水分散-DNPH衍生-LC-MS/MS法同時測定電子煙液中8種羰基物

潘立寧，劉紹鋒*，李東亮，樊美娟，沈 怡，王曉瑜，施豐成，羅 誠*，孫學輝，劉瑞紅，秦亞瓊

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.四川中煙工業(yè)有限責任公司技術中心 卷煙減害降焦四川省重點實驗室，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號610021

近年來，隨著全球控煙力度不斷加大，一些發(fā)達國家傳統(tǒng)卷煙的銷量出現(xiàn)了一定的下降趨勢，而電子煙在全球銷量呈快速增長之勢［1-3］。作為電子煙的重要組成部分，電子煙液的質(zhì)量安全直接影響消費者的健康。低分子羰基物是一類對人體感覺系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有強烈刺激作用的有害物質(zhì)，特別是甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛8種低分子羰基物［4］。這8種羰基物均被列于Hoffmann名單中［5］，甲醛、乙醛和巴豆醛分別被國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為1類、2B類、3類人類致癌物［6］，丙烯醛被美國環(huán)境保護署（US Environmental Protection Agency，US EPA）列入“有害大氣污染物名單”［7］。為保障電子煙液的安全性，規(guī)范電子煙市場，部分國家和地區(qū)對電子煙液中的羰基物進行了規(guī)范或限量［8-9］。準確測定電子煙液中羰基物的質(zhì)量分數(shù)對于確定羰基物的形成機理和評價其對人體健康的影響具有重要意義。低分子量羰基物由于極性大、反應活性高、易揮發(fā)等特點，通常對其衍生化后再采用色譜或光譜技術進行檢測［10］。羰基物與DNPH的衍生應用廣泛［11-25］，由于腙類化合物在高溫下會發(fā)生分解，液相色譜（LC）比氣相色譜（GC）更適合對羰基物的腙類產(chǎn)物進行測定［13］，DNPH衍生-LC檢測法被一些國家的標準化機構(gòu)用作分析主流煙氣中羰基物的標準方法［14-15］。目前，電子煙氣溶膠中羰基物的研究較多，而電子煙液中羰基物分析方法的相關報道較少。Lim等［23］利用2,2,2-三氟乙基肼對羰基物進行衍生，采用頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用法測定電子煙液中的甲醛、乙醛和丙烯醛；Varlet等［24］使用盛有DNPH的吸附管捕集電子煙液中的羰基物，經(jīng)乙腈洗脫后采用LC-UV/MS法進行測定。

在本研究中，采用DNPH衍生化羰基物、采用LC-MS/MS法進行檢測，解決了在樣品前處理過程中因甘油和DNPH乙腈溶液不混溶導致的溶液分層問題以及腙類產(chǎn)物在酸性條件下的降解問題，旨在為電子煙液中多種羰基物的同時測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

收集市場上22種不同品牌、不同口味和不同煙堿量的電子煙液樣品。

甲醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、乙醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙（＞95%）、丙醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丁醛-2,4-二硝基苯腙（＞96%）（標準品，日本東京化成工業(yè)株式會社）；甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3、乙醛-2,4-二硝基苯腙-d（3標準品，＞98%，上海安譜公司）。

水（自制，符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水，電阻率18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Dikma公司）；吡啶（色譜純）、2,4-二硝基苯肼（DNPH，＞98%）（美國Sigma-Aldrich公司）；高氯酸［70%（質(zhì)量分數(shù)），比利時Acros Organics公司］。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

采用乙腈配制8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的混合標準儲備液，以及甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合內(nèi)標儲備液，置于-20℃冰箱中保存。采用乙腈稀釋配制甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的濃度均為20μg/mL的內(nèi)標工作液。采用乙腈逐級稀釋并加入內(nèi)標工作液配制系列標準工作溶液，系列標準工作溶液中各羰基物-2,4-二硝基苯腙的濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL，內(nèi)標濃度為200 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理和儀器條件

稱取0.2 g電子煙液樣品于10 mL容量瓶中，依次加入1.2 mL去離子水、2 mL 1.2 mg/mL DNPH乙腈溶液以及80μL高氯酸水溶液，搖勻，室溫放置60 min進行衍生化反應。反應結(jié)束后加入200μL吡啶和100μL內(nèi)標工作溶液（甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合溶液，濃度均為20μg/mL），并用乙腈定容至10 mL，搖勻。溶液過有機相濾膜，將濾液進行LC-MS/MS分析。分析條件：

色譜柱：Acclaim?Explosive E2柱（3 mm×150 mm，3μm，120?）；柱溫：30℃；進樣量：5μL；流動相A：水；流動相B：乙腈；洗脫方式：40%A+60%B等度洗脫；流速：0.4 mL/min；離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓：-4 200 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣壓力：0.138 MPa；碰撞氣壓力：0.041 MPa；輔助氣1壓力：0.276 MPa；輔助氣2壓力：0.276 MPa；監(jiān)測離子對信息見表1。

