烤煙上部葉光合特性與單葉質(zhì)量葉位效應(yīng)的聚類分析

雷 佳，葉衛(wèi)國，單雪華，袁非菲，梁劍雄，李淮源，陳建軍

(1 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣東 廣州 510385； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3 湖南省煙草公司 衡陽市公司，湖南 衡陽 421001)

特色優(yōu)質(zhì)上部8片煙葉已成為雙喜品牌卷煙主要的優(yōu)質(zhì)原料來源之一。目前由于上部8片葉不同葉位間生理特性差異較大，不但給生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)一次性成熟采收與調(diào)制增加了難度，而且也會使上部煙葉各個葉位烤后煙葉的等級結(jié)構(gòu)差異顯著[1]，或出現(xiàn)不同葉位同一等級煙葉內(nèi)在化學(xué)成分、感官質(zhì)量差異較大的現(xiàn)象[2]，不利于工業(yè)企業(yè)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)原料的篩選與使用。

光合作用是作物產(chǎn)量和質(zhì)量形成的最重要生理過程之一，其強(qiáng)弱不僅與水分狀況、葉片溫度、CO2供應(yīng)濃度、營養(yǎng)供應(yīng)和分配等多個因子顯著相關(guān)，而且與葉位、葉齡密切相關(guān)[3]。顯然，烤煙上部8片葉各葉位葉片生理特性、質(zhì)量和單葉質(zhì)量差異形成的葉位效應(yīng)，主要是因各葉片所接受的光照、通風(fēng)、營養(yǎng)分配等條件的不同所致，直接或間接受到葉片光合特性的深刻影響，進(jìn)而影響著葉片物質(zhì)代謝過程，改變煙葉品質(zhì)形成的某些過程，最終通過煙葉等級結(jié)構(gòu)及感官質(zhì)量的差異表現(xiàn)出來[4-5]。因此研究烤煙不同葉位葉片的光合特性，可以為不同葉位煙葉間出現(xiàn)的質(zhì)量差異提供機(jī)理解釋。許多研究表明，烤煙煙葉的單葉質(zhì)量和外觀質(zhì)量、化學(xué)成分均受到葉位的顯著性影響，特別是煙株上部6片葉，其等級結(jié)構(gòu)隨葉位不同而呈現(xiàn)顯著性差異[6-12]。但這些關(guān)于煙葉不同葉位間差異的研究多集中在等級結(jié)構(gòu)、物理特性以及化學(xué)成分的比較上，而有關(guān)以卷煙品牌需求為導(dǎo)向，探討上部8片葉每片葉質(zhì)量風(fēng)格形成的生理機(jī)理研究報道極少。

單葉質(zhì)量是反映烤煙上部葉質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其形成與煙葉光合特性密切相關(guān)[13]。比較上部煙葉不同葉位的單葉質(zhì)量，可反映出其光合特性的異同，同時也可以簡單判斷某些相鄰葉位煙葉質(zhì)量的相似性。有報道指出，烤煙上部5片葉的單葉質(zhì)量隨葉位的升高而降低[14-15]，上部倒1葉單葉質(zhì)量較低，倒2～6葉差異不顯著[16]。但也有研究認(rèn)為，倒1～2葉單葉質(zhì)量差異不顯著，倒3～7葉單葉質(zhì)量差異不顯著，但與倒8葉單葉質(zhì)量差異顯著[10]?？梢?，目前關(guān)于烤煙上部葉各葉位單葉質(zhì)量的研究結(jié)論并不統(tǒng)一，為此，本研究通過對烤煙上部8片煙葉光合特性和單葉質(zhì)量進(jìn)行比較研究，探討每片上部煙葉烤后品質(zhì)差異產(chǎn)生的生理原因；同時采用聚類分析方法，將光合特性相似的葉位進(jìn)行歸類，利用單葉質(zhì)量這一質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行驗證，試圖為上部葉一次性成熟采收與科學(xué)調(diào)制，以及工業(yè)企業(yè)在特定葉位篩選合適的原料提供理論參考和實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙(NicotianatabacumL.)品種為云煙87，分別由湖南省煙草公司永州市公司、湖南省煙草公司衡陽市公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017-2019年連續(xù)3年分別在湖南省永州市寧遠(yuǎn)縣仁和鎮(zhèn)陳普全村、湖南省衡陽市衡南縣冠市鎮(zhèn)合溪村進(jìn)行。試驗地土壤前茬為水稻，土壤基本理化性質(zhì)為：pH 6.0，有機(jī)質(zhì)26.3 g/kg，全氮3.2 g/kg，堿解氮120.5 mg/kg，有效磷6.4 mg/kg，速效鉀71.2 mg/kg，緩效鉀83.1 mg/kg。試驗區(qū)面積為750 m2( 30 m×25 m)，株行距為0.6 m×1.2 m，田間設(shè)置3個4行測定區(qū)；每個測定區(qū)200株，四周設(shè)2行保護(hù)行。每區(qū)重復(fù)測定3次。2017-2019年均于3月10日移栽，統(tǒng)一打頂，留葉18 片，并對煙葉掛牌標(biāo)記。試驗施氮量為150 kg/hm2，其他田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方案執(zhí)行。

