蓋姆斯木霉分離鑒定及菌絲體發(fā)酵條件的研究

徐偉，張雪，王植朔，邵百琪，吳凡，謝紅瑤

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028）

我國已知牛肝菌科有28屬，397種及變種[1]，產(chǎn)地主要集中在云南，由于野生牛肝菌是優(yōu)良的外生菌根真菌，其生長對寄主要求嚴(yán)格，大多數(shù)種類仍不能通過人工栽培形成子實體[2-3]。據(jù)報道，在野生牛肝菌子實體生長過程中常常伴隨著黃瘤孢菌的寄生，它無性時期產(chǎn)生的孢子粉會導(dǎo)致牛肝菌腐爛[4]，鐮刀菌是引起多種食用菌根腐病、枯萎病的主要致病菌[5-6]，故在研究野生牛肝菌子實體栽培的過程中，明確其內(nèi)生真菌與多種腐敗菌的關(guān)系是至關(guān)重要的。目前對于牛肝菌內(nèi)生真菌及拮抗腐敗菌的報道較少，丁小維等[7]從牛肝菌子實體中分離出內(nèi)生真菌毛霉屬（Mucor sp.）和黃瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus），且菌株的發(fā)酵液對于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都表現(xiàn)出較好的抑制效果；岳萬松等[8]從牛肝菌子實體中分離出5株內(nèi)生真菌，分別為毛栓菌（Trametes hitsuta）、假絲酵母屬（Candida sp.）、被孢霉屬（Mortierella sp.）、散囊菌屬（Eurotium sp.）和金色毛殼菌（Chaetomium aureum）。

木霉（Trichoderma sp.）廣泛存在于潮濕的土壤及腐木中，也會作為內(nèi)生真菌定殖于多種健康的生物組織內(nèi)部[9-11]，因其具有對環(huán)境的廣泛適應(yīng)性及對多種腐敗真菌的拮抗活性等特點，使得其在植物的生物防治方面?zhèn)涫荜P(guān)注[12]。木霉類生防制劑主要包括菌絲體、厚垣孢子及分生孢子制劑[13]，菌絲體制劑的存儲及活化過程中無需無菌環(huán)境，真空冷凍干燥菌絲體制劑具有運輸方便、儲存期長等優(yōu)點[14]，活化后可在土壤中迅速生長并發(fā)揮其防治特性。陳金蓮[15]從藥三七中分離出內(nèi)生真菌蓋姆斯木霉，該菌對土傳病原真菌表現(xiàn)出較好的生防效果，還可產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，促進(jìn)三七植株的生長；梁忠接[16]研究表明，蓋姆斯木霉與引起棉花黃萎病和枯萎病的病原真菌具有拮抗關(guān)系；Anees等[17]研究發(fā)現(xiàn)蓋姆斯木霉可拮抗引起玉米粉穗腐病的病原菌，開發(fā)木霉生防制劑可有效減少化學(xué)殺菌劑所導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染[18]。

本研究在通過組織分離法從新鮮野生牛肝菌中分離母種菌絲的過程中，獲得1株內(nèi)生真菌，結(jié)合該菌株的形態(tài)特征和rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列同源性分析對該菌株進(jìn)行鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對影響液態(tài)發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，并對該菌株與牛肝菌常見腐敗菌進(jìn)行拮抗性研究，以期為牛肝菌等其他食用菌栽培及生物防治提供優(yōu)良的生防菌株，也可為開發(fā)新資源化合物提供菌種資源[19-20]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鮮野生牛肝菌子實體：采摘于云南省楚雄彝族自治區(qū)祿豐縣，無菌袋、冰袋封裝，空運24 h內(nèi)分離。

GK2043膠回收試劑盒、GK1071 DNA提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；引物ITS1和ITS4由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

供試腐敗菌：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysprum）、黃瘤孢菌（Hypomyces chrysospermus）從野生牛肝菌子實體中分離并經(jīng)上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行菌種鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

