植物源香辛料對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果比較

張學(xué)杰，齊丹華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

人類使用可食用香辛料對(duì)食物進(jìn)行加工調(diào)味的歷史非常久遠(yuǎn)。科學(xué)研究表明，許多香辛料除了調(diào)味外，還具有殺菌作用，包括姜、花椒、大蒜、牛至、肉桂、丁香、茴香等[1-8]。已有的大部分研究集中在表征香辛料的最低抑菌濃度，但結(jié)果差別較大，如宋麗雅等[9]發(fā)現(xiàn)花椒提取物對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為10mg/mL。吳周和等[10]發(fā)現(xiàn)八角的醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為12.5、25 mg/mL。MEHDI等[11]評(píng)估了檸檬香茅混合精油與牛至混合精油對(duì)食源致病菌的殺菌效果，認(rèn)為兩者在大腸桿菌抑制上效果相近，最低抑菌濃度均為3.4 mg/L左右。也有一部分研究報(bào)道了不同香辛料在食源性致病菌上的殺菌效果如抑菌圈大小，結(jié)果亦相差較大，王海燕等[1]研究認(rèn)為陳皮對(duì)食源性致病菌抑菌效果最弱，香果、香葉和沙姜的抑菌作用相當(dāng)。梁穎等[12]研究認(rèn)為草果的醇提物抗菌效果最好，其次為桂皮、八角的醇提物，茴香、香葉、陳皮的醇提物對(duì)大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抗菌效果較差。究其原因，在于影響香辛料殺菌能力的因素較多，如香辛料種類及來(lái)源、提取與作用條件、作用對(duì)象等，李永梅等[2]報(bào)道同一香辛料不同部位的抑菌效果不同，BIN等[13]研究認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌對(duì)食用香料提取物更敏感，其中大腸桿菌抗性最強(qiáng)。眾所周知，E.coli O157：H7是主要人體病原微生物之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致急性腎衰竭而造成死亡。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)E.coli O157：H7的食用香辛料殺菌效果報(bào)道較少，尚缺乏常見(jiàn)香辛料對(duì)E.coli O157：H7殺菌效果的評(píng)估，而香辛料來(lái)源的影響亦未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)開(kāi)展不同來(lái)源的常見(jiàn)食用香辛料包括茴香、八角、花椒、麻椒、芥末、丁香等醇提取物對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果的評(píng)估，明確具有較強(qiáng)殺菌作用的香辛料的種類及其作用條件，并探討不同來(lái)源對(duì)香辛料殺菌效果的影響，研究結(jié)果對(duì)于香辛料在食品安全保障方面的利用與開(kāi)發(fā)將有所裨益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八角、丁香、桂皮、茴香、芥末、花椒、麻椒、香葉共21份香辛料：市售，其中1、2、3號(hào)茴香分別產(chǎn)自河南、甘肅、河北；4、5、6、7 號(hào)八角均產(chǎn)自廣西；8、10 號(hào)桂皮產(chǎn)自廣西，9號(hào)桂皮產(chǎn)自北京；11、12號(hào)丁香分別產(chǎn)自河北、北京；13、14號(hào)麻椒產(chǎn)自四川；15、16號(hào)花椒分別產(chǎn)自陜西、四川；17號(hào)香葉產(chǎn)自廣西，18號(hào)香葉產(chǎn)自吉林；19、20號(hào)芥末產(chǎn)自廣東，21號(hào)芥末產(chǎn)自遼寧。

E.coliO157：H7菌株 GIMCC1.334 和GDMCC1.707：廣東省微生物研究所；E.coli O157：H7菌株CICC 21530：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 （tryptic soy agar，TSA）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京江晨公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、95%乙醇：北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水試多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DK-98-1水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；HFsafe-1200LC型生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；H1850R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 E.coli O157：H7母液的制備

采用接種環(huán)，分別挑接E.coliO157：H7菌株GIMCC 1.334、GDMCC1.707和CICC21530于盛有10 mL TSB的無(wú)菌離心管中，37℃培養(yǎng)24 h，離心，去掉上清液，加入10mL 0.1% BPW，懸混。將3管菌液轉(zhuǎn)入50 mL無(wú)菌離心管混勻，即為E.coli O157：H7母液，濃度約為9 lg（CFU/mL），保藏于 4℃冰箱。使用時(shí)，取 1 mL E.coli O157：H7母液，加入到 9 mL BPW 中，混勻，依次稀釋母液得到初始菌量約為 6、5、3 lg（CFU/mL）的工作菌液，待測(cè)。

