超聲-微波協(xié)同優(yōu)化花生紅衣原花青素提取工藝及抗氧化研究

王娜，崔晨旭，鄭玉茹，解書蘊，師飛，張晗瑋，徐超*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點實驗室，河南 鄭州 450002）

花生紅衣（peanut skin，PS），為豆科植物花生種皮，顏色通常為粉紅或紅色，味道苦澀[1]?；ㄉt衣作為花生深加工副產(chǎn)物，全球產(chǎn)量約93萬噸/年[2]，大多作為廢棄物，也有作為畜牧業(yè)的動物飼料，利用度和產(chǎn)品附加值低，造成資源的極大浪費和污染[3]?；ㄉt衣中含有豐富的活性成分，如單寧酸、白藜蘆醇，原花青素（procyanidins，PSPc）等[4]，特別是 PSPc 含量高達128 g/kg[3]，是一種普遍存在于植物中的多酚類物質(zhì)。研究表明，PSPc 具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抗癌[7-8]、降血脂、改善血糖水平[1]、抗過敏[9]以及抑制丙烯酰胺[10]產(chǎn)生的生物學功效，而且與葡萄籽原花青素相比，具有更高的生物利用度[11]。眾多研究顯示，PSPc可能成為未來膳食補充劑和功能成分的可持續(xù)來源[12]。

目前，花生紅衣中PSPc的提取方法主要包括：溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界提取法[3]。溶劑提取法提取時間長，且提取率普遍不高[13]；超臨界提取法相比于傳統(tǒng)輔助有機溶劑提取法得率更高、選擇性好，但成本高；微波輔助提取法和超聲輔助提取法具有縮短提取時間、降低提取劑用量、提高得率、綠色環(huán)保等優(yōu)點[14-16]，溫志英[14]采用優(yōu)化后的微波輔助提取法提取PSPc，PSPc提取率達到11.38%，王翠蓮等[17]優(yōu)化后的PSPc超聲輔助提取法得率可達15.36%。但利用超聲-微波互作協(xié)同提取PSPc的方法未見報道。超聲-微波互作協(xié)同提取法，將超聲波輔助提取法和微波輔助提取法結(jié)合，具有提高效率，大大縮短提取時間、降低能耗等優(yōu)點[18]，從而得到廣泛應(yīng)用。

本研究以花生紅衣為原料，利用超聲-微波協(xié)同輔助乙醇提取PSPc，在單因素（超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度）試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計篩選出影響PSPc提取量的顯著因素，進一步采用響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化；并且評價不同提取工藝對PSPc提取量和其抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力），為花生紅衣的開發(fā)和高值利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生紅衣：河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點實驗室提供；原花青素標準品（純度：95%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、AB-8大孔樹脂：美國Solarbio公司；甲醇、無水乙醇、石油醚（30℃～60℃）、水楊酸、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵（均為分析純）：國藥集團化學試劑公司。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同提取儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV-1100紫外分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、C-0506低溫恒溫槽：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10D真空冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；HC-200T高速多功能粉碎機：武義海納電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生紅衣干粉制備

將花生紅衣干燥后粉碎過80目篩，用石油醚脫脂，然后抽濾、烘干，得到脫脂后的花生紅衣粉末裝自封袋備用。

1.2.2 PSPc制備工藝

工藝流程：花生紅衣干粉→抽提去脂→超聲-微波協(xié)同作用→水浴浸提→冷卻并抽濾→原花青素提取液→大孔樹脂凈化→真空濃縮→冷凍干燥→研磨粉碎。

1.2.3 PSPc提取量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

參考周婷等[19]的研究中標準曲線制作方法，以吸光度對原花青素濃度做標準曲線。

1.2.3.2 試樣測定

將樣品用甲醇稀釋后，吸取0.5mL試樣并加入3mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸，然后迅速混勻（避光操作），30℃水浴20min，于500nm波長下測吸光度。

試樣中PSPc提取量計算公式如下。

式中：X為試樣中原花青素的提取量，mg/g；X1為通過標準曲線計算出的原花青素含量，mg/mL；V1為試樣定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗設(shè)計

準確稱量0.5 g花生紅衣干粉，提取工藝同1.2.2，研究超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、料液比、浸提溫度、乙醇體積分數(shù)7個因素對PSPc提取量的影響，單因素梯度如表1所示。每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 單因素試驗設(shè)計Table 1 Single factor experimental design

