小腸結(jié)腸炎綜合征小鼠腸黏膜中NLRP3表達(dá)與炎癥分子關(guān)系的研究

李娟，袁向飛，趙煜△

食物蛋白誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎綜合征（food protein-induced enterocolitis syndrome，F(xiàn)PIES）是一種非免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的胃腸道過敏性疾病，通常表現(xiàn)為攝入特定食物后的延遲性胃腸道癥狀［1］。該病主要患病群體為嬰幼兒，多由牛奶或大豆蛋白引起，其他食物也可觸發(fā)。FPIES 臨床分為急性和慢性。急性FPIES患兒在4 h內(nèi)反復(fù)嘔吐，同時伴有水樣腹瀉；而慢性FPIES患兒通常發(fā)生在4月齡以下的嬰兒，出現(xiàn)間歇性嘔吐、慢性水樣腹瀉和一定時間內(nèi)的發(fā)育不全等癥狀。該病病情嚴(yán)重時可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)脫水、低血容量性休克及體質(zhì)量增加緩慢等臨床癥狀。慢性FPIES 在亞洲國家更為常見［2］。目前對于FPIES 發(fā)病機(jī)制存在較多爭議，仍缺乏有效的特異性診斷方法。該病易被誤診為急性病毒性腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎或膿毒癥等，常在發(fā)病數(shù)月后才被最終確診為FPIES。因此，早期診斷和及時有效的治療成為臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。炎癥小體作為固有免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。炎癥小體能夠識別病原相關(guān)分子，招募和激活促炎癥蛋白酶含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（CASP）-1，切割白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18前體分子，產(chǎn)生相應(yīng)的抗炎細(xì)胞因子，參與針對多種病原體的宿主防御反應(yīng)［3-4］。本研究通過FPIES 的小鼠模型，探討炎癥小體NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）在腸黏膜中的表達(dá)水平，明確其與腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β和IL-1β等炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性，闡述NLRP3作用下腸黏膜細(xì)胞焦亡的發(fā)生情況，為探索FPIES早期診斷及新的治療方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 6 周齡雄性清潔級BALB/c 小鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、DMEM 培養(yǎng)基、CO2培養(yǎng)箱、核酸蛋白檢測儀（美國Thermo Fisher 公司），青霉素、鏈霉素、膠原酶Ⅰ、卵清蛋白（OVA）、胰蛋白酶、尼日利亞菌素鈉鹽、麝香酮（美國Sigma 公司），弗氏完全佐劑（CFA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司），蛋白定量試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司），TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、CASP-1抗體（美國Proteintech 公司），CASP-4、CASP-5、消化道皮膚素D（GSDMD）抗體（美國Santa Cruz 公司）。倒置顯微鏡（日本尼康公司），SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國BIO-RAD公司），全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），低溫高速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 方法

1.2.1 FPIES小鼠模型的建立 配置致敏液，即2 mg的OVA溶解于100 μL無菌PBS和100 μL CFA中，存儲質(zhì)量濃度10 g/L。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為FPIES 組和對照組，每組10 只。FPIES 組注射致敏液200 μL，此后每隔2 d 注射相同劑量致敏液1次，共8次。第2周，以致敏液給小鼠灌胃，每隔2 d灌胃 1 次，共 5 次，OVA 總量達(dá)到 10 mg/只。灌胃 2 周后斷頸法處死小鼠，取腸組織待用。采用不含OVA的PBS和CFA混合液，以同樣流程處理對照組。

1.2.2 腸黏膜細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 將取出的腸組織放入PBS 中反復(fù)沖洗，剪開腸壁，清洗干凈后，將腸壁剪碎，放入膠原酶Ⅰ溶液（濃度1 g/L），37 ℃水浴中振蕩消化30 min。反復(fù)吹打消化混合物5 min，1 000 r/min 離心5 min，去除上清液，加入PBS，重懸浮組織沉淀物。重復(fù)相同條件離心處理3次后，將重懸浮的細(xì)胞沉淀移入含有10%胎牛血清的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2，飽和濕度。

1.2.3 小鼠腸黏膜細(xì)胞促炎模型制備 將上述對照組再分為激活組和激活對照組，F(xiàn)PIES 組再分為抑制組和抑制對照組。激活組中加入尼日利亞菌素鈉鹽激活NLRP3蛋白表達(dá)，按10 nmol/L 的終濃度處理24 h。抑制組為麝香酮10 nmol/L處理24 h 抑制NLRP3 蛋白表達(dá)。激活對照組和抑制對照組均為溶劑DMSO處理24 h。

1.2.4 qPCR檢測基因表達(dá) 各組腸黏膜細(xì)胞均按照RNA提取試劑盒的步驟提取細(xì)胞中的總RNA，并測定總RNA 的濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒實驗流程將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。NLRP3 引物：上游 5'-GGCAACACTCTCGGAGACAA-3'；下游5'-GGAAAGATCCCAGCAGCAGT-3'，產(chǎn)物大小 126 bp。GAPDH 引物：上游 5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3'；下游 5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'，產(chǎn)物大小146 bp。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Green Mix 10 μL，去離子水7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，使用相對定量2-ΔΔCt法計算各細(xì)胞樣品中目的基因的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)10次。

