長牡蠣食物組成的高通量測序分析*

李鳳雪 杜美榮 高亞平 王軍威 張義濤 張志新 蔣增杰,2①

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 山東 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 山東 青島 266071；3. 榮成楮島水產(chǎn)有限公司 山東 榮成 264312；4. 榮成市海洋發(fā)展局 山東 榮成 264300)

濾食性貝類是我國海水養(yǎng)殖的主要種類，通過攝食、生物沉積等過程在水層-底棲環(huán)境間發(fā)揮重要的生物耦連作用(Jones, 1996)，其食物來源廣泛，包括浮游植物、有機碎屑、浮游動物等(Fukumoriet al, 2008)。目前，關于濾食性貝類的食性研究采用顯微鏡鏡檢法(Kasimet al, 2009; 喬芮, 2015)、脂肪酸標志法(許強,2007)和穩(wěn)定同位素分析(Rieraet al, 1996)等方法。顯微鏡鏡檢所需樣本量較大、費時、對檢測人員要求較高，且在采樣和固定過程中，可能會忽略一些小的、易碎的和低豐度的物種(Eggeet al, 2013)；脂肪酸標志法和穩(wěn)定同位素分析法對食物來源的定性范圍較寬，難以具體確定食物組成(許強, 2007; 劉剛等,2018)。高通量測序技術能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 進行序列測定(石瓊等, 2015)，目前，該技術已被用于海參(Apostichopus japonicus) (Zhanget al,2016)、海鞘(Pyrosomella verticilliata) (Metfieset al,2013)和龍蝦(Palinuridae) (O'rorkeet al, 2012)等海洋生物的腸道內容物研究。

桑溝灣是我國北方典型的規(guī)模化貝類養(yǎng)殖海灣，位于山東半島東端，北、西、南三面為陸地環(huán)抱，灣口朝東，面向黃海(宋云利等, 1996)。20 世紀90 年代末，桑溝灣開始規(guī)?；B(yǎng)殖長牡蠣(Crassostrea gigas)。近年來，長牡蠣已成為該區(qū)域主要的養(yǎng)殖貝類(傅明珠等, 2013)。長牡蠣具有很強的濾水能力，利用鰓絲選擇和過濾食物(董波等, 2000)，研究桑溝灣養(yǎng)殖長牡蠣的食物組成對于了解該區(qū)域的餌料狀況及貝類的攝食生理響應，進而評估養(yǎng)殖容量具有重要意義。本研究選取真核生物18S rDNA 可變區(qū)V4 區(qū)作為標記基因，結合Illumina 高通量測序技術，對桑溝灣養(yǎng)殖的長牡蠣和所處養(yǎng)殖水體中真核浮游生物的群落組成、多樣性和豐度進行了分析，研究結果可為深入揭示長牡蠣的攝食生態(tài)學提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年8 月，在桑溝灣長牡蠣養(yǎng)殖區(qū)(37°3'12.42"N，122°33'44.60"E)采集了10 個長牡蠣和3 個所處養(yǎng)殖水體樣品(圖1)。所有采集的長牡蠣均在自然狀態(tài)下繁殖生長，采集區(qū)水溫為24.7℃，鹽度為31.6，pH 為7.88。采集的長牡蠣平均殼高為(113.57±7.50) mm。測量完殼高后的長牡蠣現(xiàn)場進行解剖，打開貝殼后從口腔沿食道剪開，用一次性無菌吸管吸取胃含物，轉移至已標號的1.5 mL 凍存管中，將凍存管投于液氮罐中帶回實驗室等待進一步處理。同時，在牡蠣養(yǎng)殖區(qū)采集表層(距水面0.5 m)海水1 L，經(jīng)0.45 μm 的醋酸纖維濾膜過濾后，濾膜置于凍存管內液氮保存，帶回實驗室迅速轉移至-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 長牡蠣采樣位點Fig.1 Sampling stations of C. gigas

