電子煙液中游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的測定及分布

盧樂華，茹潔雄，李祥林，高嶧涵，謝 焰

上海新型煙草制品研究院，上海市浦東新區(qū)秀浦路3733號 201315

世界衛(wèi)生組織將電子煙定義為“一種能夠向肺部傳輸煙堿的電子煙堿傳遞系統(tǒng)（Electronic nicotine delivery systems,ENDS）”［1］，遞送煙堿是電子煙最主要的功能。雖然電子煙加熱和遞送規(guī)律與傳統(tǒng)卷煙有較大區(qū)別，煙堿依然是提供生理滿足感的核心成分［2］。煙堿能夠以游離態(tài)、單質(zhì)子態(tài)或雙質(zhì)子態(tài)形式存在于樣品體系中（圖1）。研究表明［3-4］，當(dāng)pH＜3時，煙堿主要以雙質(zhì)子態(tài)存在。在煙草原料和煙氣粒相物中，由于存在蘋果酸和檸檬酸等有機酸，pH在5.5～6.5之間，大部分煙堿與有機酸結(jié)合形成煙堿鹽，主要以單質(zhì)子態(tài)存在［5］。而電子煙液pH分布范圍較廣，煙堿一般以游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)兩種形式存在［6］。近年來，煙堿鹽技術(shù)在霧化煙草制品中被廣泛使用［7-11］。該技術(shù)通過有機酸-煙堿復(fù)合形成質(zhì)子態(tài)煙堿鹽，煙堿主要以質(zhì)子化形態(tài)存在，改善了高釋放量游離態(tài)煙堿產(chǎn)生的喉部尖刺感，獲得更柔和、順滑的感官體驗和更強的生理滿足感。

圖1 煙堿的存在形式Fig.1 Forms of nicotine

煙堿的弱二級堿特性使電子煙液成為緩沖體系，酸堿平衡對煙堿的存在形態(tài)產(chǎn)生影響。樣品中的游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，從而影響電子煙的感官品質(zhì)［12-14］。煙堿形態(tài)的分布對電子煙感官質(zhì)量具有重要影響，是評價電子煙液及氣溶膠中煙堿功效的重要指標(biāo)?，F(xiàn)有分析方法主要集中在煙堿總量的測定方面［15-16］。煙堿形態(tài)分布的測定方法主要分為兩類：一是間接推導(dǎo)法，如基于Henderson-Hasselbalch方程的pH推導(dǎo)法［17］和核磁共振法（1H NMR）［18］。pH測定過程受稀釋溶劑的酸堿性、溶解于水中的CO2、樣品基質(zhì)及Henderson-Hasselbalch方程推導(dǎo)過程的影響。NMR法雖然避免了在測定過程中引入溶劑，但計算模型和化學(xué)位移干擾也具有一定影響。二是直接測定法，如固相微萃取法（SPME）［19-20］和液-液萃取法［21］。固相微萃取法基于游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的揮發(fā)性差異進(jìn)行測定，但游離態(tài)煙堿和質(zhì)子態(tài)煙堿是否達(dá)到完全分離或發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化無法得到有效驗證。溶劑萃取法基于游離態(tài)煙堿和質(zhì)子態(tài)煙堿的疏水性差異，分別測定游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由于測定過程需引入水和有機溶劑，水中溶解的CO2、水自身的酸堿性以及有機溶劑的疏水性能，均可能對樣品體系的酸堿平衡和萃取過程產(chǎn)生影響，從而影響煙堿形態(tài)分布的真實性。有研究中改良了液-液萃取法［21］，通過多次萃取提高效率。但萃取過程容易導(dǎo)致電子煙液中的香精成分從水相進(jìn)入有機相，由于香精成分具有酸堿性，打破了水相體系的酸堿平衡，二次萃取時促使質(zhì)子態(tài)煙堿向游離態(tài)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致測定結(jié)果失真。

