VISA/VRSA相關(guān)耐藥進(jìn)化史及耐藥進(jìn)化代價*

羅云桃，夏啟航，王慶忠 綜述,王敬華 審校

上海市臨床檢驗中心，上海 200126

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是常見臨床病原分離菌，其多重耐藥不斷挑戰(zhàn)臨床治療底線。如今，由于患者病理特點各異，臨床醫(yī)生已無法從經(jīng)驗性用藥策略獲得更多收益。即使萬古霉素作為臨床一線治療最有效的藥物，也出現(xiàn)了萬古霉素中度耐藥性金黃色葡萄球菌(VISA)/耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)的報道。人們把這類難治性、泛耐藥細(xì)菌稱為超級細(xì)菌，并開始對其是否會突破萬古霉素最后的防線而感到擔(dān)憂。隨著越來越多VISA/VRSA耐藥機(jī)制的揭示，研究人員認(rèn)識到金葡菌為抵御外部不利因素，自身擁有一套完整且復(fù)雜的生物進(jìn)化體系。通過進(jìn)化適應(yīng)性成本交換，金葡菌獲得存活于外部環(huán)境的能力。在演進(jìn)過程中，金葡菌往往也產(chǎn)生其他關(guān)聯(lián)的代償性生理結(jié)構(gòu)和功能性改變。本文通過對金葡菌的相關(guān)耐藥進(jìn)化史進(jìn)行回顧性分析，從細(xì)菌生物進(jìn)化角度客觀討論目前VISA/VRSA的現(xiàn)狀和對臨床治療策略的影響。

1 金葡菌耐藥進(jìn)化史

1.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥史 抗菌藥物用于抗菌治療初始于1941年的青霉素，那時的療效曾讓醫(yī)生樂觀認(rèn)為，所有微生物感染疾病是可以通過抗菌藥物有效治療的,但青霉素投入臨床不久便迅速出現(xiàn)了耐青霉素金黃色葡萄球菌(PRSA)。當(dāng)時的這種PRSA被命名為噬菌體型80/81，并于20世紀(jì)50～60年代在醫(yī)院和社區(qū)引起流行[1]。隨后甲氧西林以一種半合成β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，于1959年被引入治療PRSA感染，但在臨床使用2年內(nèi)也迅速出現(xiàn)了MRSA菌株，其中一種COL菌株成為20世紀(jì)60～70年代歐洲主流傳播菌株[2]。20世紀(jì)70～80年代新一輪的MRSA菌株在美國出現(xiàn)并隨后在世界范圍流行[1,3]。20世紀(jì)90年代，MRSA繼而進(jìn)入社區(qū)引起大范圍感染(CA-MRSA)[2]，并流行至今。

1.2VISA和VRSA的耐藥史 由于純化藥物技術(shù)障礙、藥物腎毒性的因素，同時存在其他一些可用β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物，萬古霉素一直未在臨床大量推廣。20世紀(jì)80年代，當(dāng)MRSA泛濫難治，針對MRSA的改良型萬古霉素才大量使用。此后，萬古霉素耐藥腸球菌在20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)。而后，公認(rèn)的VISA/VRSA報道分別為1996年的日本(VISA)和2002年的美國(VRSA)。不過回顧文獻(xiàn)，萬古霉素敏感性降低金葡菌株的出現(xiàn)最早可追溯到1987年[3]。

2 VISA/VRSA耐藥相關(guān)進(jìn)化及代價

VISA/VRSA耐藥機(jī)制隨菌株遺傳背景和環(huán)境異質(zhì)性而復(fù)雜多變。在各種條件下，萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌(VSSA)演變成VISA/VRSA的過程并非類似。為獲得相應(yīng)適應(yīng)力，菌種會以不同進(jìn)化方式形成某些改變，包括自身方式，如基因突變、調(diào)控；也包括菌群間，如菌落亞群的更替、菌群的競爭抑制等。

