超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同pH值溶液中三葉苷平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)*

張遠(yuǎn)冬，高健美，龔其海

(遵義醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院；2.基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563000)

三葉苷是從多穗柯中分離出的一種二氫查爾酮化合物，其結(jié)構(gòu)為根皮素-4’-β-D-葡萄糖苷。在甜茶嫩葉中，三葉苷含量為82.9 ～ 103.1 mg·g-1，是含量最高的活性成分[1]。藥理學(xué)研究表明，三葉苷能明顯抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性，進(jìn)而有效降低大鼠的血糖水平[2]；同時(shí)，三葉苷下調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6表達(dá)水平，并抑制其分泌，具有減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，三葉苷能夠清除細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)過多的氧自由基，提高抗氧化物酶活力，對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[4]；進(jìn)一步的體內(nèi)研究顯示，三葉苷灌胃給予局灶性腦缺血-再灌注損傷模型大鼠后，可顯著抑制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷，從而有效改善大鼠大腦急性缺血造成的神經(jīng)功能缺陷，并減小腦缺血梗死體積[5]。這些研究表明，三葉苷具有較好的潛力開發(fā)應(yīng)用于炎癥、缺血性腦卒中等疾病的治療。

然而，三葉苷水溶性極低，在實(shí)驗(yàn)中存在給藥困難以及給藥劑量不準(zhǔn)確的問題；在體內(nèi)研究中，常常需要口服給予大劑量的藥物才能發(fā)揮治療作用[5]。這些因素極大限制了三葉苷的研究及應(yīng)用。因此，探明三葉苷的基本理化性質(zhì)，并研發(fā)合適的藥物新制劑，提高三葉苷溶解度極為重要。目前，關(guān)于三葉苷的文獻(xiàn)報(bào)道多集中于提取工藝及藥理學(xué)研究，而對(duì)三葉苷理化性質(zhì)研究鮮有報(bào)道。筆者通過建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法準(zhǔn)確測(cè)定三葉苷的含量，并結(jié)合飽和溶液法和搖瓶法測(cè)定三葉苷在不同pH值溶液中的平衡溶解度及油水分配系數(shù)[6-7]，初步考察其溶解性和滲透性，為后續(xù)三葉苷體內(nèi)生物利用度、藥動(dòng)學(xué)研究以及藥物新制劑的設(shè)計(jì)和制備提供參考。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)ABSCIEX公司)；LC-30AD超高效液相系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Cary 300紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司)；Mettler Toledo pH值計(jì)(瑞士)；UPH-II-10T 優(yōu)普超純水儀 (西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司)；Allegra TM X-22R離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)；TCYQ水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；孔徑0.45 μm微孔濾膜(杭州馳騁醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 三葉苷對(duì)照品(南京澤郎生物科技有限公司，批號(hào)：161009，含量≥98%)；色譜級(jí)乙腈(美國(guó)Sigma公司)；甲醇、正辛醇、甲酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉等均為優(yōu)級(jí)純(阿拉丁、成都依云化工原料有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 超高效液相檢測(cè)條件為：系統(tǒng)選用Kinetex XB-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫程序：起始B為10%并持續(xù)1.00 min；1.00～8.00 min B變?yōu)?0%，并持續(xù)至12.00 min；12.01 min B變?yōu)?0%并持續(xù)至15.00 min。流速為300 μL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2質(zhì)譜條件 Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)采用電噴霧電離離子源，分別采用Positive離子化方式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1000；鞘氣為379 kPa，輔助氣為379 kPa；氣簾氣為172 kPa，霧化溫度600 ℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA掃描模式，TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描Product Ion-IDA離子累積時(shí)間分別為250，100 ms，解簇電壓80 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為(35±15) eV。

2.3溶液的制備

2.3.1三葉苷對(duì)照品溶液的配制 精密稱取三葉苷對(duì)照品10.30 mg于10 mL棕色量瓶，加甲醇完全溶解并定容，配制成濃度為1.03 mg · mL-1的儲(chǔ)備液。

2.3.2不同pH值緩沖液的配制 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版8004緩沖液配制方法，分別配制pH值為1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，8.0，9.0，10.5，11.0，12.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用精密pH計(jì)測(cè)定，并校正至所需pH值。