固態(tài)培養(yǎng)基（comprehensive potato dextrose agar，CPDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43 g，VB11 mg，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。

綜合馬鈴薯培養(yǎng)基（comprehensive potato dextrose broth，CPDB）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO·47H2O 1.5 g，VB11 mg，水 1 L，pH 值自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備

JY300C電泳儀、JY02G凝膠成像系統(tǒng)：北京君意電泳設(shè)備有限公司；Beckman-JT-25R高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；ABI3730測序儀：北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司；HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；FD5-series真空冷凍干燥機：西盟國際公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

將新鮮野生牛肝菌子實體用自來水沖洗數(shù)次，去除表面雜質(zhì)，無菌水沖洗4次，75%乙醇漂洗2 min，再用無菌水沖洗數(shù)次，洗去乙醇，用無菌紗布擦干子實體表面。進(jìn)行組織分離，用無菌解剖刀將牛肝菌子實體縱切開后，將內(nèi)部的組織切割成約0.5 cm2的小塊，接種到CPDA平板上，29℃恒溫避光培養(yǎng)到5 d，待組織小塊周圍有大量菌絲出現(xiàn)，挑取少許菌絲，采用點植法純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接4次，獲得純菌株，顯微鏡觀察其菌絲及分生孢子顏色、形態(tài)，再將其轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上4℃保存。

1.2.2 rDNA ITS的內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定

采用GK1071提取試劑盒，對菌株進(jìn)行DNA提取。使用真菌ITS鑒定通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對DNA的ITS片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增體系為30 μL 反應(yīng)體系，包括 10×Taq Buffer 3 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA 模板 2 μL，雙蒸水補足至30 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 5 min，95℃ 15 s，95 ℃ 15 s，95 ℃ 45 s，35個循環(huán)，72℃，5 min保存。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳體系檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

PCR擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒GK2043回收，送到上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。將所測序列在NCBI中進(jìn)行BLAST對比，選擇同源性高于95%的序列，運用MEGA-X軟件進(jìn)行多重比較，通過鄰接法（neighbor-joining method，N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以bootstrap對發(fā)育樹進(jìn)行自舉法檢驗1 000次，從而確定菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

1.2.3 單因素及正交試驗設(shè)計

菌種活化：從CPDA培養(yǎng)基上取1 cm2菌片，接入到裝有50 mL CPDB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，振蕩48 h，即為活化種子液。

在 CPDB 培養(yǎng)基中，以瓶中 50、75、100、125、150mL的裝液量分別裝入250 mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速100、120、140、160、180 r/min，初始 pH 3、4、5、6、7，培養(yǎng)溫度25、27、29、31、33 ℃，接種量 5%，搖瓶培養(yǎng) 8 d，稱量菌絲體質(zhì)量，考察4個單因素對菌絲量的影響。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取四因素三水平進(jìn)行L9（34）正交試驗，確定菌絲體液態(tài)發(fā)酵條件。

1.2.4 菌株Trg-12菌絲體冷凍干燥

液態(tài)搖瓶培養(yǎng)8 d后，在三角瓶中加入5%甘油作為抗凍保護(hù)劑，在恒溫?fù)u床上160 r/min振蕩15 min，使其充分混合后，在5 000 r/min離心10 min，濾紙過濾收集菌絲體，并用無菌水沖洗3次，放到培養(yǎng)皿中，在-20℃冰箱中預(yù)凍12 h后，將樣品放入冷凍干燥機中，凍干條件為在冷阱-45℃，真空度10 Pa～20 Pa凍干12 h。精確稱量并計算發(fā)酵液中干基菌絲量（g/L），每個樣品重復(fù)3次。