2.1VISA/VRSA分子水平突變進(jìn)化 在細(xì)菌基因組測序技術(shù)未能普及臨床檢測之前，對于VISA/VRSA的分子耐藥機(jī)制，學(xué)者們并不十分清楚，認(rèn)為VISA和VRSA是各自遵循獨立的進(jìn)化路線[4]。比如VISA，世界多地病例通常與住院、持續(xù)感染、長期應(yīng)用萬古霉素治療有關(guān)。一般認(rèn)為，VISA是在依賴萬古霉素環(huán)境壓力下導(dǎo)致的長期表觀進(jìn)化結(jié)果，而非基因組突變引起。為適應(yīng)外部環(huán)境作出的成本代價，一般細(xì)菌相關(guān)基因調(diào)控遠(yuǎn)比本身基因突變來得容易。不過，基因調(diào)控往往適應(yīng)度有限，這也能在一定程度上解釋臨床分離VISA的最小抑菌濃度(MIC)值僅呈輕中度升高[4]。再者，表觀調(diào)控往往可逆。許多研究報道，VISA的抗藥性不穩(wěn)定，在無萬古霉素環(huán)境壓力下往往會恢復(fù)至VSSA狀態(tài)[4-6]。而較之VRSA，之前的研究僅發(fā)現(xiàn)其高濃度的萬古霉素耐受性(MIC≥16 g/mL)是由外源性耐萬古霉素腸球菌接合質(zhì)粒(Tn1546轉(zhuǎn)座子編碼的vanA 操作子)水平轉(zhuǎn)移至VSSA，導(dǎo)致其基因組的改變[3]。

隨著現(xiàn)代微生物分子技術(shù)的臨床推進(jìn)，對之前VISA/VRSA的理解有了明顯完善。VISA的分子進(jìn)化不僅限于萬古霉素藥物壓力下的基因調(diào)控表達(dá)或單基因位點突變。最近已發(fā)現(xiàn)眾多基因位點變異與萬古霉素MIC值中度增高相關(guān)，最主要的有ropB (編碼DNA依賴的RNA聚合酶亞單位)及walKR、vrsSR和graSR (編碼雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng))[5]。CHEN等[6]通過全基因組測序比對同源VSSA和VISA發(fā)現(xiàn)，菌株在分子進(jìn)化中2個重要的遺傳變異步驟分別伴隨著VSSA至異質(zhì)性VISA(hVISA)和hVISA至VISA的表型轉(zhuǎn)換。VSSA至hVISA轉(zhuǎn)變中，hVISA 菌株的基因變化包括基因agrC位點丟失及編碼具有多種酶活性蛋白的5個非同義突變；hVISA至VISA轉(zhuǎn)變中，有rpoB和fusA突變介入。VIDAILLAC等[7]更進(jìn)一步指出，在不同的外部環(huán)境下，即使是具有相同基因背景的菌株，VSSA至VISA的基因突變路徑也有巨大差異。對于非外源性DNA介入的VISA，往往是多步驟、多環(huán)節(jié)上基因突變的累加導(dǎo)致MIC值逐步增高。同樣，對于未攜帶外源性vanA基因的VRSA，KIM 等[5]也以類似同源VSSA與VRSA基因比對方法研究發(fā)現(xiàn)，子代VRSA具有8個非同義突變，同樣可由自身基因組改變導(dǎo)致高耐藥性，其中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因RimM、rpsK往往參與細(xì)胞分裂、生長速率、生物膜形成；KIM 等[5]還發(fā)現(xiàn)了一些存在于VISA的其他突變基因，比如vrat、walk和rpob，它們都與后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。因此，VISA/VRSA并不是以往認(rèn)為的各自具有獨立耐藥進(jìn)化機(jī)制，在臨床治療環(huán)境下，二者之間存在某些互相進(jìn)化遞進(jìn)關(guān)聯(lián)，分子耐藥機(jī)制更復(fù)雜多變。