1.2 基因組DNA 的提取

將上述13 個樣品分別用滅菌杵棒充分研磨，加入500 μL 的DNA 裂解液，于恒溫水浴鍋中55℃水浴48 h，使用試劑盒(Omega M5635-02)提取每個樣本的基因組DNA。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，采用紫外分光光度計對DNA 定量。

1.3 18S rDNA 的擴增及擴增產(chǎn)物的回收純化

取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用通用引物V547(5?-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3?)和V4R(5?-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3?)擴增18S rDNA V4 區(qū)(Stoecket al, 2010)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用Axygen 凝膠回收試劑盒回收。

1.4 文庫構建和上機測序

采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，構建的文庫經(jīng)定量和文庫檢測，合格后的利用Mi Seq reagent kit V3(600 cycles)進行雙端測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了保證分析結果的準確，首先對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)按97%的序列相似度進行歸并和OTU 劃分，選取每個OTU 中豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，通過GenBank 鑒定OTU 代表性序列的微生物分類地位。同時，根據(jù)序列數(shù)計算樣品的Alpha多樣性指數(shù)，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs 信息等。并用Kruskal-Wallis 檢驗展示不同樣本組間的alpha多樣性差異，通過繪制熱圖對樣品間關系進行展示。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)及樣品豐度及多樣性分析

對長牡蠣胃含物及所處養(yǎng)殖水體中浮游生物18S rDNA 進行 Illumina 高通量測序，平均得到128,789 條原始序列，質量過濾平均得到111,359 條高質量序列，其中，長牡蠣胃含物的原始序列平均為128,413 條，高質量序列平均為113,376 條；長牡蠣養(yǎng)殖水體的原始序列平均為130,044 條，高質量序列平均為104,638 條。在97%相似性水平上，對111,359條高質量序列劃分OTUs，一共得到1345 個OTUs，其中，長牡蠣胃含物的OTUs 數(shù)平均為773 個，養(yǎng)殖區(qū)水樣OTUs 平均為714 個(表1)。把得到的OTUs 代表序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋得到每個OTU對應的物種分類信息。除未能歸屬到任何已知分類單元的OTU 數(shù)目外，只能分類至門、綱、屬、種的OTU分別為45、51、40 和17 個，分別占OTU 總數(shù)的18.83%、21.34%、16.74%和7.11%。

表1 不同樣品的原始序列數(shù)、高質量序列數(shù)和OTUs 數(shù)Tab.1 The raw reads, high quality reads and OTUs in different samples

通過對長牡蠣胃含物及所處養(yǎng)殖水體中真核生物的群落多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)所處養(yǎng)殖水體具有較高的群落多樣性指數(shù)(表2)，且所處養(yǎng)殖水體與長牡蠣胃含物中的Chao I 指數(shù)、Observed species 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)等差異顯著(P＜0.05)(圖2)，表明所處養(yǎng)殖水體中真核浮游生物的豐富度和多樣性顯著高于長牡蠣胃含物。2 個樣品的Good's覆蓋率均高于99.9%，且隨著序列數(shù)增加，稀釋曲線趨于平穩(wěn)(圖3)，說明現(xiàn)有的測序深度足以反映樣品中絕大多數(shù)微型浮游生物信息。

圖2 Alpha 多樣性指數(shù)的分組箱線圖Fig.2 Box-plot of the Alpha diversity index

圖3 樣品稀疏曲線Fig.3 Sample rare faction curves

表2 不同樣品的真核生物群落多樣性指數(shù)Tab.2 The diversity index for eukaryote community in different samples