1.3 香辛料提取物的制備

將21份香辛料各取10 g用干磨機(jī)磨成粉末狀，然后各取1 g分別置于100 mL錐形瓶中，采用95%乙醇90℃提取3 h，過(guò)濾，濾液置于20 mL試管中，將兩次提取液合并至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，減壓蒸干，底物即為香辛料提取物（spice extract，SE）。采用DMSO溶解SE，并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，共得到5 mL提取液，于4℃冰箱中存放。重復(fù)3次。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.4.1 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

21份香辛料提取物各取0.5mL，分別加入到0.5mL約為5 lg（CFU/mL）的工作菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對(duì)照組為0.5 mL DMSO處理1 h。每個(gè)處理重復(fù)3次，待測(cè)。

1.4.2 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 min對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

根據(jù)1.4.1結(jié)果，分別取殺菌效果較好的香辛料提取物0.5 mL加入到0.5 mL初始菌量約為9lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 min。對(duì)照組同1.4.1，處理時(shí)間1 min。每個(gè)處理重復(fù)3次，待測(cè)。

1.4.3 體積分?jǐn)?shù)為9.1%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

分別取1.4.2中的香辛料提取物0.1 mL加入1 mL初始菌量約為6lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對(duì)照組為0.1 mL DMSO處理。每個(gè)處理重復(fù)3次，待測(cè)。

1.4.4 體積分?jǐn)?shù)為1.0%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

分別取1.4.2中的香辛料提取物0.01 mL加入0.99 mL初始菌量約為3 lg（CFU/mL）的菌液中混勻，室溫（25℃）下處理1 h。對(duì)照組為0.01 mL DMSO處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，待測(cè)。

1.4.5 E.coli O157：H7檢測(cè)方法

試驗(yàn)中的每個(gè)處理做不同稀釋梯度，各取0.1 mL涂TSA板，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究的試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，平均數(shù)之間的多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果見(jiàn)圖1。

圖1 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.1 Effect of 50% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

圖1表明，體積分?jǐn)?shù)為50%的香辛料提取物處理1 h均表現(xiàn)出一定的殺菌能力，殺菌能力差異顯著（p＜0.05），其中丁香和八角的提取物具有較強(qiáng)的殺菌能力，均能夠殺滅至少 5 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。左勇等以抑菌圈為指標(biāo)研究認(rèn)為芥末對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等具有明顯的抑菌作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與其它香辛料相比，芥末提取物殺滅E.coli O157：H7的效果不理想，3個(gè)不同來(lái)源的芥末產(chǎn)品提取物處理1 h平均只能殺滅 2.47 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。李永梅等以抑菌圈為指標(biāo)，研究認(rèn)為肉桂的抑菌能力最強(qiáng)，花椒籽和花椒殼次之，小茴香的抑菌效果最差[2]。李京晶等采用水蒸氣蒸餾法提取的肉桂揮發(fā)油與其主要成分肉桂醛表現(xiàn)出的抗菌活性比丁香揮發(fā)油及其主要成分丁香酚強(qiáng)[15]。本研究結(jié)果未能予以充分支持，這可能與研究指標(biāo)、方法或原料不同有關(guān)。圖1表明，產(chǎn)地來(lái)源不同對(duì)某些香辛料的殺菌能力有影響，如茴香、桂皮（p＜0.05）。眾所周知，香辛料的殺菌能力與其殺菌成分及含量有關(guān)[16-19]，香辛料精油中的萜類以及脂肪族、芳香族揮發(fā)性成分是香辛料中主要的抗菌物質(zhì)，如丁香酚、肉桂醛、α-蒎烯等[16]，從本研究結(jié)果來(lái)看，產(chǎn)地的影響是存在的，但產(chǎn)地對(duì)上述香辛料殺菌成分與含量的影響及成分間的協(xié)同作用等研究甚少，值得深入開(kāi)展。

2.2 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 min對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 min對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果見(jiàn)圖2。

圖2 體積分?jǐn)?shù)為50%的SE處理1 min對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.2 Effect of 50% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 min