1.3 測定項目及方法

試驗以烤煙上部8片葉為測定對象。

1.3.1 光合特性的測定 在3個4行測定區(qū)，每個測定區(qū)選擇長勢長相均勻一致、能夠代表該點(diǎn)生長狀況的煙株3株，打頂后每株自上而下標(biāo)記倒數(shù)第1～8位葉。打頂20 d后，在每天上午09:00-11:00，逐株逐葉測定各個葉位葉片光合參數(shù)，從第1株的倒1葉按順序測到倒8葉，同樣的順序再測第2株的倒1～8葉，以此類推，連續(xù)測定5 d取平均值。凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)均采用美國 LI-Cor 公司生產(chǎn)的 LI-6400便攜式光合測定系統(tǒng)測定，為了避免環(huán)境因素的影響，采用光合儀自帶的LED紅/藍(lán)光源，人工控制光照強(qiáng)度為1 000 μmol/(m·s)，CO2濃度為400 μmol/mol，葉室溫度為30 ℃。測定每片葉約需時1 min，72片葉的整個測定過程約需1.5 h，以盡量保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。由于已通過人工控制葉室內(nèi)的光照強(qiáng)度、CO2濃度及溫度，影響光合作用的主要環(huán)境因素僅是葉片溫度，從測得數(shù)據(jù)看，測定過程的葉溫為31.8～33.6 ℃，差值小于±2 ℃，可認(rèn)為由葉溫引起的光合差異極小，能保證本試驗光合數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.3.2 單葉質(zhì)量的測定 按照《YC/T 142-2010煙草農(nóng)業(yè)性狀調(diào)查測量方法》中關(guān)于“單葉重”的測定方法，分別測定上部8個葉位的單葉質(zhì)量。

1.3.3 聚類分析 由于凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)4個指標(biāo)的量綱不同，需先對這4個指標(biāo)進(jìn)行降維，即主因子分析，然后再通過歐氏距離法對上部8片葉的光合特性進(jìn)行聚類分析。具體可參考呂鵬輝等[17]和郭建華等[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2017-2019 年連續(xù)3年兩地主要研究結(jié)果趨勢類似，限于篇幅，本研究主要報道2019年永州市寧遠(yuǎn)縣的試驗結(jié)果。

2.1 烤煙上部8片葉光合特性的比較

由表1可見，隨著葉位的降低，烤煙葉片的凈光合速率明顯下降。倒1～2葉凈光合速率最高，分別達(dá)到了24.42和23.44 μmol/(m·s)，且兩者差異不顯著；倒3～5位葉間凈光合速率差異不顯著，但較倒1葉顯著降低了9.79%～15.48%；倒6～8位葉的凈光合速率差異不顯著，但與倒1～2葉和倒3～4葉差異顯著，且較倒1葉顯著降低了21.05%～27.68%。上部8片葉間的胞間CO2濃度為286.29～308.63 μmol/mol，差異不顯著?？梢?，葉位間的差異主要影響了煙葉的凈光合速率，對胞間CO2濃度影響較小。隨著葉位的降低，上部8片葉的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均明顯下降。倒1～2葉氣孔導(dǎo)度差異不顯著；倒3～5葉差異也不顯著，但較倒1葉顯著下降了15.92%～20.23%；倒6～7葉差異不顯著，但與倒1～2葉、倒3～5葉和倒8葉差異顯著，且較倒1葉顯著下降了27.91%～28.55%；倒8葉氣孔導(dǎo)度最小。對于蒸騰速率，倒1～2葉、倒3～6葉和倒5～7葉間差異不顯著，但隨著葉位間距的增大，這3組葉間及與倒8葉間的差異均達(dá)到了顯著水平。可見，上部8片葉的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率由于葉位間距的增大，葉片相互間的差異開始變得明顯。