2.2 真核生物成分分析

從13 個樣品中共鑒定出45 個門類，其中，長牡蠣胃含物中真核生物分屬于34 個門，所處養(yǎng)殖水體分屬于37 個門，每個樣品中未鑒定出的真核生物比例為0.12%～1.46%。如圖4 所示，綠藻門(Chlorophyta)是長牡蠣胃含物和所處養(yǎng)殖水體中整體豐度最高的門類，分別占總真核生物的(36.79±9.51)%和(55.38±0.76)%。甲藻門(Pyrrophyta)是長牡蠣胃含物中真核生物的第二大門類，占總真核生物的(31.04±12.48)%；而在所處養(yǎng)殖水體中，脊索動物門(Chordata)占總真核生物的(32.58±2.37)%，是真核生物的第二大門類。

圖4 所處養(yǎng)殖水體及長牡蠣胃含物中真核生物的物種組成Fig.4 Eukaryote composition in aquaculture area and stomach of C. gigas

在長牡蠣胃含物中，前10 個豐度最高的門類占總體的87.27%～96.79%，平均占比94.07%。如圖5a所示，長牡蠣胃含物中真核生物在門水平上的豐度差異顯著，其中，綠藻門、甲藻門、鏈型植物(Streptophytina)、硅藻門(Bacillariophyta)和原生動物(Protozoa)為主要類群，相對豐度分別為37.94%、36.11%、10.43%、8.48%和4.11%。綠藻門中的主要類群為共球藻綱(Trebouxiophyceae)、Picochlorum屬的微微型單細胞藻類；甲藻門中的主要類群分屬于橫裂甲藻綱(Dinophyceae)、共生藻屬(Symbiodinium)；鏈型植物主要為菊亞目(Asterales)、菊科(Asteraceae)中的一些種類；硅藻門的主要類群為中心硅藻綱(Coscinodiscophyceae)、海鏈藻屬(Thalassiosira)的浮游植物；原生動物主要為頂復門(Apicomplexa)、纖毛門(Ciliophora)和微型鞭毛蟲類(Microstrichinella)等。在所處養(yǎng)殖水體中，前10 個豐度最高的門類占總體的98.00%，如圖5b 所示，綠藻門、脊索動物門、節(jié)肢動物門、甲藻門和硅藻門為其主要類群，相對豐度分別為56.49%、33.31%、5.19%、1.59%和1.41%，綠藻門和脊索動物門的占比非常大，占到了總真核生物的89.80%。綠藻門中的主要類群是Picochlorum屬和Micromonas屬的微微型單細胞藻類；脊索動物門中的主要類群為尾索動物亞門(Chordata)海鞘綱(Ascidiacea)中的浮游動物；節(jié)肢動物門中的類群主要分屬于六肢幼蟲綱(Hexanauplia) 擬哲水蚤屬(Paracalanus)；甲藻門的主要類群為橫裂甲藻綱共生藻屬中的浮游植物；硅藻門主要分屬于中心硅藻綱海鏈藻屬。

圖5 長牡蠣胃含物(a)及所處養(yǎng)殖水體中(b)10 個豐度最高門類相對豐度Fig.5 Relative abundance of 10 most abundant phyla in stomach content (a) of C. gigas and aquaculture area (b)

2.3 長牡蠣胃含物與所處養(yǎng)殖水體中真核生物組成的關系

為展示各樣本的物種豐度分布趨勢，使用平均豐度前50 位的屬水平豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖，進行物種組成分析(圖6)。結果顯示，樣品分為2 組，一組是包含長牡蠣胃含物中的10 個樣品，另一組包含所處養(yǎng)殖水體的3 個樣品。利用Primer 進行相似性百分比分析發(fā)現(xiàn)，所處養(yǎng)殖水體組內相似性為73.68%，長牡蠣胃含物組內相似性為 67.98%，二者差異性為59.09%。表明長牡蠣胃含物和所處養(yǎng)殖水體中的真核生物存在一定差異性，且長牡蠣個體間攝食具有差異性。為更直觀地體現(xiàn)長牡蠣胃含物與所處養(yǎng)殖水體中群落組成的差異性和相似性，構建韋恩圖(圖7)。長牡蠣胃含物和所處養(yǎng)殖水體中真核生物共有1345 個OTUs，其中，胃含物中特有的OTUs 有572 個，約占總OTUs 的42.53%；所處養(yǎng)殖水體中特有的OTUs為631 個，占總OTUs 的46.91%；2 個樣品共有OTUs 142 個，約占總OTUs 的10.56%。共有物種中，在門水平上相對豐度較高的物種主要分屬于脊索動物門、綠藻門和甲藻門；在屬水平上主要是微微型綠藻、共生藻屬、海鏈藻屬中的浮游植物。

