維生素B7 和B12 對(duì)細(xì)菌生物被膜形成及厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響*

楊金龍 段志鴻 丁文揚(yáng) 徐嘉康 顧忠旗 梁 簫①

(1. 上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 511458；4. 浙江省嵊泗縣海洋科技研究所 浙江 舟山 202450)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)為一種具備較高營養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)貝類(Wanget al, 2012; 徐嘉康等, 2017)，常見于東海、黃海和渤海沿岸海域，主產(chǎn)區(qū)為浙江舟山東海海域，其養(yǎng)殖生產(chǎn)已發(fā)展了十幾年，年度平均養(yǎng)殖數(shù)目高達(dá)50～60 億粒以上(王如才等, 1998; 羅友聲等,2003)。但近年來，由于貽貝養(yǎng)殖區(qū)域劃分不規(guī)范、各級(jí)管理存在缺陷、貽貝災(zāi)害頻發(fā)等問題，造成厚殼貽貝資源衰退(王靖陶等, 2010)。為了恢復(fù)和發(fā)展厚殼貽貝的野生資源，陸地工廠化人工育苗、海區(qū)增殖放流、貽貝海洋牧場(chǎng)養(yǎng)殖示范區(qū)建設(shè)等技術(shù)與產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展起來(張義浩等, 2003; ?？姑? 2007; 羅海忠等, 2016)。厚殼貽貝在其生活史中必須經(jīng)歷從浮游生活階段過渡到附著生活階段的變態(tài)發(fā)育過程，才可長成成貝(Wanget al, 2012)。附著變態(tài)后的貽貝也可通過切斷其足絲的方式，尋找新的適宜環(huán)境進(jìn)行二次附著(李太武, 2013)。因此，如何提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率就成為其增養(yǎng)殖相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心技術(shù)問題。

研究表明，由海洋細(xì)菌所形成的生物被膜可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大部分海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲附著變態(tài)情況的調(diào)節(jié)(楊金龍等, 2012)。例如，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的某些細(xì)菌(Uhlingeret al, 1983;Holmstr?met al, 1999)可形成對(duì)厚殼貽貝(Yanget al,2013)和華美盤管蟲(Hydroides elegans) (Shikumaet al,2014)等幼蟲附著變態(tài)具有顯著誘導(dǎo)作用的生物被膜。生物被膜的形成受許多因素的影響(Yanget al,2014、2016a、2016b)。其中，對(duì)生物機(jī)體生理生化有影響的鈣、鐵離子等營養(yǎng)素會(huì)導(dǎo)致海洋細(xì)菌形成的生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分布和蛋白含量具有差異，并影響厚殼貽貝的附著(孫俊杰等, 2016; 常睿珩等,2020)。

B 族維生素作為一類有機(jī)物質(zhì)，廣泛存在于自然環(huán)境中，是維持生物體生命活動(dòng)的重要活性物質(zhì)(Degnanet al, 2014)。它能夠調(diào)控大多數(shù)細(xì)菌的生理和生化反應(yīng)，例如糖代謝、脂代謝、蛋白代謝和DNA合成等，從而影響生物體生長發(fā)育(Woodset al, 1953;王春華等, 2011; 王雅平等, 2019; 周瑩等, 2020)。研究表明，B 族維生素通過影響布魯桿菌屬(Brucella)和沙門菌屬(Salmonella)細(xì)菌的主要營養(yǎng)物質(zhì)代謝等生理生化反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌生物量(Matras, 1973)；B族維生素可顯著促進(jìn)海蠕蟲(Capitella teleta)幼蟲附著變態(tài)(Burnset al, 2018)。其中，維生素B7(VB7)和B12(VB12)以輔基或輔酶的形式參與機(jī)體的生理生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)新陳代謝并維持細(xì)胞、器官和組織結(jié)構(gòu)和功能的完整，確保生命活動(dòng)正常運(yùn)行(Brown, 1989;Knowleset al, 1989; Ekhardet al, 1998)。但B 族維生素對(duì)海洋細(xì)菌生物被膜形成及海洋貝類幼蟲變態(tài)的影響尚不清楚。