圖2表明，在高濃度菌液情況下，體積分?jǐn)?shù)為50%的丁香提取物處理1 min可至少殺滅8.8 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，表明丁香提取物具有很強(qiáng)的殺菌能力，這與MOREIRA等的研究一致[20]。謝強(qiáng)等研究了6種食用香辛料提取物對(duì)4株食源性致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌）的影響，認(rèn)為肉桂、香葉和八角抑菌活性最強(qiáng)[21]。本研究中不同產(chǎn)地來(lái)源的八角表現(xiàn)出不同的殺菌能力（p＜0.05），其中7號(hào)八角提取物殺菌能力最強(qiáng)，體積分?jǐn)?shù)為50%的7號(hào)八角提取物處理1 min可殺滅至少8.8 lg（CFU/mL）E.coliO157：H7，其次為6號(hào)八角，可殺滅6.6lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，4號(hào)與 5號(hào)八角提取物能殺滅約 5.3 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，這顯然與八角中的殺菌成分含量有關(guān)。大部分研究指出茴香腦是賦予八角抑菌能力的主要活性物質(zhì)[22]，但張赟彬等研究顯示八角中的3種單體抑菌成分（大茴香醛、檸檬烯、反式茴香腦），在相同濃度條件下，檸檬烯對(duì)大腸桿菌的抑菌作用相對(duì)顯著[23]，黃明泉等從廣西6個(gè)地區(qū)的八角精油中檢出45種化合物，其中有19種揮發(fā)性成分不同[24]。丁香的殺菌成分主要是丁香酚[15，25]，但丁香中還有其它成分也具有殺菌作用[26]。殺菌成分差異的原因與很多因素有關(guān)，如原料品種、種植地域、栽培措施、采后干燥處理方法等都會(huì)對(duì)殺菌成分造成影響，因而在香辛料殺菌利用研究及工業(yè)化上需要對(duì)上述影響因素予以重視。

2.3 體積分?jǐn)?shù)為9.1%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分?jǐn)?shù)為9.1%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果見(jiàn)圖3。

圖3 體積分?jǐn)?shù)為9.1%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.3 Effect of 9.1% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

MOREIRA等比較了常用香精油如迷迭香、藍(lán)桉、丁香、牛至、羅勒、歐薄荷等對(duì)E.coli O157：H7的殺滅濃度，認(rèn)為丁香效果最好[20]。由圖3可知，體積分?jǐn)?shù)為9.1%的丁香與八角提取物處理E.coli O157：H7 1 h后，11號(hào)丁香提取物可殺滅至少6 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7，其次為12號(hào)丁香提取物，可殺滅至少5 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7；而八角提取物平均只能殺滅 2.46 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。盡管丁香提取物的殺菌效果顯著高于八角提取物的殺菌效果（p＜0.05），但體積分?jǐn)?shù)為9.1%時(shí)不同產(chǎn)地來(lái)源的丁香提取物在殺菌數(shù)量上未表現(xiàn)出顯著差異（p＞0.05），八角提取物亦是如此。對(duì)于八角提取物，相較于50%體積分?jǐn)?shù)，體積分?jǐn)?shù)為9.1%的7號(hào)八角提取物的殺菌能力下降，顯然是其殺菌成分濃度不足或殺菌成分的協(xié)同作用不足造成的。

2.4 體積分?jǐn)?shù)為1.0%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果

體積分?jǐn)?shù)為1.0%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果見(jiàn)圖4。

圖4 體積分?jǐn)?shù)為1.0%的SE處理1 h對(duì)E.coli O157：H7的殺菌效果Fig.4 Effect of 1.0% SE by volume on population of E.coli O157：H7 in 1 h

圖4表明，體積分?jǐn)?shù)為1.0%的八角與丁香提取物分別處理E.coliO157：H71h，殺菌效果不明顯（p＞0.05）；同時(shí)，不同來(lái)源的丁香與八角之間在殺菌效果上均未表現(xiàn)出顯著差異（p>0.05），表明當(dāng)八角及丁香醇提取物體積分?jǐn)?shù)降至1.0%時(shí)，殺菌作用已不明顯。

總的來(lái)說(shuō)，影響香辛料殺菌的因素很多，包括香辛料種類與產(chǎn)地甚至部位、殺菌物質(zhì)的提取與純化方法、作用條件、目標(biāo)菌的屬種等。在研究及應(yīng)用中，需要系統(tǒng)考慮相關(guān)因素的影響，只有這樣才能形成香辛料對(duì)目標(biāo)菌殺菌能力的客觀認(rèn)識(shí)，才能充分開(kāi)發(fā)利用香辛料的殺菌功能為食品安全做出更大的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究中殺菌效果最好的香辛料為丁香，其次為八角。采用體積分?jǐn)?shù)為9.1%的丁香提取物處理1 h可殺滅 E.coli O157：H7 5 lg（CFU/mL）以上，如采用體積分?jǐn)?shù)50%丁香提取物處理，則1min可殺滅E.coliO157：H7 8.8 lg（CFU/mL）以上。芥末提取物殺滅E.coli O157：H7的效果不理想，3個(gè)不同芥末產(chǎn)品醇提取物采用50%體積分?jǐn)?shù)處理1 h平均殺滅2.47 lg（CFU/mL）E.coli O157：H7。產(chǎn)地來(lái)源對(duì)某些香辛料的殺菌能力有影響，如茴香、桂皮、八角，或是因?yàn)槌煞趾坑胁町悾蚴浅煞珠g存在協(xié)同作用等，相關(guān)研究工作值得進(jìn)一步開(kāi)展。