表1 各衍生物的內(nèi)標物、母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量及保留時間Tab.1 Internal standards，precursor ions，product ions，declustering potentials，collision energies and retention time of the derivatives

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS法與HPLC法比較

文獻研究表明，電子煙液中低分子量羰基物質(zhì)量分數(shù)水平為μg/g級；為了改善口感，電子煙液中加入不同種類的香味成分，導致電子煙液基質(zhì)比較復雜，不同電子煙液樣品基質(zhì)差異較大［23-24］。選擇2個市售電子煙液樣品，按照1.2.2節(jié)的方法進行樣品前處理，然后分別采用LC-MS/MS法和LC法進行測定，LC條件參見文獻［7］。

圖1為標準溶液和2個電子煙液樣品中8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取離子色譜圖（圖1a）和LC譜圖（圖1b）。LC-MS/MS提取離子色譜圖顯示，樣品1中含有甲醛和乙醛，樣品2中含有甲醛、乙醛和2-丁酮。LC譜圖顯示，在樣品1中也檢測甲醛、乙醛，但因雜質(zhì)干擾，甲醛的色譜峰前沿處有凸起，難以準確定量，且丙烯醛及丙醛色譜峰中間存在很大的雜質(zhì)峰；樣品2中檢出甲醛和乙醛，但未檢出2-丁酮，且在巴豆醛出峰位置出現(xiàn)了很大的色譜峰，該峰經(jīng)LC-MS/MS法證實為雜質(zhì)峰而非巴豆醛，并將2-丁酮色譜峰掩蓋。由此可見，由于電子煙液基質(zhì)比較復雜，且不同電子煙液樣品基質(zhì)差異較大，采用LC法難以準確檢測樣品中的8種羰基物；LC-MS/MS法靈敏度高，且選擇性好，適于電子煙液中8種羰基物的測定。

圖1 標準溶液和2個電子煙液樣品中8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取離子色譜圖（a）和LC圖（b）Fig.1 Extracted ion chromatograms（a）and liquid chromatograms（b）for eight carbonyls in standard solution and two e-liquid samples

2.2 DNPH溶液溶劑的優(yōu)化

甲醇和乙腈為LC-MS/MS法的常用流動相，DNPH在甲醇和乙腈中的溶解性良好，因此分別采用甲醇和乙腈配制一定濃度的DNPH溶液，考察兩種溶劑產(chǎn)生的背景對檢測結(jié)果的影響。具體步驟：移取2 mL DNPH甲醇溶液（或DNPH乙腈溶液）和80μL高氯酸水溶液于10 mL容量瓶中，搖勻，室溫放置60 min進行衍生化反應。然后，加入200μL吡啶，采用甲醇（或乙腈）定容至10 mL，搖勻。將溶液過有機相濾膜，進行LC-MS/MS分析。分析條件同1.2.2節(jié)。

3.2 主要臨床表現(xiàn) 鉤蟲性十二指腸炎綜合征是由鉤蟲寄生于小腸所引起的疾病，鉤蟲性十二指腸炎綜合征患者因感染鉤蟲的數(shù)量、時間及個人的身體狀況常呈現(xiàn)輕重不一的臨床表現(xiàn)。本征多先有胃納增加而體重減輕，上腹部不適，可有不同程度的隱痛，餐后腹脹。后期食欲不振，可有惡心、嘔吐、便秘或腹瀉，甚至黑便、柏油樣便、血便等消化道出血表現(xiàn)。貧血嚴重時胃酸分泌減低，可有異嗜癖、嗜酸性粒細胞增多癥，甚至發(fā)生嗜酸性膿腫導致腸梗阻表現(xiàn)。鉤蟲感染輕者可無癥狀，部分可有貧血、營養(yǎng)不良、胃腸功能失調(diào)，重者可有發(fā)育障礙及心功能不全[7]。

結(jié)果表明，采用甲醇配制DNPH溶液會造成很大背景（圖2a），DNPH甲醇溶液背景中存在6種羰基物的2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物，這6種羰基物分別為甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、2-丁酮、丁醛。其中，甲醛-2,4-二硝基苯腙的色譜峰很高，丙酮-2,4-二硝基苯腙和2-丁酮-2,4-二硝基苯腙的色譜峰較高，乙醛-2,4-二硝基苯腙、丙醛-2,4-二硝基苯腙和丁醛-2,4-二硝基苯腙的色譜峰相對較低，這些背景峰影響測定結(jié)果的準確性。使用購自不同公司的甲醇試劑配制DNPH溶液，結(jié)果無顯著性差異。低分子量羰基物可能由甲醇試劑引入，盡管實驗中所用為HPLC級試劑，但仍含有微量的羰基物，其與DNPH反應會帶來較高的背景值。在DNPH乙腈溶液背景中檢出了甲醛-2,4-二硝基苯腙和乙醛-2,4-二硝基苯腙。已知空氣中存在甲醛和乙醛，在背景中檢測出甲醛和乙醛是不可避免的。相對于DNPH甲醇溶液，DNPH乙腈溶液的本底小得多，因此選擇用乙腈配制DNPH溶液，同時所有結(jié)果均需要扣除溶劑背景。