本研究中基于有機溶劑和水的兩相液液萃取，提出一種改進(jìn)的直接測定電子煙液中游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的方法，避免因水的引入和多次萃取所導(dǎo)致的測定結(jié)果偏差，并基于本方法對電子煙液中煙堿的形態(tài)分布進(jìn)行研究，旨在為電子煙（尤其是煙堿鹽型電子煙）中的煙堿形態(tài)分布提供定量評價方法，探索電子煙液中煙堿形態(tài)分布及影響其分布的因素，為量化煙堿形態(tài)對電子煙感官品質(zhì)影響提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

選擇11款市售電子煙液樣品，其中Arabica-A和Arabica-B，Mallika-A和Mallika-B分別為同一香氣風(fēng)格，除標(biāo)示煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)外，配方組成一致。另外，選擇4款pH和香精組成（包括煙草、西瓜、薄荷、綠豆）不同、未添加煙堿的煙液配方。15款煙液樣品的具體信息見表1。

表1 電子煙液樣品信息Tab.1 Information of commercial and laboratory e-liquid samples

正己烷（色譜純，泰國RCI Labscan公司）；二氯甲烷（色譜純，美國Tedia有限公司）；丙二醇、甘油（USP級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm）；乙酸、氫氧化鈉（AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；正十七烷（≥98.5%，北京百靈威科技有限公司）；煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（4 000 μg/mL異丙醇溶液，上海安譜科技有限公司）；水楊酸煙堿鹽［25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水溶液，其中含3.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）游離態(tài)煙堿］、蘋果酸煙堿鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的水溶液）、酒石酸煙堿鹽（結(jié)晶體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）（自制）。

CPE205電子天平（感量0.000 01 g）、通用型pH計（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q50超純水儀（美國Millipore公司）；7890B氣相色譜儀、7890B/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；Talboys多管式渦旋混合器（上海安譜科技有限公司）；RJ-TDL-40F低速多管式離心機（無錫瑞江分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PG-VG體系樣品的制備

根據(jù)實驗要求，將丙二醇（Propylene glycol,PG）和甘油（Vegetable glycerin,VG）以一定比例混合，作為霧化溶劑。分別添加一定量的水楊酸煙堿鹽和蘋果酸煙堿鹽，配制一定煙堿濃度的PG-VG體系樣品。

1.2.2 中性水制備

取一定量的去離子水，煮沸20 min除去CO2，密封后冷卻至室溫［22］。使用前以0.01 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。每批次樣品處理均需重新制備。

1.2.3 pH測定

參考相關(guān)研究方法［13,23］，稱取1.0 g煙液樣品，10 mL中性水稀釋，渦旋混合10 min，靜置20 min后，使用經(jīng)過校準(zhǔn)的pH計測定樣品pH。

1.2.4 煙堿總量測定

參考CORESTA第62號推薦方法（CRM No.62）［24］，稱取1.0 g電子煙液樣品，加入10 mL去離子水、5 mL 8 mol/L氫氧化鈉溶液和20 mL含正十七烷內(nèi)標(biāo)的正己烷萃取液，渦旋振蕩60 min，離心分層，取有機相，采用GC法測定。分析條件：

色譜柱：DB-17毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：170℃（10 min）；進(jìn)樣口和FID檢測器溫度：270℃；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：10∶1；載氣：氦氣（He）；載氣流量：1.5 mL/min；氫氣流量：30 mL/min；空氣流量：400 mL/min；尾吹氣（N2）流量：3 mL/min。

1.2.5 游離態(tài)與質(zhì)子態(tài)煙堿測定

分別取適量煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和正十七烷內(nèi)標(biāo)儲備液，用二氯甲烷稀釋定容，配制煙堿濃度分別為1.0、5.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/mL且正十七烷內(nèi)標(biāo)濃度為50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

準(zhǔn)確稱取0.2 g左右電子煙液樣品，加入10 mL中性水、50μL正十七烷內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL二氯甲烷，渦旋混合萃取30 min，2 500 r/min離心10 min，取有機相，GC-MS測定游離態(tài)煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

在水相溶液中加入1 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液使質(zhì)子態(tài)煙堿轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，再加入50μL正十七烷內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL二氯甲烷，渦旋混合萃取30 min，2 500 r/min離心10 min，取有機相。水相部分重復(fù)上述萃取過程進(jìn)行二次萃取，取有機相。采用GC-MS法分別測定煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以兩次萃取液測定結(jié)果之和為質(zhì)子態(tài)煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