1.2.5 Plackett-Burman試驗設(shè)計

Plackett-Burman試驗設(shè)計可以篩選出對響應(yīng)值影響較大的因素[20]。本試驗以花生紅衣原花青素提取量為響應(yīng)值，在單因素的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選超聲功率（A）、超聲時間（B）、微波功率（C）、微波時間（D）、乙醇體積分數(shù)（E）、浸提溫度（F）、料液比（G）7個因素對PSPc提取量的影響，為進一步的Box-Behnken試驗奠定基礎(chǔ)。因素及水平見表2。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗的篩選結(jié)果，選擇對PSPc提取量影響最大的乙醇體積分數(shù)、微波功率、料液比3個因素作為自變量，以PSPc提取量為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化花生紅衣原花青素的提取工藝，試驗因素和水平設(shè)計見表3。

表3 試驗設(shè)計因素和水平Table 3 Experimental factors level

1.2.7 不同提取方法對PSPc的提取量和抗氧化活性的影響

為比較不同提取方法對PSPc提取量和抗氧化活性的影響，準確稱量0.5 g花生紅衣干粉4份，分別用水提法、乙醇提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法提取，提取工藝按1.2.2，4種不同提取法的提取條件參考超聲-微波協(xié)同提取的最優(yōu)條件進行設(shè)定。水提法[4]：料液比 1∶75（g/mL）、提取時間 20 min、水浴溫度50℃；乙醇提取法[6]：乙醇體積分數(shù)55%、料液比為1∶37.5（g/mL）、提取時間 30 min、水浴溫度 60 ℃；微波輔助浸提法[14]：乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶40（g/mL），微波時間 120 s，微波功率 240 W；超聲輔助浸提法[5]：乙醇體積分數(shù) 70%、料液比為 1∶50（g/mL）、超聲功率153 W、超聲時間8 min、水浴溫度60℃、水浴時間50 min。

1.2.7.1 PSPc對DPPH自由基清除能力的影響

參考王翠蓮等[17]對DPPH自由基清除率的測定方法。按以下公式計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：A1為樣品與DPPH混合液吸光度；A2為樣品與無水乙醇混合液吸光度；A0為DPPH與無水乙醇混合液吸光度。

1.2.7.2 PSPc對羥自由基清除能力的影響

參考王翠蓮等[17]對羥自由基清除能力的測定方法，按照以下公式計算樣品對羥自由基的清除率。

式中：Ai為樣品與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液的混合液吸光度；Aj為樣品與FeSO4、水楊酸-乙醇溶液混合液吸光度；A0為FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、過氧化氫溶液的吸光度。

1.2.7.3 PSPc對鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）值的影響

參考王翠蓮等[17]對FRAP值的測定方法。精密吸取樣品溶液 10 μL 和 200 μL 2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ] 工作液到 96微孔板，充分混勻，37℃水浴鍋加熱反應(yīng)40 min，于酶標儀測定吸光度，波長設(shè)置593 nm，根據(jù)標準曲線計算樣品的FRAP值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對單因素試驗數(shù)據(jù)進行處理并作圖，使用SPSS單因素ANOVA檢驗中的最小顯著差異（least significant difference，LSD）法和鄧肯法進行顯著性分析，顯著性水平p＜0.05。運用Design-Expert 8.0中的Plackett-Burman試驗設(shè)計和Box-Behnken中心試驗設(shè)計對試驗結(jié)果進行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素的標準曲線

原花青素提取量與吸光度之間的標準曲線如圖1所示。原花青素濃度在0～20 μg/mL時，吸光度與原花青素濃度之間線性關(guān)系良好，線性方程為：y=16.65x+0.010 7（R2=0.999 1，n=3）。

圖1 原花青素的標準曲線Fig.1 Procyanidins standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響

超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響見圖2。

圖2 超聲功率和超聲時間對PSPc提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction content of PSPc