2.3.3正辛醇飽和溶液及水飽和正辛醇溶液的配制 精密量取等體積的不同pH值的PBS和正辛醇混合，置于恒溫振蕩器中，在37 ℃下，以100 r·min-1震蕩4 h，靜置分層后取上下層溶液，上層即為水飽和正辛醇溶液，下層為正辛醇飽和PBS溶液。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1專屬性驗(yàn)證 在上述“2.1”項(xiàng)色譜條件下，三葉苷對(duì)照品溶液及樣品溶液色譜峰均分離良好，根據(jù)三葉苷分子式C21H24O10，相對(duì)分子質(zhì)量436.14，得到離子峰M+H：437.14，提取的離子流圖譜中無雜質(zhì)干擾，保留時(shí)間5.17 min(圖1)。

A.空白溶劑色譜圖；B.三葉苷對(duì)照品提取的離子流色譜圖；C.三葉苷對(duì)照品質(zhì)譜圖。

2.4.2線性關(guān)系考察 精密吸取三葉苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，濃度分別為1030，686.7，515.0，257.5，128.8，64.4，32.2，16.1 ng·mL-1，在本研究檢測(cè)條件下測(cè)定三葉苷對(duì)照品的峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=40.26X+52.31。表明在本研究色譜條件下，三葉苷在16.1～1030 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積線性良好(R2=0.999 5)。

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取三葉苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋成高、中、低(686.7，128.8，42.9 ng·mL-1)濃度，分別日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次記錄峰面積，計(jì)算測(cè)定的濃度和RSD，考察日內(nèi)精密度；另將上述3個(gè)對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣3 d，計(jì)算測(cè)定濃度和RSD，考察日間精密度。結(jié)果如表1所示，其日內(nèi)、日間RSD均在3%以下，表明該方法精密度良好。

表1 三葉苷日內(nèi)、日間精密度結(jié)果

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取三葉苷儲(chǔ)備液，稀釋成高、中、低3個(gè)濃度，分成兩組，分別置于4 ℃和25 ℃條件下避光保存，放置7 d，在第1，3，5，7天取樣，按本研究色譜條件測(cè)定得峰面積，通過回歸方程計(jì)算其濃度，計(jì)算RSD%。

結(jié)果顯示(表2)，三葉苷在4 ℃放置1周，其濃度無顯著降低(RSD< 3%)，穩(wěn)定性好；而三葉苷在25 ℃放置1周后，濃度逐漸降低(RSD> 5%)，表明三葉苷在室溫條件下降解。因此，三葉苷配制成溶液后，應(yīng)放置于4 ℃環(huán)境并避光保存。

表2 三葉苷在4 ℃和25 ℃的穩(wěn)定性

2.4.5重復(fù)性及回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取三葉苷儲(chǔ)備液，稀釋成同一濃度的對(duì)照品溶液6份，在本研究色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算測(cè)定的濃度和RSD，結(jié)果測(cè)得對(duì)照品含量的RSD為0.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

取已知濃度的三葉苷儲(chǔ)備液3份，分別向其中加入高、中、低濃度的三葉苷對(duì)照品溶液，按本研究色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算高、中、低濃度的加樣回收率分別為(93.79±0.54)%，(90.62±0.38)%，(87.13±0.74)%，RSD均<5%，表明其回收率符合含量測(cè)定要求。

2.5三葉苷平衡溶解度的測(cè)定 稱取過量的三葉苷對(duì)照品，加入不同pH值的PBS中，制備三葉苷過飽和溶液，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，以100 r·min-1振蕩24 h后，將其轉(zhuǎn)移至離心管，12 000 r·min-1離心15 min(r=7 cm)，取上清液，用甲醇稀釋，經(jīng)微孔濾膜濾過后，取樣進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，結(jié)果pH值1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，9.0，10.5，12.0的PBS中三葉苷平衡溶解度分別為0.90，1.16，1.83，2.72，3.91，11.73，15.51，23.79 mg·mL-1。可見，三葉苷的溶解度具有pH值依賴性，隨著pH值的增加而顯著增大。按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，在pH值 1.2的緩沖液中，三葉苷極微溶解；在接近體內(nèi)腸液pH值的緩沖液(pH值 6.5)中顯示為微溶；當(dāng)pH值為堿性溶液(pH值 >9.0)時(shí)，三葉苷溶解度急劇增大，在pH值 12.0時(shí)，其最大溶解度為23.79 mg·mL-1，表明三葉苷為難溶性藥物，其在生理環(huán)境中溶解度較差。

