尾靜脈注射miR-10a過表達(dá)慢病毒后動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內(nèi)皮損傷情況、硬化斑塊面積觀察

崔佳，李菲，張明明，馬倩，路永剛，帖彥清

1 河北省人民醫(yī)院檢驗科，石家莊050051；2 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院保健處

動脈粥樣硬化是心腦血管發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)，是由多種免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗體［1］、血小板異常激活［2］、內(nèi)皮細(xì)胞損傷［3］、炎性細(xì)胞因子［4］等共同參與的慢性炎癥性疾病。在各種病理因素如炎癥、創(chuàng)傷及自身免疫性疾病等的刺激下，可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板異常激活，使內(nèi)皮細(xì)胞及血小板表面的磷脂類物質(zhì)充分暴露，此時存在于血液中的β2糖蛋白I（β2GPI）與其表面的抗磷脂抗體（APL）相結(jié)合形成復(fù)合物［5］，進(jìn)而引起PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活［6-7］，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)膜增生及血管的病變，最終引起動脈粥樣硬化的形成［8］。微小RNA（miRNA）是一類有19～24 個核苷酸的小分子RNA，miRNA-10a 作為miRNA 中的重要類型，參與炎癥、免疫應(yīng)答反應(yīng)等多種生物學(xué)過程［9］。目前，已經(jīng)證實miR-10a與多個癌種如結(jié)直腸癌［10］、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤［11］等存在著密切的關(guān)系。既往研究［12］表明，動脈粥樣硬化組織的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-10a 通過下調(diào)炎癥分子進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的形成或進(jìn)展。2019年12月—2020年9月，本研究觀察了尾靜脈注射miR-10a 過表達(dá)慢病毒后動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內(nèi)皮損傷情況、硬化斑塊面積變化，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、過表達(dá)miR-10a慢病毒及試劑 10只雄性apoE-/-小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，過表達(dá)miR-10a 慢病毒購自北京合生基因科技有限公司。磷酸化-PI3K、磷酸化-AKT 及磷酸化mTOR 均購自CST 公司，冷凍高速離心機(jī)購自賽默飛世爾科技有限公司，正置顯微鏡購自Carl Zeiss公司，石蠟切片機(jī)購自Leica 公司，體視解剖顯微鏡購自Leica 公司，Western 用電泳儀、電轉(zhuǎn)移槽及電源均購自北京六一生物科技有限公司，全自動凝膠成像系統(tǒng)購自Syngene 公司，全自動熒光PCR 分析儀購自羅氏公司。

1.2 動物分組、動脈粥樣硬化模型制作及過表達(dá)miR-10a 慢病毒給予方法 6 周雄性apoE-/-小鼠共10 只，體質(zhì)量（21 ± 2）g，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院SPF 級環(huán)境中，室溫保持在（21.0 ± 0.2）℃，用含1.25%高膽固醇飼料喂食4 周，建立小鼠動脈粥樣硬化模型。將成功建立動脈粥樣硬化模型的小鼠隨機(jī)分為模型組和miR-10a 組，每組5 只。miR-10a 組小鼠尾靜脈注射100 μL 1×108PFU/mL 的miR-10a慢病毒，模型組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。兩組小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3 周后處死，取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織用于實驗。

1.3 兩組小鼠頭臂干動脈內(nèi)皮損傷情況觀察 取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脫水、滲透、包埋后，半薄切片，用甲苯氨藍(lán)染色觀察，光鏡定位選取所需要的部位，超薄切片（500 A），醋酸鈉、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察小鼠內(nèi)皮損傷情況。

1.4 兩組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積測算 采用改良Masson 三色染色法。取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脫水、滲透、包埋后，半薄切片，固定于Bouin液媒染，沖洗干凈，天青石藍(lán)滴染，Mayer蘇木素染3 min，酸性乙醇分化，然后用麗春紅品紅滴染，用磷鉬酸溶液處理，苯胺藍(lán)染色5 min后弱酸處理2 min，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，于普通光鏡下觀察染色情況，并測算動脈粥樣硬化斑塊面積。

1.5 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miR-10a檢測 采用Q-PCR法。使用TRIzol試劑提取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織的總RNA，按照miR?cute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cD?NA，在冰上配置PCR 反應(yīng)體系后放入PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列為：miR-10a 上游引物為5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物為5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；內(nèi)參GAP?DH上游引物為5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物為5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。以2-??Ct法表示小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miR-10a的相對表達(dá)量。

1.6 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白檢測 采用Western blotting 法。將剝離的頭臂干動脈粥樣硬化血管組織放入滅菌的研磨器中，加入細(xì)胞裂解緩沖液RI?PA，放于冰上30 min，4 ℃條件下14 000 r/min 離心10 min，收集上清液即為可溶性蛋白，應(yīng)用BCA 法檢測可溶性蛋白的濃度，然后制備SDS-PAGE 膠，將制備好的SDS-PAGE 膠放入電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳，SDSPAGE 電泳分離蛋白后再轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉，并于4 ℃冰箱中一抗孵育過夜，TBST充分洗滌后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，ECL 顯色后于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，IPP 6.0軟件進(jìn)行灰度掃描分析，以GAPDH 條帶的光密度值矯正，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值×100%。