本研究通過將厚殼貽貝眼點(diǎn)幼蟲直接暴露于VB7 和VB12 中，以及在對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)具有高誘導(dǎo)活性的海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas marina)生物被膜形成過程中添加VB7 和VB12，明確其對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響，探索B 族維生素、海洋細(xì)菌生物被膜形成和海洋貝類幼蟲變態(tài)三者間的相互關(guān)系，為解析厚殼貽貝附著變態(tài)分子機(jī)制提供新思路和理論依據(jù)。同時(shí)，也為B 族維生素應(yīng)用于海洋牧場(chǎng)建設(shè)中人工魚礁礁體構(gòu)造和厚殼貽貝人工養(yǎng)殖行業(yè)技術(shù)的完善提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所用的海假交替單胞菌分離自浙江省舟山市嵊泗縣海域(30°72′N、122°76′E)掛板形成的自然生物被膜，并儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱中(Penget al,2020)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的VB7 和VB12 購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用的厚殼貽貝幼蟲在2019 年中旬在浙江省某縣(30°69′N、122°46′E)采集。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，以10 ind./mL 密度于鹽度30 的自然海水中暫養(yǎng)，每2 d 換水，每天投喂1×104cells/mL湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)藻液，避光18℃充氣培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(梁簫等, 2020a)。

1.2.1 VB7 和VB12 直接誘導(dǎo) 將VB7、VB12 和通過殺菌處理過的海水相溶(autoclaved filtered seawater, AFSW)，并在此基礎(chǔ)上形成pH=7.6 的母液，將母液加入無菌培養(yǎng)皿(規(guī)格為64 mm×19 mm)中，并加適量AFSW 定容至20 mL，設(shè)立空白對(duì)照組和B族維生素終濃度為0.02、0.2、2 和20 mmol/L 的不同實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置9 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將20 只眼點(diǎn)幼蟲添加到無菌培養(yǎng)皿中，置于18℃避光環(huán)境中培養(yǎng)96 h。記錄12、24、48 及96 h 的幼蟲附著變態(tài)數(shù)量，通過運(yùn)算獲得幼蟲附著變態(tài)率。

1.2.2 VB7和VB12 處理后海假交替單胞菌生長曲線繪制 參照朱艷蕾等(2016)方法測(cè)定處理后海假交替單胞菌生長曲線，取菌液(OD600nm約為1)，按1%接種量轉(zhuǎn)接至盛有300 mL 2216E 液體培養(yǎng)基的圓底燒瓶內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)，封瓶膜封口，不同培養(yǎng)時(shí)間取培養(yǎng)液，立即測(cè)定OD600nm值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.3 VB7和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜制備 參照楊金龍等(2015)方法制備生物被膜，取儲(chǔ)存的海假交替單胞菌劃線于2216E 平板上，25℃培養(yǎng)12 h 后，挑取單菌落接種到2216E 液體培養(yǎng)基中，置于25℃避光條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。以3500 r/min 離心15 min，去除上清液，用AFSW 洗滌細(xì)菌沉淀3 次，最后定容至50 mL 制成細(xì)菌懸濁液，取1 mL 稀釋(細(xì)菌懸濁液∶AFSW=1∶99)后的菌液過濾至0.22 μm濾膜上，0.1%吖啶橙染色5 min，然后在熒光倒置顯微鏡(Olympus BX51)下觀察，計(jì)算細(xì)菌濃度。在裝有無菌載玻片的無菌培養(yǎng)皿中分別加入適量的菌液與VB7 和VB12 的混合物，加適量AFSW 定容至20 mL，并使細(xì)菌的初始濃度為5×108cells/mL，VB7 和VB12最終濃度為0 (對(duì)照)和0.02 mmol/L，每組設(shè)9 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，避光18℃下培養(yǎng)48 h，以制備生物被膜。

1.2.4 幼蟲附著變態(tài)實(shí)驗(yàn) 將附有生物被膜的載玻片轉(zhuǎn)移至20 mL AFSW 無菌培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中添加20 只眼點(diǎn)幼蟲，該實(shí)驗(yàn)由空白(Blank, 無菌玻片)、腎上腺素(Epinephrine, EPI)、自然生物被膜(Bacterial biofilm, BF)這3 種對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(生物被膜)組成(Satuitoet al, 1999; Yanget al, 2008)。每組設(shè)置9 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，避光18℃條件下記錄12、24、48 和96 h 幼蟲附著變態(tài)率(梁簫等, 2020b)。

