低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)比劑通過(guò)PI3K/AKT通路對(duì)乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究

賀修寶，胡小梅，郭雅婧△

乳腺癌的發(fā)病率居全球女性惡性腫瘤的首位，且在我國(guó)的發(fā)病率逐年增高［1］?；瘜W(xué)療法作為乳腺癌的輔助治療方法，廣泛應(yīng)用于不同病情程度患者的術(shù)前或術(shù)后治療，有利于限制腫瘤進(jìn)展，延長(zhǎng)患者生存期，然而其缺乏靶向性，且最終會(huì)產(chǎn)生耐藥，影響治療有效性［2-3］。低頻超聲聯(lián)合微泡（LFUSMB）是近年出現(xiàn)的一項(xiàng)治療技術(shù)，微泡可在低頻超聲下破裂產(chǎn)生空化作用，增加破裂處血管及細(xì)胞膜的通透性，提高藥物傳遞效率，具有針對(duì)性和非侵入性，在腫瘤治療中具有應(yīng)用前景［4］。研究顯示，LFUSMB可提高甲狀腺癌細(xì)胞中活性氧（ROS）水平，促進(jìn)自噬性死亡的發(fā)生，并抑制黑色素瘤B16 細(xì)胞的生長(zhǎng)［5-6］。Chen 等［7］發(fā)現(xiàn)，LFUSMB 可克服結(jié)直腸癌細(xì)胞的耐藥性，降低耐藥蛋白腺苷三磷酸結(jié)合盒家族蛋白G 成員2（ABCG2）表達(dá)，提高卟啉/喜樹(shù)堿/氟尿苷對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用，但其在乳腺癌中的作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)探討LFUSMB 對(duì)乳腺癌MCF-7/阿霉素（ADR）細(xì)胞耐藥性的影響并探究其機(jī)制，以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7/ADR 細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。阿霉素（ADR，純度＞98.0%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）活化劑 740 YP 購(gòu)自MCE公司；MCF細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；微泡對(duì)比劑Sonovue購(gòu)自意大利Bracco公司；兔抗人P糖蛋白（P-gp）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT抗體，小鼠抗人β-actin、抗多藥耐藥蛋白（MRP）2、乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）抗體及羊抗兔、羊抗小鼠或兔IgG 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；小鼠抗人MRP1、PI3K 抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；低頻超聲治療系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Philips 公司；電泳儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7/ADR 細(xì)胞解凍后離心，采用含1 mg/L ADR 的MCF 細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞以維持ADR 耐藥性，于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中復(fù)蘇培養(yǎng)，1周傳代3次，收集第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法篩選LFUSMB作用時(shí)間 將1.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 MCF-7/ADR 細(xì)胞制備為 5×105個(gè)/mL 的懸浮液，接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（2 mL/皿），加入1 mL MCF 細(xì)胞培養(yǎng)基（含1 mg/L ADR）和30%微泡對(duì)比劑混勻。將培養(yǎng)皿置于脫氣無(wú)菌水填充的水箱中，用超聲探頭在距培養(yǎng)皿底部1 cm處進(jìn)行輻射處理即超聲處理。超聲設(shè)置［8］：頻率1 MHz，強(qiáng)度1.0 W/cm2，效率70%。將未經(jīng)LFUSMB 處理的細(xì)胞（未超聲處理組）和上述經(jīng)超聲處理10 s、30 s、60 s、90 s 的細(xì)胞（LFUSMB 10 s組、LFUSMB 30 s 組、LFUSMB 60 s 組、LFUSMB 90 s 組）制備5×104個(gè)/mL的懸浮液，接種于96孔板（100 μL/孔），加入MCF細(xì)胞培養(yǎng)基（含1 mg/L ADR）。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450 nm處的吸光度值（A450），細(xì)胞活性=［（A450超聲處理組-A450空白組）（/A450未超聲處理組-A450空白組）］×100%。