1.7 兩組小鼠血清中抗磷脂抗體（anti-β2GP1）滴度檢測 采用Elisa 法。將小鼠處死前先進(jìn)行眼球取血，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取其上清液即為血清，按1︰1 000 的比例進(jìn)行稀釋，將質(zhì)控品和稀釋樣本加入微孔反應(yīng)板條中，室溫溫育30 min，洗滌3次，加入酶結(jié)合物室溫孵育15 min，再次洗滌，加入TMB 底物溶液室溫孵育15 min，加入終止液室溫孵育5 min，板式酶標(biāo)儀檢測血清中antiβ2GP1滴度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，比較用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠頭臂干動脈內(nèi)皮損傷情況比較 模型組在電鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞受損、剝離、內(nèi)膜增生、血管病變、表面粗糙；miR-10a 組內(nèi)皮細(xì)胞完整性較好，細(xì)胞長軸與血流方向平行，細(xì)胞排列相對整齊且內(nèi)膜表面相對平滑，見圖1。

圖1 電鏡下觀察兩組小鼠頭臂干動脈中內(nèi)皮細(xì)胞的變化情況（箭頭處為損傷的內(nèi)皮細(xì)胞）

2.2 兩組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積比較 模型組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積為（11 560.0 ± 731.0）μm2，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積為（8 779.0±461.4）μm2，兩組相比，P<0.05。

2.3 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miR-10a 相對表達(dá)量比較 模型組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miR-10a 相對表達(dá)量為0.25 ± 0.06，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miR-10a 相對表達(dá)量為0.37 ± 0.05，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量比較 模型組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量分別為1.245 ±0.124、1.058 ± 0.048、0.862 ± 0.083，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)p-PI3K、p-AKT及p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量分別為0.833 ± 0.046、0.533 ± 0.047、0.293 ± 0.050，兩 組 相 比，P均<0.05。

2.5 兩組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平比較模型組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平為（0.40 ±0.08）U/L，miR-10a 組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平為（0.26±0.06）U/L，兩組相比，P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以內(nèi)皮功能障礙、內(nèi)皮脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞增殖、血小板異常激活、細(xì)胞凋亡和壞死、局部和全身炎癥為特征的慢性炎癥性疾病，主要涉及先天性免疫及適應(yīng)性免疫，嚴(yán)重危害著中老年人的身體健康。其中，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化促炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化抗炎癥反應(yīng)之間的平衡發(fā)揮著重要的作用，一旦這種平衡在一些病理因素（如炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板的異常活化及自身免疫性疾?。┳饔孟略獾狡茐?，即可引起動脈粥樣硬化的形成［13-14］。MicroRNA 是一類約有19～24 個核苷酸的內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA［9］，它們通過與靶RNA 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡或細(xì)胞周期，miR-10a 是其家族中的一員。既往研究表明［15］，主動脈弓和主動脈腎分支的動脈粥樣硬化易感區(qū)域的內(nèi)皮miR-10a低于其它部位，說明miR-10a 對動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)具有抑制作用，但miR-10a 對動脈粥樣硬化影響的機(jī)制尚未完全清楚。為此，本研究以動脈粥樣硬化小鼠為研究對象，根據(jù)尾靜脈是否注射miR-10a過表達(dá)慢病毒，將實驗分為模型組和miR-10a 組，進(jìn)而探討miR-10a對小鼠動脈粥樣硬化的機(jī)制。

APL 主要包括抗心磷脂抗體（ACL）、β2GPI 抗體及狼瘡抗凝物（LA）等［16］。當(dāng)機(jī)體的免疫功能亢進(jìn)時，可引發(fā)自身免疫性疾病，從而釋放大量的APL。當(dāng)機(jī)體受到炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血小板異常等病理因素作用時，內(nèi)皮細(xì)胞及血小板表面的磷脂類物質(zhì)充分暴露，血液中的β2GPI 即可與其結(jié)合形成復(fù)合物，此時APL 則與此復(fù)合物發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，進(jìn)而引起下游PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活。PI3K/AKT/mTOR 信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，并參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、調(diào)控機(jī)制［17］。PI3K 是一種蛋白激酶，當(dāng)其發(fā)生磷酸化后，即可產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）第二信使，PIP3 與細(xì)胞內(nèi)AKT 表面的PH 特殊結(jié)構(gòu)域以及磷脂酰肌醇依賴性激酶-1（PDK1）結(jié)合，從而直接導(dǎo)致AKT 發(fā)生磷酸化［18-19］。AKT 具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖及血管生成等方面占據(jù)著重要的地位。mTOR 是磷脂酰亞胺-3激酶家族的一種，包括兩個功能多樣的蛋白復(fù)合物：mTOR 復(fù) 合 物1（mTORC1）和mTOR 復(fù) 合 物2（mTORC2）［20-21］。mTORC1 信號級聯(lián)反應(yīng)由p-AKT激活，同時，mTORC2 也可磷酸化AKT。mTOR 是哺乳動物自噬信號通路的主要靶點，通過調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞骨架組織，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞周期和血管生成［22］。當(dāng)上述信號通路激活后，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生而造成血管病變，最終引起動脈粥樣硬化發(fā)生。基于上述研究，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a 組anti-β2GP1 滴度水平明顯下降，且p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這與上述研究一致?；谏鲜鲅芯考氨狙芯拷Y(jié)果顯示，當(dāng)miR-10a表達(dá)量增加時，其可抑制APL 介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活而下調(diào)PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的形成，減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

綜上所述，尾靜脈注射miR-10a 過表達(dá)慢病毒可改善動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內(nèi)皮損傷情況、縮小硬化斑塊面積，其機(jī)制與過表達(dá)miR-10a 抑制抗磷脂抗體介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活有關(guān)。