2.2hVISA在菌群內(nèi)異質(zhì)性進(jìn)化 菌群異質(zhì)性已被證實于各類菌種內(nèi)。金葡菌小克隆菌落變異(SCV)往往是多種耐藥菌的來源，它們與整體菌群相比較，為適應(yīng)環(huán)境壓力作出了很多生理上的改變[8-9]。hVISA可看作是耐萬古霉素SCV其中的一個特別分支，具有相關(guān)生理代謝上的改變，如生長緩慢、形態(tài)變化等[10]。最近國外文獻(xiàn)頻繁用到“creep”一詞來描述hVISA的MIC值變化狀態(tài)[11]，借以說明在萬古霉素MIC敏感范圍內(nèi)，金葡菌菌群內(nèi)存在小比例的hVISA (10-6～10-5cfu)[12]，并在長期萬古霉素治療壓力下，hVISA所占比例上升而整體MIC值增高，hVISA最終成為優(yōu)勢適應(yīng)菌替代原有VSSA菌群。因此，hVISA可看作是VISA的前置過渡狀態(tài)。不過對于hVISA的來源存在很多爭議：是經(jīng)歷了長期藥物壓力誘導(dǎo)其基因選擇突變，還是hVISA本身就異質(zhì)性地自發(fā)存在于VSSA菌落內(nèi)，對于這樣的問題，可結(jié)合VISA菌種不同分布來源解答[13-14]。據(jù)報道，hVISA并不特定于醫(yī)源性感染的菌群內(nèi)[2]，有些hVISA并未接受過藥物的選擇，基于這一現(xiàn)象，某種程度上可以說，hVISA這類異質(zhì)群體是可自發(fā)存在于自然環(huán)境下的。生物物種的基因多態(tài)性賦予了物種適應(yīng)力的多樣性，這也同樣存在于金葡菌菌群內(nèi)。在無外界選擇壓力的進(jìn)化中，獲得隨機(jī)性的耐藥表型，比如VSSA內(nèi)小比例hVISA的天然存在。當(dāng)處于治療劑量的萬古霉素壓力下，hVISA以取代菌落內(nèi)其他VSSA的方式為代價[15]，迅速發(fā)展為VISA菌群，這可解釋許多臨床未經(jīng)預(yù)治療，MIC整體處于敏感范圍的VSSA僅在短期治療干預(yù)后就會出現(xiàn)VISA的情況。臨床不僅需注意長期應(yīng)用萬古霉素治療后的VISA，對于短期治療下出現(xiàn)hVISA的可能性也不容忽視。

2.3VISA菌群間競爭抑制性進(jìn)化 不同細(xì)菌間存在競爭抑制性，分泌酶類、抗菌藥物、細(xì)胞因子等壓制其他微生物以獲取同環(huán)境下更多的生存空間和資源[16]，最近有文獻(xiàn)揭示，同一金葡菌菌群內(nèi)部也存在這種情況，以同類競爭抑制作為進(jìn)化代價。KOCH等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在對MRSA分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，可明顯辨別出2個不同的、依次出現(xiàn)的菌落群體。在沒有外部環(huán)境壓力下，第1個衍生出自原菌落的菌株通過分泌毒素因子而壓制該菌群的其他群體。隨著培養(yǎng)持續(xù)，后續(xù)出現(xiàn)的第2種菌落能對第1種細(xì)菌分泌的毒素自行產(chǎn)生抗性。重要的是，經(jīng)藥物測試，第2種自帶抗性的菌株會天然對一些抗菌藥物產(chǎn)生抗性，包括VISA[16]。KOCH等[17]等的研究提示了另一種VISA進(jìn)化模式，這類實驗?zāi)Ｐ湍芡旰玫亟忉屌R床某些VISA能夠在未使用任何抗菌藥物的條件下自發(fā)產(chǎn)生；ZHU等研究[18]認(rèn)為，這種現(xiàn)象在臨床上往往需要病灶內(nèi)大量細(xì)菌數(shù)量的聚集，如深部感染傷口、膿腫厭氧部位等，對于此類隱秘性環(huán)境，藥物往往在病灶內(nèi)達(dá)不到最佳殺菌濃度。臨床上初治時更應(yīng)考慮感染確切部位，或介入外科引流、切除等手段，而非直接進(jìn)行藥物治療策略。

