不同養(yǎng)殖密度對中國明對蝦生長和能量代謝的影響*

張海恩 何玉英,2① 李 健,2 韓 旭,3 謝擁軍

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 山東 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 山東 青島 266071；3. 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學) 上海 201306；4. 河北省水產(chǎn)良種與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測保護總站 河北 石家莊 050001)

中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)為我國近海特有的品種，主要分布在黃海、渤海和朝鮮西部沿海，是我國海水養(yǎng)殖的重要種類。為了滿足人們的需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖的不斷擴大和過度集約化，高密度養(yǎng)殖已成為提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、降低養(yǎng)殖成本的重要途徑。然而，高密度養(yǎng)殖增加了個體之間對資源與空間的競爭，蝦在高密度養(yǎng)殖下會更頻繁地游動，造成更多的能量消耗而影響生長(Costaet al, 2016)，最終可能會導致對蝦生存能力降低。

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制是將應激反應產(chǎn)生的激素分泌到血液中，由血液循環(huán)系統(tǒng)帶到靶細胞上發(fā)揮作用，會引起機體發(fā)生一系列的生理生化反應，包括主要能量物質(zhì)代謝、免疫能力、呼吸作用等。能量的儲存與釋放是一切生物生存最基本的活動，所以，主要能量代謝是研究的重要部分。當生物體處于脅迫時，糖類作為首要和迅速的能源物質(zhì)被用于供能，動用的碳水化合物以單糖形式進入血淋巴，導致血糖濃度升高(Sanchoet al, 1997)。其中，血液是發(fā)揮物質(zhì)運輸、調(diào)節(jié)生理等功能的一項非常重要組織，可以反映機體的健康狀況；血糖已被認為是動物受到脅迫的一個靈敏指標，而脂類、蛋白質(zhì)含量的改變也是甲殼動物在遭遇脅迫時的一種常見效應。已有研究表明，重復取樣(Racottaet al, 2007; Palacioset al,1999)、缺氧(Hallet al, 2010)及氨氮(NH4+-N)脅迫(Racotta,et al, 2000)等條件均使對蝦血液中能量物質(zhì)發(fā)生不同程度的變化。密度脅迫作為養(yǎng)殖過程中重要環(huán)境因子，會對養(yǎng)殖對蝦造成一定的生理生化影響。衣萌萌等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度可改變凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量在體內(nèi)的積累過程，所以，研究主要能量物質(zhì)的代謝和利用具有重要的意義。

目前，有關(guān)中國明對蝦在密度脅迫下生長與能量代謝關(guān)系的研究相對較少。本研究通過對不同養(yǎng)殖密度下，中國明對蝦生長指標、血液能量代謝產(chǎn)物含量和相關(guān)酶活力指標的測定，探究中國明對蝦生長性能及體內(nèi)能量代謝需求的類型，以期為進一步研究中國明對蝦在不同密度脅迫下的適應機制提供參考，并為中國明對蝦的養(yǎng)殖提供相應的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用中國明對蝦于2018 年7 月取自山東省濰坊昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責任公司。平均體長為(7.20±0.21) cm，體重為(4.50±0.04) g，置于養(yǎng)殖公司室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d 后用于密度實驗。

1.2 實驗設(shè)計

本實驗采用單個規(guī)格為50 cm×50 cm×80 cm 的網(wǎng)箱進行養(yǎng)殖實驗，所有實驗網(wǎng)箱統(tǒng)一放置在半徑為1.5 m、高為0.8 m 的圓形水泥池中，水位保持0.6 m，消除環(huán)境因素對實驗的影響。實驗共設(shè)置4 個養(yǎng)殖密度，每個網(wǎng)箱分別放養(yǎng)15、30、45 和60 尾中國明對蝦，密度分別設(shè)為100、200、300 和400 尾/m3，標記為G1、G2、G3 和G4 組，每個養(yǎng)殖密度3 個重復，實驗周期為28 d，分別在0、1、7、14、28 d 取樣，每個時間點取3 尾對蝦。

