自擬補氣活血方治療氣虛血瘀模型大鼠的血液學(xué)評價*

許家偉

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，氣虛血瘀證作為老年心血管疾病的多發(fā)證型，尤其不能被忽視［1］?！八幨惩础笔枪湃嗽谑澄锖退幬锏陌l(fā)現(xiàn)中總結(jié)的智慧［2］。補氣活血方作為藥食同源類藥方，是由諸多具有補氣、補血、活血化瘀等功效的藥物相互配伍組成的，用以補中益氣、活血生津、通經(jīng)活絡(luò)，其藥效功能對氣虛血瘀證有著良好的作用［3-4］。本研究旨在研究自擬補氣活血方在不同劑量下對氣虛血瘀證大鼠的血液學(xué)評價。

1.2 材料、試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司；RMPI-1640購自Gbico公司；LipofectamineTM 2000 購自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；抗LDH抗體購自Abcam公司；抗GAPDH抗體購自CST公司；GV219-PTEN(PTEN-OE)及對照質(zhì)粒(NC)由吉凱生物技術(shù)公司構(gòu)建；LDH、LD試劑盒購自南京建成生物工程研究所；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A及實驗儀器由上海交通大學(xué)第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室提供。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠180只，雌雄各半，體重180～220 g，由本溪長生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物房飼養(yǎng)，動物使用許可證號SYXK（遼）2013-0009。

2014年5月，為認(rèn)真貫徹落實黨的十八大和十八屆三中全會精神，加強基層服務(wù)型黨組織建設(shè)，中共中央辦公廳印發(fā)了《關(guān)于加強基層服務(wù)型黨組織建設(shè)的意見》，這是對基層黨組織功能定位的深化，是基層黨組織建設(shè)工作思路創(chuàng)新和方式方法轉(zhuǎn)型的必由之路，具有十分重要的意義〔1〕。

1.2 藥材制備

補氣活血方（人參10 g，甘草10 g，淮小麥20 g，大棗10 g，姜黃10 g，當(dāng)歸10 g，山藥15 g，炒山楂15g），補陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，川芎3 g，地龍3 g）。分別將補氣活血方與補陽還五湯中各味藥混合后在水中浸泡1h，后加至10倍量水煎煮1 h，濾去煎煮液備用。再添入8倍量水，煎煮1 h后收集煎煮液，與第一次煎煮液合并濃縮［5］，制備出高劑量補氣活血方1.25 g／ml與陽性對照藥補陽還五湯1.45 g／ml，高劑量稀釋后可得到0.625 g／ml、0.3125 g／ml中低劑量藥物。

1.3 試劑

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（±s）表示，各組間的比較采用單因素方差分析ANOVA的LSD-t檢驗分析，P≤0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 儀器

1.5.3 血液流變學(xué)測定

1.5 方法

1.5.1 氣虛血瘀模型的制備及給藥

將雌雄各半的大鼠隨機分為6組，空白組、模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。每組30只，除空白組外，均采用饑餓、勞累、寒冷相結(jié)合的方式復(fù)制氣虛血瘀模型。造模前，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。造模時，除空白組正常飲食飲水外，其余各組每天限制以40 g／kg給予飼料［6］，并將大鼠放入水溫14～16℃，水深（35±5）cm，直徑為50 cm的水桶中進(jìn)行游泳，以每組大鼠自然沉降沒入水中不能自主上浮為其疲憊標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)全組有50%出現(xiàn)自然沉降時，全組停止游泳撈出，使之暴露于空氣中自然晾干［7］，不予擦拭。給藥組每天按照10 ml／kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃，空白組給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃60天，取血前一天禁食24 h，不禁水。

在車牌定位時，當(dāng)遇到整張圖片較為昏暗或者轉(zhuǎn)化為灰度圖像后區(qū)分度不高等情況時，使用OTSU算法，就會出現(xiàn)二值化后車牌區(qū)域值為0，即為黑色，導(dǎo)致車牌定位失敗。此外，由于車牌定位主要基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)運算，運用腐蝕膨脹操作，如果圖片中也有二值化后白色像素點比較密集的地方，可能會被誤判為車牌區(qū)域。

全血黏度：60天模型組相對于空白組提升明顯，陽性對照組與中高劑量組相對模型組下降明顯，低劑量組相對模型組有下降趨勢。血漿黏度：60天模型組相對空白組有明顯提升，高、中、低劑量組相對模型組明顯下降。見表1。

腹主動脈采血于肝素鈉和檸檬酸鈉采血管內(nèi)。取60天大鼠心臟用10%氯化鉀溶液沖洗，使其充分舒張。切取心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定［8］。

半自動血液流變儀LBY-N6K，（北京普利生儀器有限公司）；Sysmex CA510型全自動血凝分析儀（日本Sysmex株式會社）；酶標(biāo)儀（美國伯樂Bio-Rad公司）。