圖6 不同樣品真核生物組成聚類熱圖Fig.6 Hierarchically clustered heatmap of the eukaryotic composition of different samples

圖7 不同樣品中OTUs 分布韋恩圖Fig.7 Venn diagram showing the unique and shared OTUs in samples

3 討論

本研究運用高通量測序技術對長牡蠣所處養(yǎng)殖水體中的真核生物進行了采集和優(yōu)勢種分析。經(jīng)鑒定，所處養(yǎng)殖水體中共鑒定出真核生物37 門155 屬165 種，其中，綠藻門18 屬21 種，主要以Picochlorum屬的微微型單細胞藻為主，是第一大類群，占總浮游生物的56.49%，這與王曉敏(2017)對桑溝灣浮游植物研究有一定的差異，其調查結果為硅藻類浮游植物占優(yōu)勢。造成這種現(xiàn)象的原因推測一方面是鑒定方法的不同。王曉敏(2017)使用的是傳統(tǒng)的顯微鏡技術，光學顯微鏡很難對粒徑較小的浮游植物(如微微型浮游植物和部分微型浮游植物)分類鑒定(Mackeyet al,1996; 鄧春梅等, 2010)，此次調查的優(yōu)勢種——Picochlorum屬微藻是一種粒徑＜2 μm 的單細胞海洋綠藻(Hironaka, 2000)，傳統(tǒng)的顯微鏡技術可能會忽視它的存在。另一方面是采樣位置的差異。王曉敏(2017)通過對全灣的調查得出硅藻為桑溝灣的優(yōu)勢物種，本實驗僅研究了牡蠣養(yǎng)殖區(qū)的主要種類。有研究表明，由于濾食性貝類的攝食機制，長期高密度養(yǎng)殖濾食性貝類的海域容易出現(xiàn)浮游植物小型化的趨勢，個體較大的優(yōu)勢種類逐漸被個體較小的種類代替(Nakamuraet al, 2000; Frauet al, 2016)，徐文琦等(2016)及李鳳雪等(2020)對桑溝灣的研究也驗證了這點。由此可見，濾食性貝類的養(yǎng)殖對浮游植物群落結構造成了一定影響。脊索動物門6 屬6 種，主要以海鞘綱生物為主，為第二大類群。海鞘綱營固著生活(齊占會等, 2010)，是有害的污損生物(韓帥帥等, 2018; 周斌等, 2016)，桑溝灣大規(guī)模的貝藻養(yǎng)殖活動為海鞘提供大量的附著基，8 月，玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和柄海鞘(Styela clava)達到了最高峰(王光花等, 2005)，嚴重影響了貝類養(yǎng)殖活動。海鞘雖是固著性生物，但其受精卵會首先變成可自由游泳的幼體，之后經(jīng)過變態(tài)才進入固著生活的階段(Dybern, 1965; Svaneet al, 1993)，適宜的溫度和旺盛的繁殖力使其成為牡蠣養(yǎng)殖區(qū)第二大類真核浮游生物。玻璃海鞘身體呈透明態(tài)，傳統(tǒng)的顯微鏡研究往往會忽視其存在，從而影響了對浮游生物優(yōu)勢種類的判斷。高通量測序技術通過對物種DNA 分子進行序列測定和比對，從而彌補了這一不足。