1.2.5 生物被膜細(xì)菌密度計(jì)數(shù) 借鑒楊娜等(2017)提出的方法，記錄細(xì)菌密度值，并把生物被膜在5%的福爾馬林試劑內(nèi)浸泡48 h，0.1%吖啶橙染色5 min，之后放到熒光顯微鏡(Olympus BX51)下計(jì)數(shù)細(xì)菌密度，每片生物被膜中隨機(jī)選擇10 個(gè)視野，每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 生物被膜膜厚度分析 參照楊娜等(2017)的方法分析膜厚度，將生物被膜在5%的甲醛溶液中固定24 h，避光條件下5 μg/mL 碘化丙啶(PI)浸染處理20 min，之后通過1×PBS 進(jìn)行多次清洗。并借助激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)展開詳細(xì)觀察，針對(duì)每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并自由挑選出10 個(gè)視野進(jìn)行成像分析，以確定生物被膜膜厚度。

1.2.7 生物被膜胞外產(chǎn)物分析 參照 González-Machado 等(2018)方法分析胞外產(chǎn)物。用0.9%生理鹽水清洗培養(yǎng)好的生物被膜3 次，通過相關(guān)試劑(表1)進(jìn)行染色處理，該步驟需要在沒有光線的環(huán)境下操作20 min。之后通過0.9%的鹽水進(jìn)行漂洗，并放在同樣沒有光線的環(huán)境中，待其干燥之后通過CLSM 顯微鏡詳細(xì)觀察，并自由挑選出10 個(gè)視野對(duì)其成像效果予以分析。每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 生物被膜胞外產(chǎn)物染色試劑Tab.1 Staining reagent of biofilm EPS composition

1.2.8 生物被膜可拉酸染色 參照楊金龍等(2015)的方法制備生物被膜，從載玻片刮下生物被膜，涂布在玻璃片上，然后風(fēng)干、染色?？衫崛旧珔⒖糝en等(2016)的方法，將0.3 g 堿性品紅、90 mL 含5%苯酚和10 mL 95%乙醇混合制成品紅溶液，將玻璃片染色3 min。用媒染劑溶液[2.0 g/L KAl(SO4)2∶0.3 g/L FeCl3∶1.5 g/L 丹寧酸=5∶2∶2]染色3 min。最后，1%亞甲基藍(lán)溶液染色30 s。在每次染色之前，蒸餾水沖洗生物被膜以去除上一種染色液。細(xì)菌細(xì)胞染成紅色，可拉酸染成藍(lán)色。每組設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.9 可拉酸定量 參考Obadia 等(2007)的方法定量可拉酸。從12 個(gè)生物被膜中收集細(xì)菌細(xì)胞，并將其懸浮在1 mL 蒸餾水中。100℃煮沸細(xì)菌10 min，13,000g離心15 min，棄去沉淀，收集上清液，定量可拉酸。加入4.5 mL H2SO4/H2O 溶液(6∶1)，于1 mL上清液中制成混合液，100℃反應(yīng)20 min。冷卻至25℃，將2 mL 混合液用于檢測(cè)396 nm (A396co)和427 nm(A427co)吸光度。將100 μL 的3%(m/v)半胱氨酸鹽酸溶液與剩余混合液在25℃下避光孵育1 h 后，在396 nm (A396cy)和427 nm (A427cy)測(cè)吸光度。將(A396cy-A396co)-(A427cy-A427co)的值代入L-巖藻糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(10～100 μg/mL)計(jì)算可拉酸濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用JMP 軟件(ver.10.0.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢驗(yàn)(Lianget al, 2020)。將幼蟲的變態(tài)率百分比轉(zhuǎn)化為反正弦以觀察正態(tài)分布情況，如果符合該現(xiàn)象，則需要通過單因素方法對(duì)其中的差異進(jìn)行分析。反之，便需要進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分析。Spearman多元分析方法用于幼蟲變態(tài)率與B 族維生素濃度及細(xì)菌密度之間的相關(guān)性分析，采用P為檢驗(yàn)值，r為相關(guān)系數(shù)，顯著性水平設(shè)置為0.05。生物被膜胞外產(chǎn)物含量分析使用image 軟件。