圖2 DNPH甲醇溶液（a）和DNPH乙腈溶液（b）背景中8種羰基物腙類產(chǎn)物的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms for eight carbonyls in treated DNPH/methanol solution（a）and DNPH/acetonitrile solution（b）

2.3 分散劑用量的選擇

電子煙液主要由丙二醇和甘油組成，其在不同電子煙液中的比例差異很大。甘油與乙腈不混溶，導致甘油質(zhì)量分數(shù)較高的電子煙液樣品與DNPH乙腈溶液混合時出現(xiàn)分層現(xiàn)象，影響測定結(jié)果。為了使反應體系均一化，在電子煙液樣品中引入一定量水進行分散后，再加入DNPH乙腈溶液。DNPH在乙腈中溶解度較大，在水中溶解度較小，當加入大量水后，DNPH會析出。因此，為了避免分層和DNPH析出，考察了水和DNPH乙腈溶液的加入量。

采用同等質(zhì)量的甘油代替電子煙液樣品進行避免分層實驗：當水的加入量大于甘油質(zhì)量的6倍以上，無論加入多少DNPH乙腈溶液，反應體系均不會出現(xiàn)分層現(xiàn)象。避免DNPH析出實驗表明，保證DNPH不析出的允許加水量與DNPH濃度有關：當DNPH濃度為2 mg/mL時，若加水量不大于乙腈使用量，DNPH不會析出；當DNPH濃度減小，允許加水量將增加。根據(jù)以上分析，對于0.2 g電子煙液樣品，加入1.2 mL水（加入水的質(zhì)量為樣品質(zhì)量的6倍），再加入2 mL 1.2 mg/mL的DNPH乙腈溶液（加水量小于乙腈使用量）進行衍生化反應時，既不會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，也不會析出DNPH。

2.4 衍生過程參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

電子煙液中的羰基物能否與DNPH完全反應生成相應的腙類衍生物顯著影響結(jié)果的準確性。以分析物與內(nèi)標的面積比作為評價指標，分別研究確定DNPH濃度、高氯酸濃度和反應時間參數(shù)（圖3）。實驗所用的電子煙液樣品可檢出甲醛、乙醛、丙酮和丙醛，為了考察衍生過程參數(shù)對電子煙液中8種羰基物衍生化反應結(jié)果的影響，在該電子煙液樣品中加入一定量丙烯醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛。

2.4.1 DNPH濃度

腙類衍生物的生成量取決于DNPH與分析物的摩爾比［25］，因此采用不同濃度的DNPH溶液處理電子煙液樣品。如圖3a所示，隨DNPH濃度增加，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙衍生物先逐漸增加，然后保持不變。DNPH濃度由0.2 mg/mL增加至1.4 mg/mL，各腙類衍生物的響應依次增加至原來的2.45倍（甲醛-2,4-二硝基苯腙）、1.20倍（乙醛-2,4-二硝基苯腙）、3.82倍（丙酮-2,4-二硝基苯腙）、1.46倍（丙烯醛-2,4-二硝基苯腙）、1.54倍（丙醛-2,4-二硝基苯腙）、1.30倍（巴豆醛-2,4-二硝基苯腙）、2.26倍（2-丁酮-2,4-二硝基苯腙）和1.18倍（丁醛-2,4-二硝基苯腙）。當DNPH濃度為1.2 mg/mL時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應最高；繼續(xù)增加DNPH濃度，響應不再增加。因此，選用DNPH濃度為1.2 mg/mL。

圖3 衍生過程參數(shù)對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effects of derivation parameters on determination results