濾食性貝類能攝取環(huán)境中所有可以利用的有機質，并通過顆粒選擇將可利用的食物顆粒分選出來以最大程度地獲得能量(Wardet al, 2004)。近年來，很多學者運用不同方法研究了長牡蠣的食物來源。Riera等(1996)運用穩(wěn)定碳同位素分析法研究了法國Marennes-Oléron 海灣長牡蠣的食物來源，表明陸源有機質和底棲硅藻對長牡蠣有巨大貢獻；Kasim 等(2009)運用鏡檢法分析了日本Akkeshi-ko 河口長牡蠣的胃含物，表明底棲硅藻是其主要的食物來源，其次是浮游硅藻和甲藻；許強(2007)運用脂肪酸標記法分析了潮間帶長牡蠣的食物來源，表明長牡蠣的餌料主要來源于硅藻，其次是鞭毛藻和大型綠藻床；王先鋒等(2017)利用18S rDNA 方法分析了中國海州灣平島太平灣長牡蠣的攝食情況，發(fā)現(xiàn)鏈型植物是長牡蠣胃含物中整體豐度最高的門類，其次是綠藻門和囊泡蟲門(Alveolata)。本研究在長牡蠣胃含物中發(fā)現(xiàn)真核生物34 門144 屬153 種，綠藻門和甲藻門是其主要的攝食類群，分別占總食物的37.94%和36.11%。有研究表明，長牡蠣對2 μm 顆粒物的保留效率僅為50%(Riisgard, 1988)，但本研究卻在長牡蠣胃含物中發(fā)現(xiàn)了大量＜2 μm 的共球藻綱Picochlorum屬單細胞海洋綠藻。造成這種現(xiàn)象的原因推測有兩點，一是王芳等(1998)通過掃描電鏡觀察了太平洋牡蠣的鰓結構，發(fā)現(xiàn)它的過濾器官孔隙直徑＜1 μm，可以有效地濾取大多數(shù)浮游植物細胞。作為長牡蠣適口餌料的硅藻類浮游植物在該區(qū)域含量較低，僅占總真核浮游生物的8.48%，在這種情況下，占比56.49%的綠藻門可通過長牡蠣的多次濾取成為了其補充碳源，有研究表明，貝類的餌料結構與海區(qū)浮游植物種類和數(shù)量明顯相關(郭皓等, 1999)。二是綠藻分泌大量的胞外聚合物，使藻表面帶有負電荷和具有粘附性(Gutnicket al,2000; Palet al, 2008)，藻細胞通過靜電及吸附作用形成藻-菌、藻-藻聚合體(許荔萍, 2017)，增大了微藻粒徑，從而增加了長牡蠣對其的保留效率。長牡蠣的胃中除含有大量海洋性天然餌料如綠藻、甲藻等外，還有相當數(shù)量的鏈型植物(主要為菊亞目菊科中的類群)。可能的解釋是長牡蠣的采樣區(qū)域位于榮成桑溝灣靠近楮島村的牡蠣養(yǎng)殖區(qū)，楮島村的馬路兩邊及田地附近栽種了大量的劍葉金雞菊(Coreopsis lanceolata)，花期為5—9 月，為入侵種類，繁殖力很強，通過“風傳媒”方式傳播(曾建軍等, 2012)。一方面，劍葉金雞菊的花粉隨海風傳播到海水中，經(jīng)過海流的傳播，這些顆?？赡鼙婚L牡蠣濾食；另一方面，其葉片等組織脫落腐爛后，隨著雨水流入海水中被長牡蠣攝食。這在一定程度上也說明了長牡蠣的營養(yǎng)可塑性，表明長牡蠣的食物源不僅僅來源于海洋，而且還攝食鏈型植物。