由圖2可知，PSPc提取量隨超聲功率呈先增大后減少的趨勢，在160 W時提取量最高為168.95 mg/g，并顯著高于其它功率時的提取量。超聲功率的增大可使花生紅衣細胞破碎程度增加，有利于PSPc的溶出，使提取量逐漸增高；而隨著功率繼續(xù)增大，超聲熱效應(yīng)積累的熱量增多，使原花青素遇熱氧化和降解，導(dǎo)致提取量降低[21]。由圖2可知，隨著超聲時間延長，PSPc提取量顯著增加，在10 min時為最高值174.95 mg/g，隨后呈顯著減少趨勢。這是因為隨超聲時間繼續(xù)延長，樣品中原花青素已基本溶出，但過度超聲處理會導(dǎo)致PSPc結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并有其他干擾物質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取量降低。因此，本試驗認為超聲功率選擇160 W，超聲時間選擇10 min，較為合適。

2.2.2 微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響

微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響見圖3。

圖3 微波功率和微波時間對PSPc提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power and microwave time on the extraction content of PSPc

微波具有破壞細胞組織，加速組織內(nèi)物質(zhì)溶出的作用[14]。由圖3可知微波功率為240 W時，提取量達最大為157.54 mg/g，之后隨著功率的增大，PSPc提取量快速下降。這是因為微波功率過大，會破壞原花青素的穩(wěn)定性，導(dǎo)致提取量的降低。在微波處理90 s時，提取液中原花青素含量最大為164.75 mg/g，隨后呈下降趨勢，當微波時間超過120 s后，呈顯著下降趨勢。這是由于一定體積溶液中PSPc的溶解度是一定的，伴隨微波作用對花生紅衣組織的不斷破壞，使得PSPc溶解加快，開始PSPc溶解含量逐漸增加，當原花青素的溶解量已經(jīng)達到最大后，繼續(xù)延長時間，反而會引起溶液局部溫度升高，破壞了PSPc的結(jié)構(gòu)，使提取量下降[22-23]。因此，本試驗中微波功率選擇240 W，微波時間選擇90 s，較為合適。

2.2.3 浸提溫度、乙醇體積分數(shù)和料液比對PSPc提取量的影響

浸提溫度、乙醇體積分數(shù)和料液比對PSPc提取量的影響如圖4所示。

圖4 浸提溫度、乙醇體積分數(shù)和料液比對PSPc提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature,ethanol volume fraction and material/liquid ratio on the extraction content of PSPc

由圖4可知，當浸提溫度為50℃時，PSPc提取量達到最大201.06 mg/g，然后隨溫度的升高，PSPc的提取量逐漸下降。溫度的升高可增大溶劑分子的布朗運動，使得溶劑與PSPc相互接觸更快更充分，所以浸提溫度達到50℃后繼續(xù)升高浸提溫度，高溫會破壞PSPc結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PSPc提取量下降[18]。PSPc的提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加，當乙醇體積分數(shù)為70%時，PSPc提取量最高達201.32 mg/g，之后繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，PSPc提取量反而下降。因為不同體積分數(shù)的乙醇溶液極性不同，而PSPc具有一定極性，所以導(dǎo)致PSPc對不同體積分數(shù)的乙醇溶液有不同的選擇性與溶解性。當料液比為1∶40（g/mL），PSPc的提取量最大。這是由于提取溶劑的增加可以溶解更多的PSPc，被提取的量也就越多；當PSPc的溶解速率達到平衡點之后，繼續(xù)增加提取溶劑反而降低了提取效率，還增加提取成本，給后續(xù)的純化工作造成不必要的麻煩。因此，本試驗選擇浸提溫度50℃、乙醇體積分數(shù) 70%、料液比 1∶40（g/mL）。

2.3 Plackett-Burman試驗結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計對影響PSPc提取效果的因素進行顯著性分析，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，試驗結(jié)果方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman試驗方案和結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Plackett-Burman design

由表5 PB試驗結(jié)果方差分析可知，該試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著（p＜0.01）。結(jié)合單因素試驗與PB試驗結(jié)果可知，微波功率（C）、乙醇體積分數(shù)（E）、料液比（G）對PSPc提取量影響顯著 （p＜0.05），顯著性大小排序為料液比（G）＞微波功率（C）＞乙醇體積分數(shù)（E），所以選擇微波功率（C）、乙醇體積分數(shù)（E）和料液比（G）進行響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計試驗；而超聲功率（A）、超聲時間（B）、微波時間（D）、浸提溫度（F）4個因素對原花青素提取量影響不顯著（p＞0.05），所以在后續(xù)試驗中將其固定為160 W、10 min、90 s、50℃。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Response surface test design and results