GC-MS條件：

色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：240℃（5 min）；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：50∶1；載氣：氦氣，流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口和傳輸線溫度均為240℃；離子源溫度：230℃；選擇離子掃描（SIM）模式，煙堿定量離子為84（m/z），定性離子為133、162（m/z）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用Origin 9.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙堿形態(tài)測定方法驗證

2.1.1 萃取試劑選擇

游離態(tài)煙堿易溶于有機相，而質(zhì)子態(tài)煙堿在水中的溶解性更強。液液兩相萃取法利用煙堿不同形態(tài)的這一特性，對游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿進(jìn)行兩相萃取。

考察3種常用于煙堿測定的萃取試劑（二氯甲烷、正己烷和甲苯），其均表現(xiàn)出了較好的疏水性特征［25］，其中正己烷的疏水性能最佳，甲苯和二氯甲烷在20℃時有一定溶解性，二氯甲烷的水中溶解量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為2%左右，對兩相萃取的影響較小。

進(jìn)一步考察3種試劑對同一煙堿鹽型電子煙液的兩步萃取效率（圖2）。采用正己烷時第一次萃取不完全，在第二次萃取中煙堿響應(yīng)較高，萃取效率不佳。甲苯中的煙堿響應(yīng)值和單次萃取效率均較低。根據(jù)峰面積響應(yīng)值計算，二氯甲烷中第二次萃取的煙堿響應(yīng)值僅為第一次萃取的1.47%，單次萃取效率最高，疏水性和靈敏度良好，適用于不同形態(tài)和濃度范圍廣的煙堿萃取和分離。因此，選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

圖2 3種不同溶劑中煙堿的萃取效率Fig.2 Extraction efficiencies of nicotine using three different reagents

2.1.2 方法檢出限與定量限

選取一款薄荷口味、不含煙堿的配方煙液，分別添加5μg/mL的煙堿溶液和煙堿濃度為5μg/mL的酒石酸煙堿鹽溶液，平行測定7次，分別計算游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的信噪比。再分別以3倍和10倍的信噪比為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 方法的檢出限與定量限Tab.2 LODs and LOQs of the method

2.1.3 方法的精密度

選取一款薄荷口味、不含煙堿的配方煙液，分別添加約5μg/mL的煙堿溶液（基質(zhì)1）和煙堿濃度約為15μg/mL的酒石酸煙堿鹽溶液（基質(zhì)2），平行測定7次，分別計算基質(zhì)1中的游離態(tài)煙堿和基質(zhì)2中的質(zhì)子態(tài)煙堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。在煙堿和煙堿鹽形態(tài)下測定結(jié)果的RSD均小于1.0%，說明方法的穩(wěn)定性良好。

表3 煙堿測定的精密度Tab.3 Precisions of analytical determination of nicotine

2.1.4 方法準(zhǔn)確度

選取一款薄荷口味、不含煙堿的配方煙液，分別添加5、20、100μg/mL游離態(tài)煙堿溶液，以及煙堿量為5、20、100μg/mL的酒石酸煙堿鹽溶液，測定游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算煙堿回收率，結(jié)果見表4。不同加標(biāo)濃度下測定游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的回收率均在85%～110%之間。

表4 煙堿的回收率Tab.4 Spiked recoveries of nicotine

總體上，本方法能夠利用煙堿和煙堿鹽的水溶性差異，可以準(zhǔn)確測定電子煙液中游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的分布量。方法靈敏度高，線性范圍寬，測定結(jié)果準(zhǔn)確，是電子煙中煙堿形態(tài)分布和定量功效評價的合適手段。

2.2 PG-VG體系中煙堿形態(tài)測定與影響分析

2.2.1 PG-VG體系樣品中煙堿總量

以VPG∶VVG=2∶1體系為霧化溶劑，添加一定量的水楊酸煙堿鹽，用乙酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，制備一批不同pH的PG-VG體系樣品（S0～S5）。表5結(jié)果顯示，液液萃取法能夠分別對游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿進(jìn)行萃取，不同樣品的游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿具有顯著差異。