2.4VISA/VRSA生理和功能進(jìn)化 為適應(yīng)萬古霉素壓力，VISA/VRSA會存在形態(tài)和生理改變[10]，并隨環(huán)境壓力的撤除，VISA/VRSA適應(yīng)性代價(比如生長速率、毒力減弱等)往往具有可逆性[19]。

2.4.1形態(tài)和代謝改變 VISA/VRSA較易形成生物膜及細(xì)胞壁增厚，這些適應(yīng)性有助于細(xì)菌抱團(tuán)聚集，抵御外部萬古霉素滲透[19]。VISA生物膜和細(xì)胞壁由關(guān)鍵的附屬基因調(diào)節(jié)因子(Agr)調(diào)控，起群體感應(yīng)作用，使新生細(xì)胞壁合成增加及衰老細(xì)胞壁自溶力下降。不過，VISA/VRSA適應(yīng)性代價具有多面性關(guān)聯(lián)，耐藥性的獲得伴隨相應(yīng)其他生理的補(bǔ)償影響，如衰老細(xì)胞壁增厚會導(dǎo)致菌體物質(zhì)交換能力下降及生物膜形成影響內(nèi)部生存空間等。有研究稱，生物膜內(nèi)部會造成厭氧或缺氧，導(dǎo)致細(xì)菌只能處于半靜止、低代謝狀態(tài)[20]。生理上相應(yīng)的有些進(jìn)化代價對細(xì)菌生長不利，但也有利于耐藥菌成為持留菌，如半靜止、低代謝狀態(tài)的VISA/VRSA往往菌體分裂減少或停滯，使許多針對細(xì)胞對數(shù)生長期的藥物治療失敗。低活力、休眠態(tài)有點類似于芽孢自我保護(hù)性結(jié)構(gòu)，能抵御不利環(huán)境壓力，長期存活。

2.4.2毒力性改變 有研究認(rèn)為，VISA/VRSA存在毒力減弱現(xiàn)象[21]，與Agr系統(tǒng)下調(diào)有關(guān)[15]，導(dǎo)致相關(guān)毒性基因表達(dá)下降，如hla、 hlb、coa等[1，22-23]。VISA/VRSA毒力減弱是一種適應(yīng)性改變，同時也是細(xì)菌自我保護(hù)的一種隱秘策略[21]。VISA/VRSA的毒力減弱，弱化了菌體相關(guān)抗原的識別，易于逃逸宿主免疫系統(tǒng)。因而，臨床上如果使用次優(yōu)方案行萬古霉素治療，可能會誘導(dǎo)菌群從一種抗菌藥物敏感和毒力較強(qiáng)的狀態(tài)演變?yōu)榱硪环N抗菌藥物耐藥而毒力較弱的狀態(tài)，造成殘留VISA/VRSA菌群持續(xù)感染。

2.5VISA/VRSA側(cè)支耐藥 有研究認(rèn)為，VISA/VRSA獲得萬古霉素敏感性減弱的同時，會提高對β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性(拉鋸效應(yīng))[24]。但反過來，長期只接受β-內(nèi)酰胺類藥物治療，體內(nèi)金葡菌對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生抗性的同時，不會誘導(dǎo)其對萬古霉素的敏感性增強(qiáng)，更多為耐藥[25]。不過目前拉鋸效應(yīng)用于臨床存在很多爭議。有研究顯示，金葡菌菌株耐藥進(jìn)化有很大不確定性[24]，這類似于細(xì)菌抗菌藥物側(cè)支敏感/耐藥的概念[15，26]。最近有研究通過多種藥物兩兩組合模型，分別對大腸埃希菌做了藥敏重復(fù)性試驗[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，同樣的菌株在產(chǎn)生第1種藥物耐藥后會對第2種藥物在產(chǎn)生側(cè)支敏感性上有很大的隨機(jī)性[26-27]。產(chǎn)生隨機(jī)性的影響因素很多，比如自身細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因改變和外部環(huán)境等。有研究表明，細(xì)菌對第1種抗菌藥物耐藥時，對其他多種藥物產(chǎn)生的是側(cè)支耐藥性而非敏感性增加[27]。金葡菌的拉鋸效應(yīng)應(yīng)歸屬于細(xì)菌的抗菌藥物側(cè)支敏感/耐藥范疇。鑒于臨床來源的VISA/VRSA遺傳背景、醫(yī)療環(huán)境各異，因此，對于二線抗菌藥物的替代治療更應(yīng)遵循現(xiàn)代循證用藥而非傳統(tǒng)經(jīng)驗用藥。