1.2.5 菌株Trg-12與牛肝菌腐敗菌的平板對峙試驗

凍干菌絲1 g，溶于100 mL最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在160 r/min、29℃，初始pH6在搖床上培養(yǎng)1 d制成活化菌液，將活化后的菌種涂布于CPDA培養(yǎng)基上，置于29℃條件下避光培養(yǎng)至5 d。參照劉青等[21]、梁曉潔等[22]的方法利用平板對峙法進(jìn)行拮抗試驗，采用點植法將菌株Trg-12與腐敗真菌接種到新的固體培養(yǎng)基上，置于29℃條件下避光培養(yǎng)至5 d，十字交叉法測量菌落生長直徑，以第5天時菌落直徑計算抑菌率。對照組設(shè)置為單獨接種腐敗菌（尖孢鐮刀菌及黃瘤孢菌為腐敗菌）與對峙組培養(yǎng)條件相同，3組平行試驗。

抑菌率/%=（對照組腐敗菌的菌落直徑-對峙組腐敗菌的菌落直徑）/對照組腐敗菌的菌落直徑

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行試驗，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)表示。利用Origin 2018和SPSS 26軟件對單因素試驗進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Trg-12的菌落與菌體形態(tài)特征

通過組織分離法從野生牛肝菌實體中分離出1株內(nèi)生真菌，經(jīng)純化后接種于CPDA平板上，在29℃下培養(yǎng)5 d，觀察其菌落、菌體及孢子形態(tài)（10×100），如圖1所示。

圖1 內(nèi)生真菌菌落、菌體、孢子形態(tài)結(jié)果Fig.1 Morphological results of endophytic fungi colony，hyphae，and conidia

由圖1可知，菌落生長迅速，產(chǎn)生白色的氣生菌絲覆蓋整個培養(yǎng)基，不產(chǎn)生明顯的分生孢子；菌絲無色有隔，有側(cè)生分支，寬度為 2.1 μm～4.5 μm；厚垣孢子呈圓形，直徑 7 μm～12 μm，壁厚約 1.5 μm，內(nèi)部包裹著孢子顆粒。

2.2 菌株Trg-12的ITS rDNA鑒定

將菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以引物ITS1和ITS4為模板對內(nèi)生真菌的DNA進(jìn)行PCR擴增，獲得長度約為620 bp的特異性片段，菌株的ITS擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，如圖2所示。

圖2 Trg-12的ITS-PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of ITS-PCR amplification of Trg-12

將ITS擴增序列在NCBI庫中進(jìn)行BLAST比對，采用MEGA-X軟件，按照N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建菌株Trg-12的系統(tǒng)發(fā)育樹（Bookstrap≥50%）Fig.3 Construction of phylogenetic tree of strain Trg-12 based on rDNA-ITS sequence（Bookstrap≥50%）

對菌株進(jìn)行種水平的分類鑒別，在NCBI中BLAST比對結(jié)果顯示：100條序列中，菌株Trg-12與76株木霉屬（Trichoderma sp.）的序列同源性為99%以上，說明該菌為木霉屬；樹枝的長短表示各菌株之間的遺傳距離，同一支說明親緣關(guān)系較近，以系統(tǒng)發(fā)育方法可以對關(guān)系較為密切的菌株序列進(jìn)行較好的判別。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及BLAST對比及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果：菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Trichoderma gamsii聚類在同一支上，自檢支持率99%，鑒定該菌為蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）。

2.3 菌株Trg-12產(chǎn)菌絲體的正交試驗優(yōu)化

2.3.1 裝液量對菌株Trg-12菌絲量的影響

氧是影響Trg-12菌絲產(chǎn)量的重要因素，裝液量能夠反映液態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)基的供氧程度。采用250 mL三角瓶分別裝入不同體積的培養(yǎng)基，裝液量對菌絲量的影響結(jié)果，見圖4。