表5 兩種方法測定的煙堿總量Tab.5 Total nicotine contents determined by two methods

對兩種分析方法測定的煙堿總量進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗［26］，加和總量顯著性sig.=0.294（＞0.05），測定總量顯著性sig.=0.537（＞0.05），均服從正態(tài)分布。對兩種方法測定的煙堿總量結(jié)果進(jìn)行配對T檢驗，結(jié)果見表6。可知，相關(guān)系數(shù)為0.866，顯著性sig.=0.026（＜0.05），說明兩種方法的測定結(jié)果具有較高的相關(guān)性，且變化趨勢一致。配對樣本檢驗的sig.（雙尾）=0.006（＜0.05），t=4.629，雖然兩種方法測定的煙堿總量偏差均在10%以內(nèi)，但也存在一定的顯著性差異。通過液液萃取法分別測定游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的加和煙堿總量略高于CRM 62方法直接測定的結(jié)果，這可能是由于二氯甲烷多次萃取誤差和正己烷萃取效率的共同影響導(dǎo)致的。

表6 煙堿總量的配對樣本相關(guān)性與檢驗Tab.6 Correlation and test of paired samples for total nicotine content

2.2.2 煙堿自由基系數(shù)（αfbn）

煙堿自由基系數(shù)（αfbn）為游離態(tài)煙堿在煙堿總量中的比率，數(shù)值介于0～1之間，反映樣品體系中游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的分布情況［17］。αfbn值越大，游離態(tài)煙堿的比例越高，可產(chǎn)生更快、更強烈的喉部刺激和生理反應(yīng)［7］。αfbn按照公式（1）計算：

式中：［Nic］和［NicH+］分別表示樣品中的游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿濃度，μg/g。

研究［23］表明，游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的分布受到樣品體系的酸堿平衡影響，通過Henderson-Hasselbach方程可以推導(dǎo)游離態(tài)煙堿在樣品體系中的比例，建立游離態(tài)煙堿比例與pH之間的關(guān)聯(lián)。因此，通過測定電子煙液的pH，可以推算樣品體系中游離態(tài)煙堿占煙堿總量的比例，即αfbn。根據(jù)公式（1）和（2）可得到根據(jù)pH值推導(dǎo)αfbn的公式（3）。

式中：p Ka為煙堿解離平衡常數(shù)，單質(zhì)子態(tài)時，p Ka=8.01。

但是，電子煙液中游離態(tài)與質(zhì)子態(tài)煙堿的分布情況不僅受到酸堿平衡的影響，也與樣品基質(zhì)的化學(xué)組成有關(guān)。因此，用于表征煙堿形態(tài)分布的αfbn值不僅受到推導(dǎo)或測定方法的影響，也與樣品自身性質(zhì)等有關(guān)。

通過液液萃取法測定PG-VG樣品中的游離態(tài)煙堿和質(zhì)子態(tài)煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)公式（1）得到αfbn計算值，測定樣品的pH，根據(jù)公式（3）得到αfbn推算值，見表7。

表7 αfbn計算值與推算值的比較Tab.7 Comparison of calculated and imputedαfbn values

對兩組αfbn值進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗［26］，αfbn計算值的顯著性sig.=0.248（＞0.05），αfbn推算值的顯著性sig.=0.301（＞0.05），均服從正態(tài)分布。配對T檢驗結(jié)果（表8）顯示，兩個方法得到的αfbn值的相關(guān)系數(shù)為0.997，顯著性sig.=0.00（＜0.05），兩者高度正相關(guān)。配對樣本檢驗的sig.（雙尾）=0.284（＞0.05），兩種方法得到的αfbn值之間無顯著差異。

表8 αfbn的配對樣本相關(guān)性與檢驗Tab.8 Correlation and test of paired samples forαfbn

在配制的PG-VG樣品體系中，僅有丙二醇、甘油和煙堿鹽存在，沒有其他因素對體系酸堿平衡產(chǎn)生影響，二氯甲烷液液萃取法測定得到的αfbn值與pH推算結(jié)果高度相關(guān)，沒有顯著性差異。說明二氯甲烷萃取法能夠分別萃取游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿，結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映煙堿的總量和形態(tài)分布情況。