3 VISA和VRSA尚未泛濫現(xiàn)狀分析

目前VISA/VRSA并沒有到如MRSA泛濫成災(zāi)的現(xiàn)狀，但很多學(xué)者認(rèn)為，這也許是時間早晚的問題。不過結(jié)合相關(guān)資料不難發(fā)現(xiàn)，的確有些因素導(dǎo)致目前還不流行。

3.1特定環(huán)境 VISA/VRSA的來源多是住院患者，與持續(xù)感染、萬古霉素治療有關(guān)。長期藥物選擇壓力，導(dǎo)致了VISA的逐步演變[21，28]。不過選擇進(jìn)化是有代價的，醫(yī)源性VISA/VRSA生物適應(yīng)力的特定性，并非能適應(yīng)醫(yī)療外環(huán)境[29]，這與當(dāng)時某些在醫(yī)療系統(tǒng)的MRSA菌株不能進(jìn)入社區(qū)流行類似[2]。

3.2檢出率 VISA耐藥表型存在可逆性。隨著環(huán)境改變，如冷凍復(fù)蘇、撤藥等，VISA會恢復(fù)到敏感狀態(tài)，并且藥敏測試只針對于對數(shù)生長期的菌群，而處于深部膿腫、相對厭氧環(huán)境的VISA菌群則易處于靜止期[23]。VISA/VRSA生長緩慢，常規(guī)臨床藥敏試驗周期并不足夠覆蓋；MIC為1～2 μg/mL的VSSA依然存在hVISA一定概率的漏檢[8]。

3.3折點 2006年，美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會重新下調(diào)了萬古霉素藥敏判定折點(MIC:2 μg/mL敏感，4～8 μg/mL中介，16 μg/mL耐藥)。折點上的改變，對于之前的研究數(shù)據(jù)，很多臨界值的VISA將被落入統(tǒng)計外。

3.4譜系特異 對于外源性vanA轉(zhuǎn)移獲得的VRSA，由于質(zhì)粒高度不穩(wěn)定性、基因水平轉(zhuǎn)移偶然性及質(zhì)粒自帶限制性修飾系統(tǒng)[19，30]，導(dǎo)致相應(yīng)耐藥獲得的罕見性，如只存在特定的醫(yī)源性金葡菌菌株上[31]。

4 臨床影響

近年來，現(xiàn)代抗感染策略正在發(fā)生巨大改變(表1)，比如萬古霉素的MIC值不僅可作為用藥的監(jiān)測手段，也可作為臨床復(fù)發(fā)后的預(yù)后指標(biāo)[12，32]。

表1 現(xiàn)代VISA/VRSA研究治療策略的轉(zhuǎn)變

5 小 結(jié)

VISA/VRSA在一系列適應(yīng)性演變過程中，其首要目的是選擇適合的進(jìn)化代價以獲得對萬古霉素的適應(yīng)力，在此過程中，其自身基因、生理狀態(tài)會發(fā)生相應(yīng)變化。菌種不同改變會造成臨床治療效果的隨機(jī)性和不確定性。如何目的性、個性化治療是研究人員和臨床醫(yī)生需要考慮的新思路。而個性化治療的前提是必須充分掌握微生物學(xué)證據(jù)，這些證據(jù)可以從VISA/VRSA基礎(chǔ)研究、臨床大數(shù)據(jù)、實驗室檢測等獲得。隨著微生物檢測技術(shù)不斷更替，相信越來越多的確實證據(jù)會指導(dǎo)臨床治療策略更完善。