2 結(jié)果

2.1 VB7 和VB12 對(duì)幼蟲變態(tài)的直接影響

圖1 顯示，0.02、0.2 mmol/L VB7 誘導(dǎo)幼蟲變態(tài)率分別為(28.33±0.83)%和(11.67±0.83)%，VB12 誘導(dǎo)幼蟲變態(tài)率分別為(13.89±1.39)%和(1.67±0.83)%，與空白對(duì)照組相比，均可顯著提高誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲變態(tài)(P＜0.05)，其中以0.02 mmol/L 的誘導(dǎo)效果最好。而2、20 mmol/L VB7 的變態(tài)率分別為(5.56±1.30)%和(1.67±0.83)%，VB12 的變態(tài)率分別為(1.67±0.83)%和0%，與空白對(duì)照組相比，均出現(xiàn)顯著抑制作用(P＜0.05)，其中以20 mmol/L 濃度的抑制作用最強(qiáng)。

圖1 VB7 和VB12 對(duì)厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響(72 h)Fig.1 Effects of VB7 and VB12 on larval metamorphosis in the mussel M. coruscus at 72 h

2.2 VB7 和VB12 對(duì)海假交替單胞菌生長的影響

對(duì)照組和處理組海假交替單胞菌在培養(yǎng)1 h 后進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，6 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖2)。培養(yǎng)6 h時(shí)，OD600nm值分別為OD(P. marina)=0.9543、OD(P. marina+0.02mmol/LVB7)=1.0607 和OD(P. marina+0.02mmol/LVB12)=0.9923，相比于單一細(xì)菌的對(duì)照組，0.02 mmol/L 的VB7 和VB12在生長對(duì)數(shù)期對(duì)細(xì)菌生長均具有顯著影響(P＜0.05)。其中，VB7 對(duì)細(xì)菌生長的促進(jìn)作用持續(xù)至穩(wěn)定期，而VB12 在細(xì)菌生長9 h 后無明顯作用。

圖2 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生長曲線Fig.2 Growth curve of P. marina after treatment with VB7 or VB12

2.3 VB7 和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜對(duì)幼蟲變態(tài)的影響

圖3 顯示，由VB7 和VB12 與海假交替單胞菌形成的生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率顯著高于細(xì)菌單一生物被膜(P＜0.05)。0.02 mmol/L 濃度VB7 處理后，海假交替單胞菌生物被膜誘導(dǎo)幼蟲附著變態(tài)率為(71.0±3.9)%；0.02 mmol/L 濃度VB12 處理后的幼蟲附著變態(tài)率為(60.1±3.3)%，二者均顯著高于細(xì)菌單一生物被膜附著變態(tài)率(38.8±3.09)% (P＜0.05)。

圖3 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜對(duì)厚殼貽貝幼蟲變態(tài)的影響(48 h)Fig.3 Effects on metamorphosis of post-larvae on the P.marina biofilms after treatment with VB7 or VB12 at 48 h

2.4 VB7 和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜生物量的變化

圖4 顯示，初始濃度為5×108cells/mL 的海假交替單胞菌分別與VB7 和VB12 共同形成生物被膜，其細(xì)菌密度明顯高于細(xì)菌單一生物被膜(P＜0.05)，VB7 和VB12 處理后的生物被細(xì)菌聚集性增強(qiáng)(圖5)，且膜厚度顯著提高(P＜0.05)(圖6)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，生物被膜所具備的細(xì)菌密度和膜厚度均與誘導(dǎo)活性具有極顯著相關(guān)性(P＜0.05)(表2)。

圖4 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜細(xì)菌密度Fig.4 Density of P. marina biofilms after treatment with VB7 or VB12

圖5 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜形態(tài)Fig.5 CLSM reveals morphology of P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

圖6 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜厚度Fig.6 CLSM reveals thickness of P. marina biofilms after treatment with VB7 or VB12

表2 生物被膜厚度和細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between biofilm thickness,bacterial density and inducing activity

2.5 海假交替單胞菌生物被膜胞外產(chǎn)物的變化

熒光染色顯示(圖7)，海假交替單胞菌單一生物被膜細(xì)菌呈顆粒狀分布，胞外產(chǎn)物分布較為均勻，而VB7 和VB12 處理后的生物被膜細(xì)菌多聚集狀態(tài)，胞外產(chǎn)物含量明顯升高，且多呈塊狀分布。