在長牡蠣胃含物中，還發(fā)現(xiàn)了相當比例的原生動物(其主要為頂復門、纖毛門和微型鞭毛蟲類等)，占總真核生物的4.11%。原生動物消耗細菌和微微型浮游生物(Leakey, 1992)，并且被眾多中型浮游動物(尤其是橈足類)所攝食(Hartmannet al, 2011)，它們被認為是微微型浮游生物與微型或者大型浮游生物之間的主要營養(yǎng)紐帶，在海洋食物網(wǎng)中起著承上啟下的作用(Stoeckeret al, 1990)。在長牡蠣胃中發(fā)現(xiàn)了4.11%的原生動物，這也說明了原生動物在微微型浮游生物與濾食性貝類之間也充當著重要的橋梁作用，在浮游植物匱乏甚至充足時，原生動物可作為濾食性貝類的補充碳源。有研究表明，海洋中超過50%的初級生產(chǎn)力是由＜3 μm 的單細胞浮游植物所貢獻(Benovic,1986)，在本研究區(qū)域更是占海水中總真核生物的56.49%。這部分浮游植物雖不能被濾食性貝類有效保留，但它們可以通過原生動物實現(xiàn)對其的間接利用，微微型浮游植物通過這種“打包”作用將能量傳遞到濾食性貝類中。以微微型浮游植物為起點的微型生物食物網(wǎng)在淺海貝類養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中占有十分重要的地位。在所處養(yǎng)殖水體中，Picochlorum屬、海鞘綱、哲水蚤屬、共生藻屬和海鏈藻屬中的浮游生物為主要類群；在長牡蠣胃含物中，Picochlorum屬、共生藻屬、菊科和海鏈藻屬中的生物為其主要類群。通過對長牡蠣胃含物內和所處養(yǎng)殖水體中物種組成和相對豐度百分比相似性分析可知，長牡蠣可濾食的物種平均占所在海域中物種的一半以上，但主要攝食的種類只有有限的幾類，這與張雪(2013)對蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)的食性研究結果相一致。調查期間，長牡蠣傾向于攝食占調查區(qū)域真核浮游生物豐度比例較高的微微型綠藻、共生藻屬和海鏈藻屬中的浮游植物，說明長牡蠣對食物具有選擇性且受海域可攝食浮游生物豐度的影響，可攝食浮游生物豐度的變化可引起長牡蠣的食物組成及相對豐度的變動。

本研究發(fā)現(xiàn)，長牡蠣胃含物中含有水體中不存在的OTUs 572 個，造成這種現(xiàn)象的原因推測有以下幾點：一方面長牡蠣胃含物特有OTUs 比對歸類后主要為頂復門艾美球蟲科(Eimeridae)、壺菌門(Chytridiomycota)壺菌綱(Chytridiomycetes)和鏈型植物豆科中的生物，艾美球蟲科和壺菌綱中的一些種類可以寄生在貝類的腸道中(周永燦, 2000; 陳皓文等, 2007)，而水體中的含量較低，達不到檢測限度；豆科植物(Leguminosae)來自于陸地，并不是海洋中的常駐物種，被長牡蠣攝食后在消化道中需一定時間才可以被完全消化吸收，推測在此期間，豆科植物的腐爛組織可能已隨海流飄走或是沉入海底，采集的水樣具有偶然性，沒有采集到，后續(xù)會增加采樣數(shù)量以消除偶然性誤差。另一方面，長牡蠣胃含物中特有的物種在海水中的占比非常低，低于檢測限度(0.5 ng/μL)，無法對其DNA 進行擴增，但通過生物富集作用這些較低的物種在長牡蠣的胃含物中進行積累，從而在胃含物中檢測到。

研究表明，長牡蠣胃含物中真核生物成分復雜，食物來源豐富，不僅含有浮游植物等初級生產(chǎn)者，還包括原生動物等次級消費者。本研究采用高通量測序技術成功識別出夏季長牡蠣的食物組成，但海洋中的浮游生物隨季節(jié)變化，這也在很大程度上左右著濾食性貝類的餌料結構組成，后續(xù)將嘗試將時間步長加密到季節(jié)尺度，為系統(tǒng)掌握不同季節(jié)長牡蠣的食譜組成“快照”奠定基礎。