2.4.2 高氯酸濃度

羰基物與DNPH發(fā)生反應，需要在酸性條件下進行，反應體系酸性強弱直接影響反應效率。因此，考察了不同濃度高氯酸水溶液對衍生化反應結(jié)果的影響（圖3b）。結(jié)果表明，當高氯酸濃度由1.4%增加至10.5%時，除丙烯醛外，其他7種羰基物的2,4-二硝基苯腙響應先逐漸增加，然后保持不變。當高氯酸濃度由1.4%增加至5.6%時，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙響應逐漸增加；高氯酸濃度為5.6%～7.0%范圍內(nèi)，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙的響應保持不變；高氯酸濃度繼續(xù)增加，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙響應下降。這主要是由于丙烯醛-2,4-二硝基苯腙在酸性較高條件下容易發(fā)生聚合反應［11-12］。當高氯酸濃度由1.4%增加至10.5%時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應最大值與最小值的比例分別為甲醛-2,4-二硝基苯腙1.71、乙醛-2,4-二硝基苯腙1.49、丙酮-2,4-二硝基苯腙3.10、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙7.05、丙醛-2,4-二硝基苯腙2.25、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙21.67、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙8.59和丁醛-2,4-二硝基苯腙2.16。由此可見，在羰基物與DNPH反應體系中，高氯酸濃度大小為非常重要的一個參數(shù)，尤其對丙烯醛、巴豆醛和2-丁酮衍生化反應影響很大。當高氯酸濃度為7.0%時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應均達到最大。因此，選擇高氯酸濃度為7.0%。

2.4.3 反應時間

反應時間是衍生過程的重要參數(shù)，當電子煙液中的羰基物與DNPH反應一段時間后，加入一定量吡啶終止衍生反應，以評價反應時間對測定結(jié)果的影響。圖3c表明，當反應時間為30 min時，除甲醛外，其余7種羰基物與DNPH反應完全，繼續(xù)增加反應時間至100 min，該7種羰基物的腙類衍生物無明顯變化。甲醛與DNPH反應較慢，當反應時間為60 min時，甲醛-2,4-二硝基苯腙的響應達到最大。因此，選擇反應時間為60 min。

2.5 加入吡啶的確定

文獻研究表明，丙烯醛和巴豆醛的DNPH腙類衍生物在酸性條件下易發(fā)生聚合反應［11-12］。因此在電子煙液中的羰基物與DNPH反應完全后，加入一定量吡啶中和溶液中過量的酸。考察了吡啶對電子煙液中丙烯醛和巴豆醛測定結(jié)果的影響，對樣品溶液每小時取樣測定1次，持續(xù)測定10 h。結(jié)果顯示，加入適量吡啶后，丙烯醛和巴豆醛的相對標準偏差均小于6%；而不添加吡啶時，兩種分析物的響應逐漸降低，相對標準偏差均大于20%。

2.6 方法表征

分別對系列標準工作溶液進行LC-MS/MS分析，以羰基物腙類衍生物與內(nèi)標的峰面積比對相應羰基物的濃度進行線性回歸，得到各羰基物的標準工作曲線（表2）?？芍?，標準曲線線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。以3倍信噪比（S/N=3）計算檢測限（LOD），10倍信噪比（S/N=10）計算定量限（LOQ），8種羰基物的檢測限在5～28 ng/g之間，定量限在17～93 ng/g之間。

表2 8種羰基物的線性方程、相關系數(shù)、檢測限和定量限Tab.2 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of eight carbonyls

在電子煙液樣品中分別加入低、中、高3個濃度水平進行加標回收率實驗。由表3可知，8種羰基物的平均加標回收率在92.5%～106.4%之間。對加標樣品進行5次日內(nèi)和日間平行測定，8種羰基物日內(nèi)和日間的相對標準偏差分別在3.2%～6.2%和4.1%～7.9%之間。

表3 8種羰基物的回收率、日內(nèi)和日間精密度Tab.3 Recoveries,intra-and inter-day precisions of eight carbonyls

2.7 實際樣品分析

采用該方法測定了22種電子煙液樣品中8種羰基物的質(zhì)量分數(shù)，如表4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①所測電子煙液樣品中均含有甲醛和乙醛，甲醛質(zhì)量分數(shù)在0.19～13.84μg/g之間，乙醛質(zhì)量分數(shù)在0.63～9.60μg/g之間。②有15種樣品中檢出丙酮，檢出率為68.2%，其中14種樣品中的質(zhì)量分數(shù)均小于1μg/g；僅1種樣品中質(zhì)量分數(shù)較高，為7.15μg/g。③丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛的檢出率分別為31.8%、45.4%、9.1%、31.8%、13.6%，且這5種羰基物的質(zhì)量分數(shù)均小于1μg/g。

表4 22種電子煙液樣品中8種羰基物的分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of eight carbonyls in 22 e-liquid samples (μg·g-1)

3 結(jié)論

①建立的水分散-DNPH衍生結(jié)合LC-MS/MS同時測定電子煙液中8種低分子量羰基物的方法，可有效消除基質(zhì)干擾，溶劑背景小，樣品溶液均一、穩(wěn)定；②該方法線性良好、靈敏度和精密度高、抗干擾能力強，前處理過程簡單、快速，適合大批量電子煙液樣品中8種羰基物的準確檢測。