利用Design-Expert 8.0對表6中的數(shù)據(jù)進行方差分析和回歸分析，對試驗結(jié)果進行擬合。以乙醇體積分數(shù)（E）、微波功率（C）和料液比（G）為自變量，擬合得到回歸方程：PSPc提取量=184.20-7.67E+0.883 8C+7.47G-1.33EC+4.41EG-1.41CG-5.85E2-12.62C2+2.35G2。

回歸方程的方差分析見表7。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

由表7可看出，整個回歸模型極顯著（p＜0.000 1），相關(guān)決定系數(shù)R2=0.976 5，校正系數(shù)R2Adj=0.946 4，失擬項檢驗不顯著（p=0.603 4＞0.05），說明該模型的擬合性較好，且真實有效，能夠較好地反映3個變量之間的關(guān)系。乙醇體積分數(shù)和料液比對提取量有極顯著影響（p＜0.01）。乙醇體積分數(shù)（E）與料液比（G）有顯著交互作用（p＜0.05）。

2.4.1 響應(yīng)面交互作用分析

交互作用對PSPc提取量影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 交互作用對PSPc提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of the effect of interaction terms on extraction amount of PSPc

響應(yīng)面3D曲面圖反映兩兩因素之間對響應(yīng)值的影響作用，其中3D曲面圖越陡峭，說明兩因素之間交互作用越明顯[24]。從圖5可以看出乙醇體積分數(shù)和料液比之間交互作用顯著（p＜0.05），其余兩兩因素之間交互作用不顯著（p＞0.05）。該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.4.2 最優(yōu)提取工藝參數(shù)及驗證

通過利用Design-Expert 8.0設(shè)計分析得到的超聲-微波協(xié)同提取原花青素最佳工藝為提取方案為乙醇體積分數(shù)68.75%、微波功率241.17 W、料液比1∶39（g/mL），預(yù)測 PSPc提取量為 189.59 mg/g。結(jié)合實際操作，修正為：乙醇體積分數(shù)70%、微波功率240 W、料液比 1∶40（g/mL）。此時 PSPc提取量為 186.38 mg/g，相對標準偏差為1.7%，說明模型有效。

2.5 不同提取方法對PSPc提取量及其抗氧化性的影響

不同提取方法對PSPc的提取效率和生物活性會產(chǎn)生不同的影響[25]，對提取產(chǎn)物中PSPc的提取量和抗氧化性進行了分析，結(jié)果如表8所示。

表8 提取方式對PSPc提取量和抗氧化性影響Table 8 The effect of extraction method on PSPc content and oxidation resistance

從表8可以看出，超聲波輔助提取法的PSPc提取量最低為90.46 mg/g，超聲-微波協(xié)同提取的效率最高，PSPc提取量高達186.38 mg/g，顯著高于微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和溶劑提取法（p＜0.05）。

水浴提取的PSPc羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和FRAP值，均顯著低于其它幾種提取方式（p＜0.05）；微波輔助提取PSPc的DPPH自由基清除率和FRAP值，均顯著高于其它幾種提取方式（p＜0.05）；超聲-微波協(xié)同提取PSPc的DPPH自由基清除率顯著高于超聲波水浴法，F(xiàn)RAP值顯著高于超聲波法、水浴法、超聲波水浴法和乙醇法。綜上表明，超聲-微波協(xié)同提取法在獲得PSPc最大提取量的同時，還具有較好的抗氧化活性。因此，超聲-微波協(xié)同提取PSPc是一種較好的提取方法，可以為PSPc的工業(yè)化應(yīng)用提供一種新的提取思路。

3 結(jié)論

本研究綜合單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計，篩選出對PSPc提取具有顯著影響的因素，在此基礎(chǔ)上用Box-Behnken試驗設(shè)計對超聲-微波協(xié)同提取PSPc的工藝進行優(yōu)化研究，得出超聲-微波協(xié)同輔助乙醇提取PSPc的最佳工藝為：超聲功率160 W、超聲時間10 min、微波功率240 W、微波時間90 s、乙醇體積分數(shù)70%、浸提溫度50℃、浸提時間20 min、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下，原花青素的提取量可達到186.38 mg/g，同時，優(yōu)化后的超聲-微波協(xié)同提取量顯著高于其他方法（p＜0.05），且有較好的抗氧化活性。該研究可以為花生紅衣中提取原花青素提供一定的理論參考。