2.2.3 PG-VG配比對αfbn的影響

丙二醇和甘油的總量占電子煙液產(chǎn)品的絕大部分，是電子煙液中的主體組分。丙二醇和甘油由于其良好的霧化性能，在電子煙中常作為霧化溶劑使用，電子煙加熱霧化產(chǎn)生丙二醇-甘油煙霧，攜帶煙液中的香氣成分和煙堿形成氣溶膠，供使用者吸食。為考察不同的PG-VG配比對煙堿形態(tài)分布的影響，配制VPG∶VVG分別為1∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶1共5種配比，且含有相同煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水楊酸煙堿鹽樣品，測定其αfbn值，結(jié)果見圖3。

在5種不同的PG-VG配比樣品中，αfbn值均在0.07左右，即游離態(tài)煙堿比例約為7%。由于添加的水楊酸煙堿鹽標(biāo)樣本身含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.91%的游離態(tài)煙堿，所以其在PG-VG體系中僅有微量的解離，且不同配比樣品中αfbn值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.72%，解離程度也無顯著差異。雖然丙二醇和甘油在電子煙液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，但由于其本身的化學(xué)性質(zhì)，并沒有改變樣品體系的酸堿平衡，沒有導(dǎo)致水楊酸煙堿鹽在PG-VG體系中發(fā)生明顯解離，不同配比的PG-VG對煙堿鹽解離程度的影響也沒有明顯區(qū)別。因此，電子煙液中的PG-VG配比對煙堿的形態(tài)分布基本沒有影響。

2.2.4 煙堿鹽添加量對αfbn的影響

以VPG∶VVG=2∶1體系為溶劑，考察煙堿鹽添加量對樣品體系中煙堿形態(tài)分布的影響。在PG-VG體系中分別添加煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%的蘋果酸煙堿鹽，以液液萃取法測定游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿，計算αfbn值，結(jié)果見圖4。

圖4 不同煙堿鹽添加量對αfbn的影響Fig.4 Effects of addition amounts of nicotine salts onαfbn

結(jié)果顯示，不同濃度的蘋果酸煙堿鹽在PG-VG體系中的αfbn很小，游離態(tài)煙堿比例均小于1%，不同濃度之間并無明顯差異，沒有使樣品中的蘋果酸煙堿鹽發(fā)生解離。因此，如果沒有其他因素促使煙堿鹽發(fā)生解離，則煙堿鹽的添加量不會影響煙堿在樣品中的形態(tài)分布。

2.2.5 pH對αfbn的影響

對比PG-VG樣品S0～S5的pH和αfbn值分布（圖5）可知，隨pH增大，αfbn相應(yīng)升高，擬合系數(shù)R2為0.939，呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。

圖5 不同p H對αfbn的影響Fig.5 Effects of p H onαfbn

體系pH顯著影響煙堿鹽在樣品中的分布。在酸性環(huán)境下，體系中的煙堿與酸結(jié)合成以單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)為主導(dǎo)的煙堿鹽形態(tài)。當(dāng)pH=4.22時，游離態(tài)煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅占2.2%。pH=8.27時，αfbn在0.5左右，此時pH接近煙堿的解離常數(shù)p Ka值，質(zhì)子態(tài)和游離態(tài)煙堿在體系中各占一半。當(dāng)pH＞11時，游離態(tài)煙堿的比例高達(dá)95%以上?？梢?，隨pH的增大，水楊酸煙堿鹽在體系中逐漸解離，轉(zhuǎn)化成游離態(tài)煙堿，而煙堿本身的堿性又進(jìn)一步促進(jìn)煙堿鹽解離，直至達(dá)到新的平衡狀態(tài)。pH越高，煙堿鹽的解離程度也越高，游離態(tài)煙堿比例越高。