圖7 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜胞外產(chǎn)物Fig.7 CLSM reveals extracellular products of P. marina bacterial biofilms after VB7 or VB12 treatment

3 組生物被膜α 多糖、β 多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量見圖8。與單一生物被膜相比，VB7 處理后具有更高含量的α 多糖、β 多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。其中，單一生物被膜的α 多糖含量僅為(1536.50±57.36) μm3，而VB7 處理后生物被膜的α 多糖含量為(800,590.25±46,499.65) μm3，上調(diào)了520 倍(P＜0.05)(圖8)。

2.6 處理后海假交替單胞菌生物被膜的可拉酸含量

染色結(jié)果顯示，相比于單一細(xì)菌生物被膜，VB7和VB12 處理后生物被膜可拉酸分布更密集(圖8)，且含量明顯提高(圖9)。單一細(xì)菌生物被膜可拉酸含量為(30.46±6.03) μg/mL，而VB7 和VB12 處理后含量分別為(215.78±24.18)和(158.27±23.27) μg/mL，升高了7.08 倍和5.20 倍(P＜0.05) (圖9)。

圖8 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的P. marina 生物被膜胞外產(chǎn)物含量Fig.8 CLSM reveals extracellular products of P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

圖9 媒染劑染色生物被膜光學(xué)顯微鏡的觀察Fig.9 Light microscopic observation of mordant-stained biofilms

3 討論

3.1 B 族維生素對(duì)生物被膜形成的影響

B 族維生素作為生長輔助因子，以輔基或輔酶的形式參與機(jī)體的生理生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)新陳代謝，并維持細(xì)胞、器官和組織結(jié)構(gòu)和功能的完整，是確保所有生命活動(dòng)正常運(yùn)行的重要營養(yǎng)物質(zhì)(Brownet al, 1989;Knowleset al, 1989; Ekhardet al, 1998)。本研究的結(jié)果顯示，0.02 mmol/L 濃度下VB7 和VB12 與初始細(xì)菌濃度為5×108cells/mL 的P. marina共同形成生物被膜，與P. marina單一生物被膜相比，細(xì)菌密度和膜厚度顯著增加，細(xì)菌成聚集狀態(tài)，并產(chǎn)生大量的多糖等胞外產(chǎn)物。Matras(1973)研究表明，B 族維生素可通過影響布魯桿菌屬和沙門菌屬細(xì)菌的主要營養(yǎng)物質(zhì)代謝等生理生化反應(yīng)來調(diào)節(jié)細(xì)菌生物量。因此，推測(cè)B 族維生素的加入可以提高生物被膜的生物量和胞外產(chǎn)物含量，進(jìn)而促進(jìn)生物被膜的形成。

3.2 B 族維生素對(duì)幼蟲變態(tài)的影響

3.2.1 B 族維生素對(duì)幼蟲變態(tài)的直接影響 許多海洋無脊椎動(dòng)物在發(fā)育為成體前處于浮游幼蟲階段。幼蟲的浮游階段可以短則幾分鐘，也可以長達(dá)幾個(gè)月。通常，海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲的附著變態(tài)主要受外界環(huán)境和內(nèi)源性因素控制(Crisp, 1974; Pawlik,1992)，特別是外界環(huán)境因子對(duì)于幼蟲的附著變態(tài)至關(guān)重要(Morse, 1990; McClintocket al, 2001)。B 族維生素廣泛存在于自然環(huán)境中，并作為營養(yǎng)物質(zhì)參與幼蟲的附著變態(tài)過程。Burns 等(2018)研究表明，B族維生素可通過影響海蠕蟲幼蟲的主要營養(yǎng)物質(zhì)代謝水平進(jìn)而提高幼蟲附著變態(tài)率。然而，關(guān)于B 族維生素與海洋貝類附著二者間的相互作用關(guān)系仍有待研究。

圖10 VB7 和VB12 處理后的P. marina生物被膜可拉酸含量Fig.10 Colanic acid production in P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

研究結(jié)果顯示，0.02、0.2 mmol/L 濃度下VB7和VB12 的孵育均可以顯著誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲變態(tài)。其中以0.02 mmol/L 濃度下的誘導(dǎo)作用較強(qiáng)，但2、20 mmol/L 濃度下VB7 和VB12 對(duì)幼蟲變態(tài)起抑制作用。因此，推測(cè)在一定濃度的條件下，B 族維生素可能通過增強(qiáng)幼蟲糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝及免疫系統(tǒng)功能進(jìn)而促進(jìn)厚殼貽貝等海洋貝類幼蟲的附著變態(tài)。