1.2.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入哺乳動物蛋白抽提劑提取總蛋白。抽提后的細(xì)胞液在4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照蛋白定量試劑盒的步驟，確定上清液中的蛋白濃度，然后用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，脫脂奶粉室溫封閉處理2 h。加入目的蛋白的一抗抗體，包括炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α 和細(xì)胞焦亡標(biāo)志分子CASP-1、CASP-4、CASP-5、GSDMD，4 ℃過夜。加入TBST 緩沖液，包含1 mol pH 7.5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris HCl）50 mL、NaCl 8 g、KCl 8 g、Tween-20為0.5 mg、水1 L，反復(fù)洗滌后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗滌3～4次，每次15 min。將膠片放入顯影液，顯影5 min，采用化學(xué)發(fā)光法曝光，并用Gel pro軟件進(jìn)行條帶定量分析。實驗重復(fù)10次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FPIES組和對照組小鼠腸道黏膜細(xì)胞NLRP3及炎癥因子表達(dá)水平 FPIES組腸黏膜細(xì)胞中NLRP3 mRNA（圖1）和蛋白表達(dá)水平及IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α蛋白表達(dá)水平高于對照組（P＜0.01），見表1。

Fig.1 Expression levels of NLRP3 mRNA in two groups of mice圖1 NLRP3 mRNA在2組小鼠中的表達(dá)情況

Tab.1 Expression levels of NLRP3 and other inflammatory factors in two groups of mice表1 2組小鼠的NLRP3及炎癥因子的表達(dá)情況（n=10，）

Tab.1 Expression levels of NLRP3 and other inflammatory factors in two groups of mice表1 2組小鼠的NLRP3及炎癥因子的表達(dá)情況（n=10，）

＊＊P＜0.01

組別對照組FPIES組t NLRP3 mRNA 1.01±0.06 7.08±1.51 12.701＊＊NLRP3蛋白1.01±0.07 3.31±0.89 8.104＊＊IL-1β蛋白1.03±0.03 31.93±2.99 32.640＊＊組別對照組FPIES組t IL-6蛋白1.03±0.03 66.79±3.55 58.588＊＊TGF-β蛋白1.16±0.19 42.89±3.49 37.701＊＊TNF-α蛋白1.16±0.19 38.02±6.22 18.725＊＊

2.2 FPIES小鼠腸道黏膜細(xì)胞焦亡通路分子表達(dá)情況 FPIES組腸黏膜細(xì)胞CASP-1、CASP-4、CASP-5、GSDMD表達(dá)水平高于對照組（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Expression levels of proteins related to pyroptosis in two groups of mice表2 2組小鼠腸道黏膜中細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的表達(dá)情況（n=10，）

Tab.2 Expression levels of proteins related to pyroptosis in two groups of mice表2 2組小鼠腸道黏膜中細(xì)胞焦亡相關(guān)分子的表達(dá)情況（n=10，）

＊＊P＜0.01

組別對照組FPIES組t CASP-1 1.02±0.05 26.98±3.35 7.758＊＊CASP-4 1.02±0.05 33.31±3.49 9.229＊＊CASP-5 0.97±0.07 55.97±10.33 16.836＊＊GSDMD 0.96±0.08 37.76±6.15 18.908＊＊

2.3 調(diào)控NLRP3 對小鼠模型腸黏膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的影響 激活組炎癥因子IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α及細(xì)胞焦亡標(biāo)志分子的CASP-1、CASP-4、CASP-5、GSDMD 蛋白水平較激活對照組升高（P＜0.01），見表3。抑制組炎癥因子TGF-β 和TNF-α蛋白水平較抑制對照組升高（P＜0.01），IL-1β、IL-6 及細(xì)胞焦亡標(biāo)志分子的CASP-1、CASP-4、CASP-5、GSDMD 表達(dá)水平與抑制對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

Tab.3 Effects of NLRP3 activation on the expression levels of inflammatory and pyroptosis proteins in two groups of mice表3 激活NLRP3對激活組和激活對照組炎癥因子和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （n=10，）

Tab.3 Effects of NLRP3 activation on the expression levels of inflammatory and pyroptosis proteins in two groups of mice表3 激活NLRP3對激活組和激活對照組炎癥因子和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （n=10，）

＊＊P＜0.01

組別激活對照組激活組t NLRP3 0.99±0.05 7.76±2.09 10.232＊＊IL-1β 0.98±0.02 25.45±5.04 15.364＊＊IL-6 1.05±0.05 62.89±9.91 19.724＊＊TGF-β 1.11±0.03 36.62±5.16 21.768＊＊TNF-α 1.02±0.07 40.28±9.41 13.207＊＊CASP-1 1.11±0.13 42.28±5.28 7.831＊＊CASP-4 1.03±0.01 40.28±3.55 11.055＊＊CASP-5 1.06±0.02 45.79±7.21 19.638＊＊GSDMD 1.04±0.05 44.75±8.22 16.816＊＊