將1.5.2中肝素鈉采血管輕輕上下震蕩，使血液產(chǎn)生抗凝作用，用血液流變儀測定全血黏度和血漿黏度。

1.5.4 凝血四項測定

HE染色結(jié)果顯示，空白組心肌組織為正常心肌組織，心肌細(xì)胞橫紋清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)內(nèi)未見血管擴張及炎性細(xì)胞的浸潤。而在模型組中，可見心肌結(jié)構(gòu)破壞、紊亂、纖維增生。低劑量組心肌細(xì)胞損傷程度較模型組明顯減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體規(guī)整，可見少量的纖維化改變，但無明顯大片纖維化病灶形成。中高劑量組心肌細(xì)胞纖維化程度進(jìn)一步減輕，未見明顯纖維化改變。見圖1。

1.5.5 PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量測定

將1.5.4中血漿按照ELISA試劑盒步驟操作，并用酶標(biāo)儀測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測物質(zhì)濃度。

園林花卉的栽培與管理對于園林景觀的構(gòu)成與造景具有重要影響。因此，需要利用科學(xué)的栽培技術(shù)并加強對栽植花卉的日常管理，從而確?；ɑ苌L良好。因此，需要通過合理種植、科學(xué)的水肥管理及病蟲害防治，以保證花卉的安全性及經(jīng)濟(jì)效益。

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)方法

PT測定試劑盒（批號：1905048）、FIB測定試劑盒（批號：1905010）、TT測定試劑盒（批號：1905079）、APTT測定試劑盒（批號：1905026）、氯化鈣、希森美康清洗液購于上海長島生物技術(shù)有限公司。凝血片段F1＋2測定試劑盒、谷氨酸羧化酶測定試劑盒、PIVKA-Ⅱ測定試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科 技 有 限 公 司（批 號：ml204917、ml059265、ml601445）。

2 結(jié) 果

2.1 心臟病理形態(tài)變化

將1.5.2中檸檬酸鈉采血管輕輕上下震蕩，使血液產(chǎn)生抗凝作用，冷凍離心15 min使血漿分離出，使用全自動血凝分析儀分析，剩余血漿吸入EP管內(nèi)，－80℃保存。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.2 血液流變學(xué)變化

1.5.2 標(biāo)本采集

表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)（±s，n＝10）

表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 全血黏度／（mpa／s）3-1 60-1 200-1 血漿黏度150-1／（mpa／s ）空白組18.80±2.76 5.86±0.81 4.35±0.77 1.46±0.08模型組 14.32±1.04＃＃ 4.71±0.93＃＃ 3.23±0.47＃＃ 1.13±0.14＃＃陽性對照組 16.19±1.20** 5.61±0.72* 3.84±0.37** 1.23±0.05*低劑量組 15.13±1.27 5.03±0.51 3.67±0.41* 1.21±0.06*中劑量組 16.04±1.71* 5.53±0.67* 3.73±0.27** 1.28±0.02**高劑量組 16.36±1.67** 5.66±0.43** 3.96±0.25** 1.31±0.11**

2.3 大鼠凝血四項指標(biāo)觀察

氣虛血瘀證動物模型是中醫(yī)理論中一種常見的證候模型。“氣為血之帥”，氣能行血，氣虛不能充分推動血液運行以致血行不暢而瘀滯，或氣不行津，導(dǎo)致痰飲水濕停聚，而間接產(chǎn)生血流受阻致瘀，則發(fā)展為氣血同病、氣虛血瘀（因虛致瘀）?！把獮闅庵浮?，血能生氣，血瘀則臟腑失養(yǎng)、生氣乏源，亦能致使氣虛，表現(xiàn)為氣血同病、氣虛血瘀（因瘀致虛）［9］。所以造模時從上述兩個方向入手，“饑則損氣”“勞則耗氣”可通過勞累加饑餓的方式以達(dá)到因虛致瘀［10］，再通過寒涼的方式來達(dá)到因瘀致虛，多因素共同影響來營造氣虛血瘀模型。

表2 60天大鼠凝血四項指標(biāo)變化情況

2.4 大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量測定

大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ：模型組含量相對空白組明顯升高，藥物組含量在60天相對于模型組明顯降低；谷氨酸羧化酶：模型組含量相對于空白組明顯下降，藥物組含量相對模型組明顯提升；F1＋2片段：模型組相較于空白組含量在20天明顯上升，在40天和60天含量明顯下降；藥物組在40天和60天相較于模型組均明顯上調(diào)。見表3～5。

表3 大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ含量

表4 大鼠中血漿谷氨酸羧化酶含量

表5 大鼠血漿中中F1＋2片段含量

3 討 論

60天模型組相較于空白組PT與APTT上升明顯，F(xiàn)IB在40天后明顯下降，TT有上升趨勢。藥物組在60天均對PT和APTT有明顯下調(diào)作用，中高劑量組FIB上調(diào)明顯，TT相較模型組有回落趨勢，見表2。