1.4 CCK-8 法測(cè)定ADR 對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的半抑制濃度（IC50） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（1×106個(gè)/皿）培養(yǎng)，分為L(zhǎng)FUSMB 30 s 組（按照1.3 中方法采用LFUSMB干預(yù)30 s）和未超聲處理組（不經(jīng)LFUSMB干預(yù)），干預(yù)后收集細(xì)胞制備5×104個(gè)/mL 的懸浮液，接種于96孔板（100 μL/孔），加入含終質(zhì)量濃度0、1、5、10、20、30、40、50、60、70 mg/L ADR的MCF細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，按照1.3中方法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，繪制藥物抑制擬合曲線圖并計(jì)算ADR 對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的IC50。相對(duì)耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50（LFUSMB 30 s組）/IC5（0未超聲處理組）。

1.5 細(xì)胞分組及處理 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中（1×106個(gè)/皿）。對(duì)照（C）組：采用MCF細(xì)胞培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；ADR 組：采用加入ADR（終質(zhì)量濃度20 mg/L）的MCF 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；LFUSMB+ADR 組：采用加入ADR（終質(zhì)量濃度20 mg/L）的MCF 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)并經(jīng)LFUSMB 處理 30 s；另外，為探究 PI3K/AKT 通路對(duì) MCF-7/ADR 細(xì)胞耐藥性的作用，設(shè)置LFUSMB+ADR+740 YP（PI3K/AKT通路激活劑）組：采用加入ADR（終質(zhì)量濃度20 mg/L）和740 YP（終質(zhì)量濃度50 mg/L）的MCF 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)并經(jīng)LFUSMB處理30 s，按上述分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。每組重復(fù)6次。

1.6 Annexin V-FIFC/PI 法檢測(cè)凋亡率 取1.5 各組MCF-7/ADR 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按照Annexin V-FIFC/PI 試劑盒操作，調(diào)整細(xì)胞含量為5×105個(gè)/mL，加入500 μL 平衡試劑將細(xì)胞重懸，依次加入10 μL的Annexin V-FIFC和PI混勻后避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取1.5各組MCF-7/ADR 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、裂解液裂解后，離心保留上清，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。分別取30 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。經(jīng)奶粉封閉后，加入一抗，包括β-actin小鼠單抗（1∶2 000）、P-gp兔單抗（1∶1 000）、MRP1小鼠單抗（1∶2 000）、MRP2 小鼠單抗（1∶2 000）、BCRP/ABCG2小鼠單抗（1∶1 000）、PI3K 小鼠單抗（1∶1 000）、AKT 兔多抗（1∶2 000）、p-PI3K 兔單抗（1∶1 000）以及 p-AKT 兔多抗（1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入羊抗小鼠或兔二抗（1∶3 000）孵育1 h，洗膜后加入ECL 發(fā)光液顯影拍照，用目的蛋白和β-actin內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GrapdhPad 8.0或SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Bonferroni-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LFUSMB 對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞活力的影響 未超聲處理組、LFUSMB 10 s 組、LFUSMB 30 s 組、LFUSMB 60 s 組、LFUSMB 90 s 組 MCF-7/ADR 細(xì)胞活 性 分 別 為（100.00±0.05）% 、（97.20±3.67）% 、（93.56±4.95）%、（83.04±3.64）%、（57.58±3.81）%（n=6，F(xiàn)=136.296，P＜0.01）。與未超聲處理組比較，LFUSMB 60 s組、LFUSMB 90 s組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05），LFUSMB 10 s 組、LFUSMB 30 s 組細(xì)胞活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）。后續(xù)采用LFUSMB 干預(yù)30 s進(jìn)行研究。

2.2 LFUSMB 對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響 LFUSMB 30 s組ADR 對(duì)MCF/ADR 細(xì)胞的IC5（05.74 mg/L）低于未超聲處理組（47.06 mg/L），相對(duì)耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為8.20倍，見(jiàn)圖1。

Fig.1 The effect of LFUSMB on the drug resistance of MCF-7/ADR cells圖1 LFUSMB對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性的影響

2.3 LFUSMB對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 C組、ADR組、LFUSMB+ADR 組MCF-7/ADR 細(xì)胞凋亡率分別為（1.78±0.54）%、（13.15±1.65）%、（67.59±3.71）%（n=6，F(xiàn)=1 327.427，P＜0.01），見(jiàn)圖2。ADR 組細(xì)胞凋亡率較C組增高，LFUSMB+ADR 組細(xì)胞凋亡率較ADR組進(jìn)一步增高（P＜0.05）。