這說明pH是樣品體系酸堿平衡狀態(tài)的外部反映，對煙堿在樣品體系中的形態(tài)分布有顯著影響，能夠直觀反映體系中游離態(tài)煙堿的比例及變化趨勢。對樣品體系酸堿平衡產(chǎn)生影響的其他因素，也將進(jìn)一步影響煙堿的形態(tài)分布。

2.3 煙堿添加形式對體系酸堿平衡的影響

選擇一款不含煙堿的綠豆香精作為基質(zhì)，分別添加20 mg/mL的游離態(tài)煙堿和煙堿酒石酸鹽。將二者按照不同體積比混合，V煙堿∶V煙堿鹽分別為0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0，并以不含煙堿的綠豆香精為空白。考察不同煙堿添加形式對酸堿平衡的影響。

圖6結(jié)果顯示，綠豆香精的pH偏酸性，由于煙堿本身具有弱堿性，當(dāng)煙堿的添加量較大時，使pH向堿性變化。這也是電子煙液的pH通常在7～10之間的原因［14］。而酒石酸煙堿鹽呈酸性，添加后使煙液pH進(jìn)一步下降，pH＜4.0，此時煙堿主要以單質(zhì)子態(tài)形式存在。當(dāng)20 mg/mL煙堿量的酒石酸煙堿鹽煙液中添加游離煙堿時，煙堿添加量越大，煙液的pH越高，酒石酸煙堿鹽在游離煙堿的影響下逐漸發(fā)生分解，部分向游離態(tài)煙堿轉(zhuǎn)化。酸性的煙堿鹽和堿性的煙堿在煙液中達(dá)到新的酸堿平衡。說明煙堿的添加形式，如純煙堿鹽添加、純煙堿添加或煙堿和煙堿鹽混合添加，對煙液最終的酸堿平衡影響不同，當(dāng)兩者混合添加時，導(dǎo)致游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的相互轉(zhuǎn)化，對煙液中煙堿的實際存在形態(tài)影響較大。

圖6 不同煙堿形態(tài)對電子煙液pH的影響Fig.6 Effects of nicotine forms on e-liquid p H

2.4 香精組成對體系酸堿平衡的影響

選擇4種不含煙堿的典型口味風(fēng)格電子煙液（西瓜、薄荷、煙草、綠豆）樣品，分別添加0、20 mg/mL煙堿和20 mg/mL煙堿量的酒石酸煙堿鹽，測定制備樣品的pH，考察不同的香精組成對體系酸堿平衡的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同香精配方組成對電子煙液pH的影響Fig.7 Effects of flavor formulas on e-liquid p H

不同口味風(fēng)格的電子煙液均呈酸性，pH從3.7到5.2不等。煙草風(fēng)格樣品由于樣品配方中添加的煙草及其他植物、水果提取物含有大量酸類或酯類化合物，其酸性較強，pH較低。值得注意的是，雖然不同香精配方中添加的煙堿量相同，但最終樣品的pH是香精配方和煙堿達(dá)到酸堿平衡的結(jié)果，香精配方pH較低的，添加煙堿后的pH也相對較低。說明一部分煙堿與配方中的酸性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成鹽，導(dǎo)致pH偏低。研究［27］發(fā)現(xiàn)，煙堿濃度為6.0 mg/mL的VPG∶VVG=1∶1、Menthol和Sahara 3種樣品體系的pH分別為9.0、7.8和8.4。說明在相同煙堿添加形式和添加量條件下，香精組成是影響樣品體系酸堿平衡的主要因素，不同的香精組成導(dǎo)致體系酸堿平衡發(fā)生變化，從而出現(xiàn)煙堿鹽的分解或結(jié)合。

2.5 電子煙液中煙堿的形態(tài)分布

用液液萃取法測定6款市售煙堿鹽型電子煙液中的游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿，并計算αfbn值（表9）。

表9 電子煙液中煙堿形態(tài)分布測定結(jié)果Tab.9 Contents of free-base and protonated nicotine in e-liquids