圖4 裝液量對菌絲量的影響Fig.4 The effect of liquid volume on the amount of mycelium

由圖4可知，隨著裝液量的增加，菌絲量呈先增加后減小的趨勢，在裝液量100 mL后菌絲量下降，這與瓶中溶氧量有關(guān)，供給菌絲體生長代謝的氧不足，裝液量50 mL時，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有限，能供給菌絲體生長的營養(yǎng)不足，故菌株Trg-12在250 mL三角瓶中最適裝液量為100 mL，此時菌絲量為4.15 g/L。

2.3.2 搖床轉(zhuǎn)速對菌株Trg-12菌絲量的影響

搖床轉(zhuǎn)速是與裝液量協(xié)同完成液態(tài)培養(yǎng)基中氧的溶解，保證Trg-12菌絲生長所需的氧。在250 mL三角瓶中裝入100 mL裝液量，選擇不同的搖床轉(zhuǎn)速，搖床轉(zhuǎn)速對菌絲量的影響結(jié)果，見圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲量的影響Fig.5 The effect of shaking speed on the amount of mycelium

由圖5可知，在180 r/min時菌絲量為4.27 g/L，表明搖床轉(zhuǎn)速過高時，雖然溶氧水平有所提高，但相應(yīng)的剪切力也增加，導(dǎo)致菌體出現(xiàn)老化與死亡的狀況，使得菌絲量有所降低，在搖床轉(zhuǎn)速較低時，體系內(nèi)溶氧不足，進(jìn)而影響菌絲體的生長與代謝，故菌株Trg-12液態(tài)發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速以160 r/min為宜，既能保證菌株Trg-12的溶氧需求，又不會對菌體造成損傷，菌絲量也達(dá)到最高，為4.35 g/L。

2.3.3 初始pH值對菌株Trg-12菌絲量的影響

培養(yǎng)基中pH值是影響微生物生長與繁殖的重要環(huán)境因素，最直接的表現(xiàn)形式為菌絲量的改變。不同的初始pH值對菌絲量的影響結(jié)果見圖6。

圖6 初始pH值對菌絲量的影響Fig.6 The effect of initial pH on the amount of mycelium

從圖6可知，初始pH 5.0～7.0較適宜菌株Trg-12菌體的生長，這說明培養(yǎng)基pH值在偏酸性或中性狀態(tài)下，適宜其菌體內(nèi)酶活力的發(fā)揮，故菌株Trg-12液態(tài)發(fā)酵的初始pH值以6為宜，此時菌絲量為4.20g/L。

2.3.4 培養(yǎng)溫度對菌株Trg-12菌絲量的影響

改變溫度可影響菌體內(nèi)進(jìn)行的許多生化反應(yīng)，從而影響菌體的生命活力。不同的培養(yǎng)溫度對菌絲量的影響結(jié)果，見圖7。

圖7 培養(yǎng)溫度對菌絲量的影響Fig.7 The effect of culture temperature on the amount of mycelium

由圖7可知，菌株Trg-12在25℃～33℃均有不同程度的生長，隨著溫度的升高，菌絲產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢，29℃時的菌絲量均高于同培養(yǎng)時間的其他溫度下的菌絲量，故菌株Trg-12液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度以29℃為宜，此時菌絲量為4.27 g/L。

2.3.5 菌株Trg-12正交試驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上選擇裝液量（A）、搖床轉(zhuǎn)速（B）、初始 pH 值（C）和培養(yǎng)溫度（D）4個因素，各取3個水平進(jìn)行L9（34）的正交試驗，確定液態(tài)培養(yǎng)的最佳條件，結(jié)果如表1所示。

表1 液態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)選正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Optimal orthogonal experimental design and results of liquid culture conditions

續(xù)表1 液態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)選正交試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 1 Optimal orthogonal experimental design and results of liquid culture conditions