1.3 飼養(yǎng)管理

實驗用水為過濾凈化后的天然海水，鹽度為31.52～33.61，水溫為25℃～28℃，pH 為8.06～8.19，溶解氧(DO)為5.81～6.62 mg/L，24 h 持續(xù)充氧，每天投喂對蝦配合飼料(天馬科技公司，粒徑為1.4 mm，水分≤11.0，粗蛋白質(zhì)≥50，粗脂肪≥4.0，粗纖維≤5.0，氨基酸≥2.4，粗灰分≤17.0)，投喂量為中國明對蝦體重的6%，分3 次投喂(08:00、16:00 和22:00)。實驗用蝦在實驗開始時用眼標標記，養(yǎng)殖過程中，死亡對蝦及時取出。為保持實驗密度，從備養(yǎng)群體中選取規(guī)格一致的對蝦進行補充。每天換水1/3，每3 d 檢測1 次水質(zhì)，使亞硝酸鹽等指標保持在中國明對蝦的安全閾值內(nèi)。每7 d 測量1 次體長、體重，記錄每個實驗組的死亡個數(shù)，統(tǒng)計死亡率。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品的采集 按照取樣時間從各實驗組隨機選取3 尾中國明對蝦，抽取血淋巴，使用1 mL 一次性注射器吸取0.5 mL 4℃預冷的抗凝劑，從對蝦的圍心腔抽取0.5 mL 的血淋巴液，將每組的3 尾對蝦的血淋巴充分混合后，加入不含RNase 的1.5 mL 離心管，以4500 r/min 離心15 min，取上清液，置–80℃冰箱保存。

1.4.2 生長指標的測定

增重率(weight gain rate,WGR,100%)=100×(W2–W1)/W1;

相對增長率(relative growth rate, AGR, %/d)=100×(L2–L1)/d；

特定生長率(specific growth rate, SGR, %/d)=100×(lnW2－lnW1)/d；

體重差異系數(shù)(coefficient of variability weight,CVW, 100%)=體重標準差/平均體重；

成活率(survival rate, SR, %)=100×N2/N1

式中，W1和W2分別為初始體重和末體重；L1和L2分別為初始體長和末體長；N1和N2分別為實驗初始尾數(shù)和結(jié)束尾數(shù)，d為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4.3 能量代謝相關(guān)產(chǎn)物的測定 葡萄糖(Glc)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、甘油三酯(TG)和游離氨基酸(FAA)含量，均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，測定方法參照所附說明書。

1.4.4 能量代謝相關(guān)酶含量測定 琥珀酸脫氫酶(SDH)、乳酸脫氫酶(LDH)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和6-磷酸果糖激酶(6-PFK)活性，均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定，測定方法參照所附說明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤(Mean±SE)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)進行處理，Duncan 多重比較進行差異顯著性檢驗。P<0.05 為差異顯著水平，以P<0.01 為差異極顯著，使用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦生長的影響

從表1 可以看出，中國明對蝦的SR、WGR、AGR、SGR 呈現(xiàn)隨養(yǎng)殖密度的增加而降低的趨勢。G1 組SR最高，為73.2%，與G2 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組與G1 組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，SR 分別下降，為47.1%和38.2%。G2 組的WGR、AGR 和SGR 均最高，與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組與G1 組相比，分別達顯著水平(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。隨著養(yǎng)殖密度的增加，CVW 呈上升趨勢；與G1 組相比，G2 組的CVW 顯著升高(P<0.05)；G1 組與G3、G4 組相比差異極顯著(P<0.01)，說明隨著養(yǎng)殖密度的升高，中國明對蝦生長的整齊度開始下降。

表1 密度脅迫下對中國明對蝦生長指標的影響Tab.1 Effects of density stress on growth indicators of F. chinensis

2.2 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦能量代謝產(chǎn)物的影響

從圖1A～C 可以看出，除G1 組外，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦體內(nèi)的Glc、LA 和PA 含量整體呈上升的趨勢，并隨著養(yǎng)殖時間的增加，3 種含量呈先上升后下降的趨勢。其中，G2 組的Glc、LA 和PA 含量變化最小，趨于穩(wěn)定，與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組的含量均顯著高于G1 組(P<0.05)；G4 組在養(yǎng)殖7 d 時達到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)。

隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦體內(nèi)TG 含量整體呈下降的趨勢，且隨養(yǎng)殖時間增加，TG 含量呈先下降后上升再下降的變化趨勢。其中，G2 組的TG與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 組分別在1 和28 d 顯著低于G1 組(P<0.05)；G4 組在不同養(yǎng)殖時間均顯著低于G1 和G2 組(P<0.05)(圖1D)。不同養(yǎng)殖密度下，中國明對蝦的 FAA 含量變化差異不顯著(P>0.05)(圖1E)。

圖1 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦能量代謝產(chǎn)物的影響Fig.1 Effects of density on energy metabolism products of F. chinensis

2.3 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦代謝酶活性的影響

從圖2A、圖2C～E 可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦的LDH、6-PEK、HK 和PK 的活性整體呈上升的趨勢，且隨養(yǎng)殖時間的增加呈先上升后下降的趨勢。其中，G2 組的LDH、6-PEK、HK 和PK活性整體變化與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 組的4 種酶活性均在養(yǎng)殖7 d 時開始顯著提高(P<0.05)。6-PEK 在14 d 時達到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)；G4 組的4 種酶活性最高且顯著高于G1和G2 組(P<0.05)。LDH、6-PEK、HK 和PK 在14 d 時均達到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)。隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦體內(nèi)SDH 活性整體呈下降的趨勢，且隨著養(yǎng)殖時間的增加，G1 和G2 組SDH 活性呈先下降后上升的趨勢，G1 和G2 組之間相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組SDH 活性顯著降低(P<0.05)，G4 組在28 d 時與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)(圖2B)。

圖2 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦能量代謝酶活性的影響Fig.2 Effects of density on the activities of energy metabolism enzymes of F. chinensis

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦生長的影響

通常認為，個體增長速度可以作為一個衡量密度脅迫的指標，不同養(yǎng)殖密度對個體生長的影響不同。劉國興等(2014)對克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)研究表明，隨著養(yǎng)殖密度增加，對蝦個體體重增長減少。在本研究中，G2 組對蝦的各生長指標最高，說明養(yǎng)殖密度為200 尾/m3對中國明對蝦的生長影響不顯著，但隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦的SR、WGR、AGR 和SGR 均顯著降低，CVW 顯著提高，與劉國興等(2014)對克氏原螯蝦及Marques 等(2000)對凡納濱對蝦的研究結(jié)果相一致，表明高養(yǎng)殖密度嚴重影響對蝦的生長。同時也說明，200 尾/m3密度為本研究的臨界點。在對溪紅點鮭(Salvelinus leucomaenis) (Vijayanet al, 1988)、史氏鱘(Acipenser schrencki)(李大鵬等,2004) 和大西洋鳙鰈(Hippoglossus hippoglossus)(Bj?rnsson, 1994)等研究發(fā)現(xiàn)，在某個密度范圍內(nèi)，隨著個體的不斷增長，空間的制約對生物個體的影響越大。當密度低于某個臨界值時，個體的生長指標與密度之間呈正相關(guān)或不相關(guān)，但當密度高于此臨界值時，個體的生長指標與密度之間呈負相關(guān)(張龍崗等, 2017)。本研究中，G2 組的生長指標最高，所以，當中國明對蝦規(guī)格為4.5 g 時，其養(yǎng)殖密度在100～200 尾/m3為宜。

3.2 養(yǎng)殖密度對中國明對蝦能量代謝的影響

能量代謝主要涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等途徑，外界任何刺激都需要通過動員體內(nèi)能源物質(zhì)來滿足其對能量的額外需求，緩解環(huán)境帶來的壓力(連春盎等, 2017)。在脅迫條件下，增加糖代謝是對脅迫的常見反應，同樣，機體也會通過相關(guān)代謝酶的響應，消耗脂肪和蛋白質(zhì)來滿足其對能量的需求(韓宇田等, 2012)。