結(jié)果顯示，低煙堿量的6款電子煙液中pH介于7.4～8.1之間，基本處于中性偏弱堿性的范圍。在該范圍內(nèi)，煙堿主要以游離態(tài)和單質(zhì)子態(tài)共存的形式存在［3］。αfbn值介于0.5～0.8之間，游離態(tài)煙堿所占比例達(dá)50%以上。樣品中煙堿以游離態(tài)為主，這可能是由于樣品中堿性成分的存在，導(dǎo)致煙堿鹽發(fā)生解離。或煙堿鹽和煙堿混合添加，過量的煙堿和煙堿鹽形成新的動態(tài)平衡，樣品中的煙堿以游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)混合存在。由于游離態(tài)煙堿的存在，抽吸時表現(xiàn)為喉部刺激性較強，擊喉感較大。而高煙堿量（2.5%）的5款電子煙液pH均處于酸性范圍，αfbn值在0.16以內(nèi)，煙堿鹽解離程度低，樣品中的煙堿以質(zhì)子態(tài)為主。質(zhì)子態(tài)煙堿鹽使喉部刺激性降低，擊喉感適中，所以在以煙堿鹽為主的電子煙液中，煙堿的添加量可以達(dá)到2.5%甚至更高。

pH與αfbn和煙堿總量的分布關(guān)系（圖8）顯示，在相同配方組成（Arabica-A和Arabica-B，Mallika-A和Mallika-B）的電子煙液中，pH越高，煙堿總量越高，αfbn也越大。因此，在相同樣品基質(zhì)的體系中，αfbn與pH呈正比，這與PG-VG體系中的規(guī)律一致。由于煙堿形態(tài)分布與樣品體系的酸堿平衡有關(guān)，在配方組成一致的樣品中，煙堿添加方式是影響酸堿平衡的主要因素，體現(xiàn)為對樣品體系pH的影響。研究［27］表明，由于煙堿呈弱堿性，當(dāng)電子煙液中的游離煙堿量增加時，體系堿性增強，游離態(tài)煙堿進(jìn)一步促使樣品中的質(zhì)子態(tài)煙堿向游離態(tài)轉(zhuǎn)化。

圖8 電子煙液中p H與αfbn和煙堿總量的分布關(guān)系Fig.8 Relationships between pH andαfbn/total nicotine content in commercial e-liquids

在不同配方組成的電子煙液中，αfbn與pH之間并無顯著規(guī)律，但當(dāng)煙堿量顯著升高時，pH也會相應(yīng)增大。因此，電子煙液中的煙堿鹽并非全部以質(zhì)子化形態(tài)存在，而是根據(jù)體系香精配方組成和煙堿添加對酸堿平衡的影響，形成游離態(tài)與質(zhì)子態(tài)煙堿分布的動態(tài)平衡。由于不同配方組成及煙堿添加方式對體系酸堿平衡的共同影響，導(dǎo)致αfbn與pH之間并不總是呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

①二氯甲烷-水兩相液液萃取結(jié)合GC-MS能夠同時準(zhǔn)確測定樣品中游離態(tài)和質(zhì)子態(tài)煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，方法具有良好的適用性，能夠直觀、準(zhǔn)確地定量研究電子煙中游離態(tài)煙堿和質(zhì)子態(tài)煙堿的分布情況和評價煙堿鹽功效。②在PG-VG純?nèi)軇w系中，PG-VG配比、單一煙堿鹽的添加量對煙堿存在形態(tài)（αfbn）沒有明顯影響，但在一定范圍內(nèi)與pH顯著正相關(guān)。體系的酸堿平衡是影響煙堿形態(tài)分布的主要因素。③煙堿添加方式和香精組成對樣品體系的酸堿平衡產(chǎn)生影響，二者的協(xié)同效應(yīng)使樣品達(dá)到新的酸堿平衡，導(dǎo)致煙堿鹽/煙堿發(fā)生解離或結(jié)合，使電子煙液中的煙堿形態(tài)分布比例發(fā)生變化。④綜合考量煙堿的添加形態(tài)、添加方式、添加量及香精配方組成對煙堿形態(tài)分布的影響，有利于針對性開發(fā)喉部刺激小、生理滿足感強的煙堿鹽型電子煙產(chǎn)品。