Fig.2 The effect of LFUSMB on the apoptosis rate of MCF-7/ADR cells圖2 LFUSMB對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 LFUSMB 對(duì) MCF-7/ADR 細(xì)胞中 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達(dá)的影響 ADR 組細(xì)胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達(dá)水平較C 組無(wú)明顯變化 ，LFUSMB+ADR 組 細(xì) 胞 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達(dá)水平較 C 組和ADR組顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表1。

Fig.3 MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3組MCF-7/ADR細(xì)胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3組MCF-7/ADR細(xì)胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與ADR組比較，P＜0.05

組別C組ADR組LFUSMB+ADR組F MRP1 1.86±0.05 1.83±0.07 0.79±0.04ab 742.467＊＊MRP2 1.01±0.09 0.97±0.06 0.42±0.03ab 155.286＊＊P-gp 1.26±0.07 1.23±0.08 0.74±0.06ab 102.966＊＊BCRP/ABCG2 1.95±0.10 1.97±0.09 0.82±0.05ab 378.612＊＊

2.5 LFUSMB對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響 ADR 組細(xì)胞p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT較C組無(wú)明顯變化，LFUSMB+ADR組細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT較C組和ADR組顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表2。

Fig.4 The protein expression of PI3K/AKT pathway detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3組MCF-7/ADR細(xì)胞PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3組MCF-7/ADR細(xì)胞PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與ADR組比較，P＜0.05

組別C組ADR組LFUSMB+ADR組F p-PI3K/PI3K 0.46±0.09 0.44±0.06 0.21±0.03ab 27.571＊＊p-AKT/AKT 0.57±0.08 0.58±0.05 0.13±0.02ab 127.807＊＊

2.6 PI3K/AKT 通路激活劑對(duì)LFUSMB 干預(yù)后MCF-7/ADR 細(xì)胞凋亡及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP蛋白表達(dá)的影響 與LFUSMB+ADR 組比較，LFUSMB+ADR+740 YP 組 MCF-7/ADR 細(xì) 胞凋 亡 率顯著降低，MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白水平顯著增高（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表3。

Fig.5 The MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3組MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)比較 （）

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3組MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表達(dá)比較 （）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與LFUSMB+ADR組比較，P＜0.05

組別C組LFUSMB+ADR組LFUSMB+ADR+740 YP組F n6 6 6凋亡率（%）2.40±0.05 81.20±9.64a 19.80±2.05ab 317.564＊＊MRP1 1.23±0.11 0.19±0.02a 1.01±0.08ab 286.095＊＊MRP2 1.29±0.08 0.34±0.03a 1.05±0.07ab 360.049＊＊P-gp 1.34±0.10 0.28±0.04a 1.13±0.09ab 287.848＊＊BCRP/ABCG2 1.57±0.09 0.39±0.03a 1.38±0.08ab 469.208＊＊