3.2.2 生物被膜與幼蟲變態(tài)的關(guān)系 生物被膜生物量和胞外產(chǎn)物(胞外多糖、蛋白、脂質(zhì)等)含量是影響海洋無脊椎動(dòng)物附著的關(guān)鍵因素(Kirchmanet al,1981; Hadfieldet al, 2011)。研究表明，厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)和稚貝附著都受到細(xì)菌密度的影響(Wanget al, 2012; 楊金龍等, 2013; Yanget al, 2014)。厚殼貽貝與生物被膜相關(guān)性研究證實(shí)，細(xì)菌密度與附著變態(tài)呈顯著相關(guān)；自然生物被膜和胞外產(chǎn)物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)合浦珠母貝(Pinctada fucata)幼蟲附著具有十分關(guān)鍵的誘導(dǎo)功能(Yuet al, 2010)；海洋假單胞菌Strain S9所對(duì)應(yīng)的生物被膜胞外多糖大幅度加快了海鞘(Cionaintestinalis)幼蟲附著變態(tài)(Szewzyket al,1991)。因此，推測(cè)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)除了與B族維生素的直接誘導(dǎo)作用有關(guān)外，還可能與生物被膜的生物量和胞外產(chǎn)物含量有關(guān)。研究結(jié)果顯示，VB7和VB12 處理后的生物被膜顯著提高了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率，其生物被膜的生物量和胞外產(chǎn)物含量顯著高于P. marina單一生物被膜，其中，胞外多糖含量升高520 倍。前期研究發(fā)現(xiàn)，多糖能夠誘導(dǎo)許多海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲附著變態(tài)(Kirchmanet al, 1982;Szewzyket al, 1991; Matsumuraet al, 1998;Khandeparkeret al, 2003; Baoet al, 2007; Zenget al,2015)，其中，最具代表性的是由生物學(xué)重復(fù)單元(葡萄糖、巖藻糖、半乳糖和葡萄糖醛酸)與α 鍵和β 鍵相連所組成的可拉酸(Whitfield, 2006; Schmidet al,2015)，可拉酸能在細(xì)菌周圍產(chǎn)生高度負(fù)電荷膠囊(Goebel, 1963; Allenet al, 1987)，并將吸附細(xì)菌周圍的礦物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)(Ophiret al, 1994)，促進(jìn)具有誘導(dǎo)海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲附著變態(tài)活性的附著基的形成。實(shí)驗(yàn)證明，P. marina細(xì)菌多糖相關(guān)基因缺失后，可拉酸的產(chǎn)生量增多，細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP 水平升高，c-di-GMP 水平的升高導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力降低，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌粘附和生物被膜的形成，從而提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率(Whiteleyet al, 2015; Pérez-Mendozaet al, 2016; Penget al, 2020)。本研究結(jié)果顯示，VB7 和VB12 處理后生物被膜的生物量和胞外產(chǎn)物(可拉酸)含量均顯著升高，并均對(duì)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)存在顯著誘導(dǎo)作用。因此，推測(cè)B 族維生素可能通過協(xié)同c-di-GMP 調(diào)節(jié)可拉酸的產(chǎn)生，從而正調(diào)控生物被膜的形成和厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，但B 族維生素對(duì)c-di-GMP 水平的影響尚需進(jìn)一步研究。這一發(fā)現(xiàn)為闡明生物被膜與幼蟲之間的相互作用提供了新的視角。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，VB7、VB12 兩種B 族維生素對(duì)厚殼貽貝幼蟲變態(tài)具有直接誘導(dǎo)作用。同時(shí)，VB7和VB12 通過促進(jìn)P. marina生物被膜的形成，增加生物被膜的細(xì)菌密度和膜厚度，提高生物被膜胞外產(chǎn)物含量，從而間接促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。本研究為探究厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù)和創(chuàng)新思路，同時(shí)，為B 族維生素在提高厚殼貽貝人工育苗技術(shù)、改善厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)問題和海洋牧場(chǎng)建設(shè)等生態(tài)修復(fù)方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。