由表1可知，液態(tài)培養(yǎng)條件中的裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH值和培養(yǎng)溫度均對菌絲體的生長產(chǎn)生影響，各因素作用主次順序依次為：B＞D＞A＞C。得出最優(yōu)液態(tài)培養(yǎng)條件組合為A2B3C2D2，即250 mL三角瓶裝液量 100 mL，160 r/min，初始 pH 6，29℃。為了確定此最佳條件的可靠性，對最佳液態(tài)培養(yǎng)條件A2B3C2D2進(jìn)行3次平行試驗驗證，平均菌絲量為4.43 g/L，高于正交試驗中任何一組的試驗結(jié)果，說明該組合為Trg-12的最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵條件。

2.4 菌株Trg-12對牛肝菌腐敗菌的拮抗試驗結(jié)果

鐮刀菌與黃瘤孢菌是引起蘑菇枯萎病的主要腐敗菌，進(jìn)行Trg-12與2種腐敗菌的拮抗性研究，在CPDA培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)5 d，結(jié)果見圖8。

圖8 菌株Trg-12與牛肝菌腐敗菌的拮抗效果圖Fig.8 Diagram of the antagonistic effect of Trichoderma gamsii and boletus spoilage fungus

3 d時菌株Trg-12與腐敗菌開始接觸，5 d時的拮抗?fàn)顟B(tài)如圖8 A1和圖8 B1所示，對2種腐敗菌表現(xiàn)出不同的抑制效果，菌株Trg-12抑制了腐敗菌菌落的生長，腐敗菌菌落邊緣不再延伸，形成明顯的抑菌帶;尖孢鐮刀菌的對照組菌落形態(tài)如圖8 A0所示，菌落在平板上為圓形生長，平板背面有紫色色素產(chǎn)生；由圖8 A1可知，此時菌株Trg-12對尖孢鐮刀菌的抑制率為（53.7±1.9）%；由圖8 B1可知，菌株Trg-12對黃瘤孢菌的生長有明顯的抑制作用；黃瘤孢菌的對照組菌落形態(tài)如圖8 B0所示，黃瘤孢菌初期為白色菌絲，后期為黃色孢子粉，5 d時，對峙組黃瘤孢菌有少量產(chǎn)孢現(xiàn)象，對照組已完全為黃色孢子，此時菌株Trg-12對黃瘤孢菌的平均抑制率為（74.7±1.6）%。

3 結(jié)論

目前對于牛肝菌內(nèi)生真菌報道較少，為探究牛肝菌內(nèi)生真菌與其腐敗菌是否存在拮抗關(guān)系，本研究以新鮮野生牛肝菌子實體為分離材料，獲得1株內(nèi)生真菌Trg-12，對其進(jìn)行形態(tài)觀察和rDNA ITS序列分子生物學(xué)鑒定，鑒定該內(nèi)生真菌為蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）。通過正交試驗優(yōu)化后的最佳液態(tài)發(fā)酵條件：以250 mL三角瓶中裝液量100 mL，初始pH 6，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度29℃。此條件下發(fā)酵的菌絲量為4.43 g/L。且經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)法測定，菌株Trg-12對牛肝菌常見腐敗菌尖孢鐮刀菌和黃瘤孢菌的抑制率分別為（53.7±1.9）%和（74.7±1.6）%，證明了木霉Trg-12對這兩種腐敗菌均有明顯的抑制作用，且兩菌交界處有較明顯的抑菌帶，推測可能是蓋姆斯木霉菌分泌的抑制物作用的結(jié)果，說明菌株Trg-12具有較好的生防應(yīng)用潛力。已有研究表明，蓋姆斯木霉產(chǎn)纖維素酶的能力較強，且在生防方面具有安全無毒、無污染、保護(hù)植株不受腐敗菌損害的同時提高植株的萌發(fā)率等優(yōu)點，故木霉菌Trg-12作為大型真菌的病害生物防治研究與應(yīng)用的潛力較大。本研究從野生牛肝菌中分離獲得1株優(yōu)良的生物防治菌株，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)菌絲體生防制劑提供技術(shù)參考。