表1 烤煙上部8片葉光合特性的比較Table 1 Comparison of photosynthetic characteristics among the top eight leaves

2.2 烤煙上部8片葉光合特性的聚類結(jié)果

從圖1可見，在歐氏距離為5時，聚類效果較好，同時結(jié)合表2發(fā)現(xiàn)，烤煙上部8片葉可分為4組，其中倒1～2葉屬于第Ⅰ組，該組葉片具有高強(qiáng)度的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率；倒3～5葉屬于第Ⅱ組，該組煙葉具有中等強(qiáng)度的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率；倒6～7葉屬于第Ⅲ組，該組煙葉具有低強(qiáng)度的凈光合速率、較低強(qiáng)度的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率；倒8葉則屬于第Ⅳ組，該組煙葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均較低。同時，上部8片葉的共同特征是具有相同強(qiáng)度的胞間CO2濃度?？梢姡捎谌~位的不同，成熟期烤煙上部8片葉的光合特性分層特征明顯。

表2 烤煙上部8片葉光合特性的聚類分析Table 2 Clustering results of photosynthetic characteristics of the top eight leaves

葉位1～8分別表示從煙株頂部往下標(biāo)記的第1～8片葉。圖2同Leaf positions 1-8 indicate the 1-8 leaf marked from the top of tobacco plant. The same in Fig.2

2.3 烤煙上部8片葉烤后單葉質(zhì)量的比較

由圖2可以看出，隨著葉位降低，葉片的單葉質(zhì)量明顯呈現(xiàn)出升高趨勢。根據(jù)單葉質(zhì)量的方差分析結(jié)果，可以將8個葉位分成4組：倒1～2葉、倒3～5葉、倒6～7葉、倒8葉，組內(nèi)差異不顯著，不同組間差異顯著。這4組葉片的單葉質(zhì)量分別為8.68～8.79，9.86～10.05，10.32～10.43和10.80 g，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)煙葉的要求。上部8片葉的單葉質(zhì)量表現(xiàn)出的這種規(guī)律，可能也存在于煙葉的其他質(zhì)量指標(biāo)中。

圖2 烤煙上部8片葉烤后單葉質(zhì)量的比較Fig.2 Comparison of single leaf weight of the top eight leaves of tobacco after curing

3 討論與結(jié)論

隨著煙葉原料成本控制及未來高端卷煙對原料需求的精準(zhǔn)性等要求的提高，對不同葉位煙葉質(zhì)量特征及使用價值進(jìn)行精準(zhǔn)定位研究顯得尤其重要。作物單作群體不同空間層次的葉片，一般隨著葉位降低, 光合有效輻射、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率都會逐漸下降，但胞間CO2濃度的變化方向不盡相同[19]。本研究表明，在烤煙倒數(shù)第1～8位葉，隨著葉片著生位置的降低，葉片凈光合速率下降，但胞間CO2濃度無顯著性變化，表明不同作物葉片的光合特性隨葉位變化存在一定差異。許大全[20]指出，只有當(dāng)凈光合速率和胞間CO2濃度的變化方向一致，即兩者同時減少時，才可認(rèn)為凈光合速率的下降主要是由氣孔限制引起的，否則歸因于非氣孔限制。根據(jù)該判斷可知,本研究烤煙倒1葉至倒8葉凈光合速率的下降，主要是由非氣孔限制所引起，即主要與葉肉細(xì)胞的羧化能力較低有關(guān)。有研究指出，氣孔導(dǎo)度的降低會導(dǎo)致凈光合速率下降[21-22]，而本試驗中的氣孔導(dǎo)度和凈光合速率雖然均隨葉位降低而降低，存在一定程度的氣孔限制，但結(jié)合胞間CO2濃度的變化方向來判斷，非氣孔限制才是導(dǎo)致本試驗煙葉凈光合速率明顯下降的主要原因，這與司力珊等[23]對茄科作物辣椒的研究結(jié)論一致。蘇賢坤等[24]研究烤煙各部位葉片的光合特性和相關(guān)酶活性的差異時同樣指出，隨著葉位降低，葉片葉綠素以及與光合相關(guān)酶的活性明顯降低，最終導(dǎo)致凈光合速率下降，但其選取的烤煙部位間隔相距較大。由此來看，由葉位降低而引起的凈光合速率下降的生理原因尚需進(jìn)一步研究。