3 討論

目前對(duì)乳腺癌等腫瘤廣泛采用化學(xué)療法，隨著治療的進(jìn)行，最終腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，從而限制其療效［9］。因此尋找改善腫瘤耐藥性的新治療策略至關(guān)重要。低頻超聲通常小于5 W/cm2，是一種物理刺激，作為對(duì)比劑的微泡可以增加病灶檢測(cè)的圖像對(duì)比度，兩者聯(lián)合用于治療時(shí)可通過(guò)聲孔效應(yīng)增強(qiáng)細(xì)胞膜和血管系統(tǒng)的滲透，靶向特異性位點(diǎn)傳遞藥物，增強(qiáng)藥物或基因傳遞，改善細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，進(jìn)而提高治療功效［10-11］。但是，除提高細(xì)胞膜通透性外，是否涉及其他機(jī)制并不清楚。Qu 等［8］研究顯示，強(qiáng)度 1.0 W/cm2，頻率 1 MHz的超聲聯(lián)合30%微氣泡為MCF-7/ADR 細(xì)胞的最佳作用參數(shù)，本研究采用上述參數(shù)作用MCF-7/ADR細(xì)胞60 s 時(shí)，觀察到細(xì)胞活性為（83.04±3.64）%，與上述研究觀察到的活性（82.91±2.83）%相近，作用30 s時(shí)細(xì)胞活性為（93.56±4.95）%，對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的毒性較小，后續(xù)按照上述參數(shù)采用LFUSMB 干預(yù)30 s 進(jìn)行研究。洪麗杰等［12］發(fā)現(xiàn)，LFUSMB 可抑制卵巢癌細(xì)胞在裸鼠中的生長(zhǎng)。武雨琦等［13］研究顯示，LFUSMB 可逆轉(zhuǎn)前列腺癌對(duì)紫杉醇的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，LFUSMB 30 s組ADR 對(duì)MCF/ADR細(xì)胞的IC50低于未超聲處理組，相對(duì)耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為8.20倍，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LFUSMB可促進(jìn)ADR作用下MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡，表明LFUSMB可逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF/ADR 細(xì)胞對(duì)ADR 的耐藥性，其機(jī)制有待探索。

PI3K/Akt 信號(hào)的活化有利于抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，維持腫瘤細(xì)胞增殖，在人類乳腺癌等腫瘤的發(fā)生及多藥耐藥中具有重要作用［14］。研究顯示，通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，核糖體S6蛋白激酶4可以抑制MCF-7/多柔比星（DOX）細(xì)胞侵襲和腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減弱MCF-7/DOX 細(xì)胞的DOX 耐藥性［15］。Qiu 等［16］發(fā)現(xiàn)，低頻超聲可通過(guò)抑制 PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)ABC家族蛋白的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞活力和增殖，逆轉(zhuǎn)胰腺癌的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7/ADR細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 在 ADR 聯(lián)合 LFUSMB 作用下顯著降低，表明LFUSMB 可抑制PI3K/AKT 信號(hào)的活化。MRP1、MRP2、P-gp及BCRP/ABCG2均屬于ABC家族蛋白，作為能量依賴性外排泵，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)的外排作用，從而降低其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，在避免外來(lái)毒性物質(zhì)損傷機(jī)體的同時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性［17-18］。研究顯示，PI3K/AKT 通路與乳腺癌耐藥性有關(guān)［19］。另外，抑制PI3K 活化可下調(diào)P-gp、BCRP/ABCG2 等 ABC 家族蛋白表達(dá)，提高耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性［20］。本研究觀察到，LFUSMB 作用后可顯著抑制MCF-7/ADR 細(xì)胞中MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白 表 達(dá) ，與LFUSMB 對(duì)PI3K/AKT 通路的作用趨勢(shì)一致，由此推測(cè)，LFUSMB 作用于 MCF-7/ADR 細(xì)胞，可抑制 PI3K/AKT 通路，下調(diào) MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2多種耐藥蛋白表達(dá)，從而減少M(fèi)CF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)ADR 的外排，增加ADR 在細(xì)胞內(nèi)積累，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF/ADR 細(xì)胞的耐藥性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路激活劑可拮抗LFUSMB對(duì) MCF-7/ADR 細(xì)胞凋亡及 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步表明LFUSMB 可調(diào)控PI3K/AKT 通路活化，逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性。

綜上所述，LFUSMB 可逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF/ADR 細(xì)胞對(duì)ADR 的耐藥性，與抑制PI3K/AKT 通路、下調(diào)MRP1 等ABC 家族蛋白表達(dá)、增加ADR 在細(xì)胞內(nèi)積累及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但是，PI3K/AKT通路下游仍有多種蛋白級(jí)聯(lián)傳遞，且多藥耐藥蛋白表達(dá)可受到多種通路調(diào)控。本研究?jī)H揭示了PI3K/AKT 通路在LFUSMB 逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性中的作用，后續(xù)將對(duì)其他通路及PI3K/AKT通路下游靶點(diǎn)進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示LFUSMB 逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的機(jī)制，為L(zhǎng)FUSMB應(yīng)用于腫瘤治療提供參考。