Tab.4 Effects of NLRP3 inhibition on the expression levels of inflammatory and pyroptosis proteins in two groups of mice表4 抑制NLRP3對抑制組和抑制對照組炎癥因子和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （n=10，）

Tab.4 Effects of NLRP3 inhibition on the expression levels of inflammatory and pyroptosis proteins in two groups of mice表4 抑制NLRP3對抑制組和抑制對照組炎癥因子和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別抑制對照組抑制組t 0.93±0.01 0.19±0.01 143.494＊＊1.11±0.15 1.15±0.16 0.632 1.05±0.03 1.14±0.06 1.313 1.13±0.08 1.62±0.16 2.659＊1.11±0.06 1.29±0.07 1.989＊1.19±0.09 1.27±0.07 0.674 1.05±0.05 1.17±0.07 1.310 1.11±0.05 1.31±0.12 1.673 1.08±0.05 1.16±0.11 0.684 NLRP3IL-1βIL-6TGF-βTNF-αCASP-1CASP-4CASP-5GSDMD

3 討論

在FPIES患兒中，IgA和IgG抗體水平較低，保護(hù)性抗體缺乏是該疾病的潛在特征［5］。FPIES 患者外周血 TNF-α、IL-6 和輔助型 T 細(xì)胞 2（Th2）顯著升高［6-7］。NLRP3 已經(jīng)被證明是機(jī)體固有免疫的重要組分，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用［4，8］。由于能被多種類型的疾病信號激活，NLRP3炎癥小體在多種疾病發(fā)生過程中具有重要的預(yù)警作用［6］。NLRP3可以通過核因子（NF）-κB信號通路維持Th1/Th2 平衡，同時NLRP3 依賴性的CASP-1也是IgA和IgG活化所必需的分子。本研究建立FPIES 的小鼠模型，并證實小鼠腸黏膜細(xì)胞中NLRP3 mRNA 和蛋白水平，炎癥因子 IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α 蛋白水平均較對照組升高，提示以NLRP3為主的炎癥反應(yīng)參與FPIES的發(fā)生。本研究證明，激活小鼠腸黏膜細(xì)胞中NLRP3表達(dá)可以顯著上調(diào)炎癥因子與焦亡分子的表達(dá)水平；而在已經(jīng)發(fā)生炎癥反應(yīng)的FPIES 小鼠腸黏膜細(xì)胞中，抑制NLRP3 的表達(dá)并不能改變 IL-1β、IL-6 和焦亡相關(guān)分子的表達(dá)水平，提示NLRP3在炎癥早期就激活了重要炎癥因子和焦亡分子。

FPIES患者腸道病變組織中有大量T細(xì)胞浸潤，伴隨炎癥因子水平升高，而炎癥因子與細(xì)胞焦亡的發(fā)生密切相關(guān)［9］，因此提示細(xì)胞焦亡可能參與FPIES的發(fā)病。細(xì)胞焦亡是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，其特征為依賴于炎性半胱天冬酶（主要是CASP-1/4/5/11），并伴有大量促炎癥因子的釋放［9］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)PIES 組細(xì)胞焦亡相關(guān)的CASP-1、CASP-4、CASP-5、GSDMD 蛋白表達(dá)水平均升高。其中，CASP-1 介導(dǎo)細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路，而CASP-4、CASP-5介導(dǎo)細(xì)胞焦亡非經(jīng)典通路［10］，提示FPIES的細(xì)胞焦亡的經(jīng)典和非經(jīng)典通路均被激活。此外，NLRP3 也已被證明與細(xì)胞焦亡的發(fā)生密切相關(guān)，NLRP3 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡通路，參與FPIES腸黏膜細(xì)胞的病理過程［11-12］。

NLRP3 是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞監(jiān)測異常信號的NOD 樣受體（NLR）的重要亞型，發(fā)揮激活NLR表達(dá)，以及促進(jìn)炎癥因子釋放的雙重作用，其調(diào)控異常會導(dǎo)致慢性病的發(fā)生［13］。因其在疾病發(fā)生過程中屬于早發(fā)的信號分子，因此目前已經(jīng)作為多種疾病診斷和治療的靶點(diǎn)，其中包括慢性免疫性疾?。?4］、慢性疼痛［15］、心血管疾?。?6］、2 型糖尿?。?7］等。在胃腸道疾病的研究中，抑制三重基序蛋白31（TRIM31）或含V-Set免疫球蛋白域蛋白（VSIG4）可以活化NLRP3，緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，是結(jié)腸炎治療的潛在靶點(diǎn)［18-19］。本研究顯示，NLRP3 在FIPES 小鼠模型建立早期就出現(xiàn)活化表達(dá)，其通過固有免疫和細(xì)胞焦亡通路參與FIPES 病理過程，提示NLRP3可能成為FIPES的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，NLRP3 是FPIES 黏膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的上游調(diào)控分子，這為研究FPIES 病理機(jī)制提供了理論支持，也為該疾病的早期診斷與治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。