xué)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)[2]。在寬闊場(chǎng)地將各組大鼠置于其中使其自由活動(dòng)至少5 min，觀察左右后肢的運(yùn)動(dòng)情況。將左右后肢功能BBB分值相加取平均值后記錄。而對(duì)于斜板實(shí)驗(yàn)，將大鼠放置于木制板上，逐漸提升大鼠頭端木制板高度，觀察并記錄大鼠在斜板上維持超過5 s時(shí)的最大傾角。所有大鼠測(cè)量三次，取平均值作為最終檢查數(shù)據(jù)。

1.3.2 病理學(xué)觀察 術(shù)后第4周時(shí)，對(duì)照組及DFO兩組大鼠每組取6只行病理學(xué)觀察。對(duì)所有大鼠通過腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，經(jīng)左心室將冰生理鹽水灌注全身，直至澄清液體流出后，使用約200 mL濃度為4%的多聚甲醛溶液將大鼠固定，隨后以脊髓損傷部位為中點(diǎn)，將長(zhǎng)約1 cm脊髓組織取出。組織取出后迅速使用多聚甲醛固定6～8 h，使用30%蔗糖溶液脫水后，行石蠟包埋。將包埋好的組織進(jìn)行橫切片，片厚5 μm，每只共獲取切片40張。將殘存面積最小處設(shè)定為脊髓損傷中心，取損傷中心處切片，并從損傷中心處至頭側(cè)及尾側(cè)3 mm，每500 μm處取分別切片一張，共取得13張進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下通過數(shù)字圖像分析儀計(jì)算切片中髓鞘的面積。

1.3.3 HIF-1α/VEGF表達(dá)測(cè)定 術(shù)后第4周時(shí)，4組大鼠每組取4只行HIF-1α/VEGF表達(dá)測(cè)定。脊髓組織取出方法同病理學(xué)觀察。通過Western bolt法將取出的脊髓組織進(jìn)行等量上樣，隨后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜及封閉處理，分別用兔抗HIF-1α(1∶100)及VEGF(1∶100)行4度一抗過夜，洗膜后，Odyssey系統(tǒng)進(jìn)行觀察，并定量分析各條帶的灰度。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢查 術(shù)前，4組大鼠BBB評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)角度接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，術(shù)后1 d時(shí)，對(duì)照組及DFO兩組大鼠行為學(xué)功能明顯降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1周開始，DFO兩組大鼠行為學(xué)功能較對(duì)照組有明顯改善(P<0.05)，但DFO兩組差異不明顯(P>0.05)。術(shù)后2周開始，DFO兩組大鼠行為學(xué)功能較對(duì)照組明顯改善，且DFO 100組改善程度更優(yōu)于DFO 30組(均P<0.05)，見圖1。

圖1 4組大鼠行為學(xué)檢查結(jié)果

2.2 病理學(xué)觀察 術(shù)后4周時(shí)，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組大鼠脊髓組織明顯減少(P<0.01)，而DFO 30組髓鞘殘余面積相對(duì)于對(duì)照組明顯恢復(fù)，DFO 100組髓鞘殘余面積明顯高于DFO 30組(均P<0.05)，見圖2。

圖2 對(duì)照組及DFO兩組術(shù)后4周時(shí)髓鞘殘余面積

2.3 HIF-1α/VEGF表達(dá)測(cè)定 術(shù)后4周時(shí)，對(duì)照組大鼠脊髓組織內(nèi)僅有少量HIF-1α/VEGF表達(dá)， DFO 30組脊髓組織內(nèi)HIF-1α/VEGF表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，DFO 100組HIF-1α/VEGF表達(dá)量較DFO 30組更明顯(均P<0.05)，見圖3。

圖3 4組HIF-1α/VEGF表達(dá)測(cè)定結(jié)果

3 討論

DFO作為一種螯合劑，可以螯合鐵蛋白中的三價(jià)鐵離子，降低神經(jīng)損傷部位的鐵離子濃度[7-8]，并可以清除氧自由基，從而減緩神經(jīng)組織中脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞再生[9-12]。本研究的斜板實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和DFO兩組大鼠行為學(xué)功能在術(shù)后1周時(shí)開始有所改善，術(shù)后兩周開始，DFO兩組大鼠行為學(xué)功能均較對(duì)照組有明顯改善，而DFO 100組改善程度更優(yōu)于DFO 30組。在病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組大鼠脊髓組織在術(shù)后4周時(shí)明顯減少，而DFO 30組髓鞘殘余面積相對(duì)于對(duì)照組明顯恢復(fù)，DFO 100組髓鞘殘余面積明顯高于DFO 30組(均P<0.05)。這些結(jié)果表明，DFO可以促進(jìn)受損的神經(jīng)組織修復(fù)，且高濃度DFO給藥更利于神經(jīng)組織的再生。

HIF-1蛋白可以調(diào)控細(xì)胞的信號(hào)通路，有α及β兩個(gè)亞基。α亞基在常溫下降解，而在缺氧情況下受誘導(dǎo)表達(dá)[13]。脊髓損傷時(shí)會(huì)造成神經(jīng)組織微環(huán)境缺氧，缺氧狀態(tài)不僅容易引起HIF-1α表達(dá)，且其羥基化作用容易被干擾，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性增強(qiáng)[14-16]。HIF-1α可以通過調(diào)控VEGF以及促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)組織血供恢復(fù)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)組織再生，對(duì)損傷后的神經(jīng)組織恢復(fù)具有十分重要的作用[17]。有研究表明，脯氨酸羥化酶可以促進(jìn)HIF-1α的降解，缺氧時(shí)脯氨酸羥化酶活性降低，導(dǎo)致HIF-1α的降解被阻斷，從而導(dǎo)致HIF-1α的高表達(dá)[18-19]。DFO可以抑制脯氨酸羥化酶的活性，從而提高HIF-1α的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[20-21]。本研究結(jié)果同樣表明，DFO可以促進(jìn)HIF-1α表達(dá)。

作為HIF-1α的靶基因蛋白，VEGF可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并增加血管的通透性[22-23]。脊髓損傷后，VEGF的表達(dá)可以持續(xù)促進(jìn)血管再生，而新生血管能夠分泌血管分泌因子，使神經(jīng)元細(xì)胞歸巢至受損的神經(jīng)組織處，不僅改善受損神經(jīng)組織的微循環(huán)，更使神經(jīng)元細(xì)胞聚集而促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)[24-27]。本研究結(jié)果顯示，DFO促進(jìn)HIF-1α表達(dá)的同時(shí)明顯促進(jìn)VEGF的表達(dá)，高濃度DFO可以促進(jìn)HIF-1α/VEGF多表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)。

DFO通過HIF-1α/VEGF表達(dá)可以有效促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)，大劑量DFO應(yīng)用有望達(dá)到更好的脊髓損傷修復(fù)效果。本研究尚有以下不足之處：樣本量較少；缺乏對(duì)脯氨酸羥化酶表達(dá)的觀察；僅觀察VEGF表達(dá)，缺乏對(duì)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子等蛋白表達(dá)的觀察。為進(jìn)一步確定DFO促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)的機(jī)制，計(jì)劃在將來進(jìn)行更縝密的研究，深層次探討DFO治療脊髓損傷的機(jī)理，為臨床用藥提供新的思路。

4 結(jié)論

DFO通過調(diào)控HIF-1α/VEGF表達(dá)有效促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)，大劑量DFO應(yīng)用可能具有更好的脊髓損傷修復(fù)效果。