光合作用是葉片內(nèi)含物形成的生理基礎(chǔ)，直接決定著葉片單葉質(zhì)量的大小[13]。謝已書等[16]研究表明，在烤煙上部倒1～6葉中，倒1葉的單葉質(zhì)量與其他葉位葉片差異顯著，而倒2～6葉間差異不顯著。 段樹蒼等[10]則認(rèn)為，麗江烤煙倒1～8葉的單葉質(zhì)量可以分成倒1～2葉、倒3～7葉、倒8葉3組，且組內(nèi)差異不顯著、不同組間差異顯著。本研究根據(jù)單葉質(zhì)量方差分析結(jié)果，將8個葉位分成倒1～2葉、倒3～5葉、倒6～7葉和倒8葉4組，也是組內(nèi)差異不顯著、不同組間差異顯著。這可能是由于單葉質(zhì)量會受到生態(tài)環(huán)境和農(nóng)藝栽培措施等的影響[25]，也說明了生產(chǎn)上可以通過栽培措施的調(diào)控，使上部煙葉不同葉位的單葉質(zhì)量達(dá)到預(yù)期的要求。

單葉質(zhì)量與煙葉內(nèi)在化學(xué)成分和外觀質(zhì)量均有密切的關(guān)系[25]。有研究表明，煙葉的單葉質(zhì)量與總糖和還原糖呈負(fù)相關(guān)，與煙堿和總氮呈正相關(guān)[26]，大部分中性香氣物質(zhì)含量在上部葉單葉質(zhì)量處于12～15 g時達(dá)到最高值，超出這一范圍后隨著單葉質(zhì)量增加而降低[27]；隨著上部煙葉單葉質(zhì)量的增加，煙葉顏色由深至淺，由棕紅色過渡至檸檬黃色，煙葉油分、色澤、葉片結(jié)構(gòu)、厚度等指標(biāo)也均隨單葉質(zhì)量的提高而提升[28]，這說明利用單葉質(zhì)量這一指標(biāo)對煙葉總體質(zhì)量進(jìn)行初步判斷的可行性。本研究通過方差分析，將8個葉位煙葉的單葉質(zhì)量分成了4組，根據(jù)單葉質(zhì)量與煙葉質(zhì)量間存在的密切關(guān)系，判斷上部8片葉的總體質(zhì)量特征可能也符合這一分組規(guī)律。

單葉質(zhì)量可反映上部8片葉不同葉位間質(zhì)量特征的異同，而對上部8片葉的光合特性進(jìn)行聚類分析，則可從生理特性的角度明確不同葉位具有的相似性，這對于指導(dǎo)一次性采收和按照生理特征進(jìn)行分組烘烤，以及在特定葉位挑選能滿足工業(yè)需求的煙葉均具有重要意義。目前研究結(jié)果多以上部6片葉一次性采收為主[29-31]。也有研究認(rèn)為，上部5～8片葉[32]、上部4～6片葉[33]、上部4片葉[34]、上部5片葉[14]一次性采烤或頂部1～2片葉不采烤[35]等采收方式較好，而黃浩等[36]對比上部4片葉、5片葉和6片葉一次性帶莖烘烤后的煙葉發(fā)現(xiàn)，上部6片葉一次性采收的烤后煙葉具有更好的外觀質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。本研究發(fā)現(xiàn)上部倒8片葉可以分為4組，而倒數(shù)第1～2位葉和倒數(shù)第3～5位葉雖然可以細(xì)分為第Ⅰ組和第Ⅱ組，但相對于其他葉位的葉片，兩者的生理特征比較相近，因此從生理基礎(chǔ)上推斷上部最終留5片葉比較符合采收的標(biāo)準(zhǔn)。

由于非氣孔限制，上部8片葉凈光合速率隨葉位的降低而降低，同時按光合特性與單葉質(zhì)量的差異進(jìn)行比較分組，結(jié)合生理與質(zhì)量兩個方面認(rèn)為，在烤煙上部8片葉中，倒1～2葉、倒3～5葉、倒6～7葉和倒8葉分屬4組葉，同組煙葉內(nèi)各個葉位差異較小，這為指導(dǎo)上部葉成熟采收與調(diào)制以及工業(yè)企業(yè)在特定葉位篩選合適的原料提供了依據(jù)。