將冷凍的胰臟置于4℃冰箱中解凍，待樣品將要完全解凍時從頭、體、尾三個部位剪取約0.5 g左右的胰腺，并用分析天平準(zhǔn)確稱重。按質(zhì)量體積比1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)在玻璃勻漿器中勻漿(整個操作過程都在冰浴條件下進(jìn)行)。充分勻漿后將勻漿液倒入離心管中3 000 r/min 4℃條件下離心10 min，收集上清并迅速將上清液分裝成若干份貯存于-20℃中，以備進(jìn)行酶活性分析。

血液流變學(xué)是判斷血液黏稠度的重要指標(biāo)。本實驗全血及血漿黏度明顯下降，APTT和PT明顯上升，F(xiàn)IB明顯降低等數(shù)據(jù)表明，氣虛血瘀模型大鼠處于低凝低黏的狀態(tài)，為陳可冀［11］血瘀證分類中的血瘀證Ⅱ型，與李雅君［12］龐樹齡等結(jié)果一致。部分疾病屬于這一類型，主要表現(xiàn)為血液黏度低、血漿蛋白等有形成分不足，或者某一凝血功能不足等，常見貧血癥、部分月經(jīng)病、肝硬化等。

凝血四項是臨床上血栓性疾病的常用檢查指標(biāo)之一，是反映機體凝血功能正常與否，從而判斷是否有血液疾病及肝病的嚴(yán)重程度的重要手段［13］。在凝血四項結(jié)果中模型組PT在20天前有明顯下降，在40天、60天時明顯上升，F(xiàn)IB一直呈上升趨勢，這種PT與APTT異常轉(zhuǎn)換可能是其他因素影響下的結(jié)果。肝臟作為機體的主要產(chǎn)熱單位，在機體遇到寒冷時會主動進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，不斷產(chǎn)生熱量，長久以來會造成損傷，進(jìn)入失代償期。并且饑餓情況下肝部代謝功能降低，缺乏對維生素K的吸收與補充，導(dǎo)致凝血功能異常，通過APTT升高和PT升高推斷是維生素K缺乏導(dǎo)致，并且APTT和PT在20天時的表現(xiàn)與40天和60天相反，F(xiàn)IB表現(xiàn)降低預(yù)測模型大鼠有DIC前期高凝期和中期消耗性低凝期的表現(xiàn)［14］。

為了驗證上述推測，接著測定血漿中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶［15］、F1＋2片段含量［16］。模型組相較于空白組PIVKA-Ⅱ明顯升高、谷氨酸羧化酶明顯降低，表明機體內(nèi)肝功能下降導(dǎo)致維生素K含量不足，營養(yǎng)不良。F1＋2片段在20天有提升，在40天和60天有明顯下降，結(jié)合凝血四項APTT先由20天的升高變?yōu)?0天、60天的顯著降低來推測體內(nèi)先有微血栓的生成，后面隨著肝臟功能負(fù)荷逐漸加重，出現(xiàn)DIC的中期的溶解表現(xiàn)，表明血栓的生成與溶解過程，而補氣活血方及陽性藥物組都可以顯著改善這幾個指標(biāo)狀況。

在傳統(tǒng)教學(xué)中英語教師在施教過程中往往采用填鴨式的教學(xué)，教師關(guān)注學(xué)生的筆試多一點而輕視學(xué)生的聽說能力培養(yǎng)。在新課程理念的指引下，小學(xué)英語教師應(yīng)試著從傳統(tǒng)的教學(xué)形式中解脫出來，改進(jìn)教學(xué)方式和方法，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。但這些愿望的實現(xiàn)需要相關(guān)的政策支持與指導(dǎo)。

水資源規(guī)劃與規(guī)劃水資源論證的最大不同應(yīng)體現(xiàn)在“論證”二字，水資源規(guī)劃是創(chuàng)造性地提出區(qū)域水資源的相應(yīng)規(guī)劃措施，而規(guī)劃水資源論證重點是對規(guī)劃已有內(nèi)容的一個分析，雖然都涉及水資源配置、水資源管理等內(nèi)容，但報告編制的概念、工作內(nèi)容的深度應(yīng)有所區(qū)別，規(guī)劃水資源論證在提出相關(guān)規(guī)劃調(diào)整、修改的結(jié)論上不應(yīng)達(dá)到水資源規(guī)劃的深度。

綜上所述，本研究成功復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)具有維生素K缺乏（營養(yǎng)不良）、心肌輕微纖維化、DIC前中期表現(xiàn)，并推斷可誘發(fā)心功能及肝功能受損等癥狀。而補氣活血方可以顯著改善上述狀態(tài)，并且對肝臟起到了明顯的保護(hù)作用。驗證了補氣活血方對治療低凝狀態(tài)下氣虛血瘀證有著很好的療效。