在本研究中，G1 和G2 組Glc、LA 和PA 含量變化平穩(wěn)，隨著養(yǎng)殖密度的增加，G3 和G4 組的三者含量顯著提高。在對鯪魚(Cirrhinus molitorella)的研究中，密度脅迫下，Glc 和LA 含量的變化趨勢與本研究一致(Tejpalet al, 2009)，Glc 顯著升高，這表明對能源的需求增加，必須提高可代謝物質(zhì)的利用，這可能是由于高密度引起對蝦種內(nèi)激烈爭斗，從而使肝糖元或肌糖元不斷分解，產(chǎn)生Glc 并被運送至血液所致(韓宇田,2012)。LA 含量顯著升高，說明養(yǎng)殖密度增加可能導致對蝦機體補償厭氧代謝升高。另外，機體進行糖代謝時，Glc首先通過糖酵解水解成PA，為機體提供少量能量，引起PA 含量的升高(戴超等, 2013)。除了上述物質(zhì)，中國明對蝦體內(nèi)TG 含量也發(fā)生了變化，G3和G4 組TG 含量顯著下降，這說明高密度養(yǎng)殖可能導致了對蝦機體更高的能量需求和補償性響應，繼續(xù)利用脂類作為能源物質(zhì)。在硬骨魚類中，已經(jīng)報道了在密度脅迫條件下可增強脂類代謝，以應對增加的能量需求(Polakofet al, 2006)。在本研究中，不同養(yǎng)殖密度組之間游離氨基酸變化不顯著，則表明蛋白質(zhì)代謝未受到顯著影響。Wu 等(2000)研究表明，在饑餓脅迫和蛻皮中，中國明對蝦優(yōu)先利用蛋白質(zhì)和脂質(zhì)滿足能源需求，所以，在不同脅迫條件下，中國明對蝦利用能量代謝物質(zhì)種類的順序不同。在密度脅迫下，中國明對蝦更傾向于利用糖類和脂類作為能源。

大多數(shù)無脊椎動物、甲殼類動物面臨環(huán)境脅迫等不良條件下，會切換成另一種厭氧能量代謝，即糖酵解。HK、6-PEK 和PK 是糖分解過程中的限速酶，這3 種酶的活性可以反映糖酵解水平(Greenberget al,1960)。糖酵解速率的提高，有利于三磷酸腺苷酶(ATP)的生成，提高機體抵抗脅迫的耐受能力(Raúlet al,2002)。本研究結(jié)果表明，G3 和G4 組3 種限速酶活力顯著提高，表明高密度養(yǎng)殖下，對蝦通過提高糖酵解速率，提高機體對高養(yǎng)殖密度的耐受能力，從而用于對蝦生長部分的能量減少。戴超等(2013)對低溫脅迫下三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的能量變化研究中也有相似結(jié)果。LDH 是一種重要的糖酵解酶，當機體在脅迫狀態(tài)下需要額外能量供給的時候，顯得尤為重要。本研究結(jié)果表明，G3 和G4 組顯著提高了中國明對蝦LDH 活力，說明丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化增加，高密度養(yǎng)殖增強了組織的無氧代謝，與Gao 等(2018)研究結(jié)果相一致。SDH 作為參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜中的酶，可在一定程度上反映有氧代謝的水平(王鏡巖等, 2002)。本研究中，SDH 活性在G3 和G4 組中顯著降低，其活性的降低表明三羧酸循環(huán)活性的下降，進一步表明高養(yǎng)殖密度抑制了組織的有氧代謝。

4 結(jié)論

綜上研究表明，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國明對蝦的SR 降低，生長的整齊度開始下降，顯著影響中國明對蝦的生長。在高養(yǎng)殖密度下，中國明對蝦更傾向于利用糖類和脂類作為能源，密度過高導致機體氧化代謝途徑發(fā)生變化，分解代謝增強，有氧代謝受到抑制，而無氧代謝被激活。在本研究中，200 尾/m3的生長指標最高，且能量代謝消耗小。所以，當中國明對蝦規(guī)格為4.5 g 時，其養(yǎng)殖密度100～200 尾/m3為宜。