另取上清液稀釋，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸收波長(zhǎng)掃描，考察不同pH值溶液中三葉苷紫外吸收波長(zhǎng)的變化(圖2)。

圖2 三葉苷在不同pH值溶液中的紫外吸收光譜

結(jié)果顯示，三葉苷的最大吸收波長(zhǎng)(220，284 nm)均隨pH值變化發(fā)生了偏移，尤其在284 nm處，隨著pH值增大，最大吸收峰波長(zhǎng)顯著向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，進(jìn)一步表明三葉苷的溶解度受溶液pH值的顯著影響。

2.6三葉苷表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定 稱取過量的三葉苷對(duì)照品加入正辛醇溶液中，飽和至溶液出現(xiàn)淺黃色沉淀，置于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩，靜置后3000 r·min-1離心5 min(r=7 cm)，取上清液經(jīng)孔徑0.45 μm濾膜濾過，濾液稀釋300倍后，取樣品溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，計(jì)算三葉苷在正辛醇相中的初始濃度。

精密量取三葉苷飽和的正辛醇溶液加入棕色量瓶中，再分別加入不同pH值的正辛醇飽和PBS溶液，定容。將量瓶置于37 ℃恒溫振蕩器中，振搖6 h后，3000 r·min-1條件下離心5 min(r=7 cm)分層，取下層水溶液，經(jīng)孔徑0.45 μm濾膜濾過，濾液稀釋100倍，取100 μL樣品溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，計(jì)算三葉苷濃度。根據(jù)以下公式計(jì)算表觀油水分配系數(shù)Papp，并求對(duì)數(shù)值lgP。

Papp為三葉苷的表觀油水分配系數(shù)；C0為正辛醇相中三葉苷的初始濃度；V0為水飽和的正辛醇體積；Cw為藥物分配平衡時(shí)測(cè)得水相中三葉苷的濃度；Vw為水相體積。

結(jié)果如圖3所示，三葉苷的表觀油水分配系數(shù)lgP值隨溶液pH值上升而減小，在酸性或偏酸性溶液中(pH值=1.2～5.5)，lgP在0.15～0.26之間；pH值=7.5時(shí)，其lgP為0.03；pH值>8.5時(shí)，lgP<0，表明三葉苷在堿性條件下親水性增加。

圖3 三葉苷的表觀油水分配系數(shù)

3 討論

平衡溶解度和油水分配系數(shù)是藥物的重要理化參數(shù)，二者會(huì)直接影響藥物在體內(nèi)的吸收程度及速度[7]。藥物溶解是其在生物體內(nèi)吸收的重要前提，溶解度小的藥物常常存在吸收困難的問題，本研究結(jié)果顯示，三葉苷在酸性及中性環(huán)境中溶解度均極低，在pH值 12.0時(shí)，最大溶解度為23.79 mg·mL-1，表明三葉苷為難溶性藥物，其在胃腸道生理環(huán)境下溶解性較差，推測(cè)其口服吸收效率低。

藥物的結(jié)構(gòu)會(huì)直接影響其在不同pH值溶液中的溶解程度，三葉苷含有酚羥基結(jié)構(gòu)，堿性溶液會(huì)促進(jìn)酚羥基解離而增加溶解度。本研究結(jié)果表明三葉苷的溶解度隨著pH值升高而顯著增大。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果進(jìn)一步顯示，三葉苷的最大吸收波長(zhǎng)(284 nm)隨著pH值增加而顯著向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，推測(cè)三葉苷在堿性溶液中解離程度高于酸性溶液，其溶液中以分子和離子狀態(tài)存在的含量不同而導(dǎo)致。

表觀油水分配系數(shù)是預(yù)測(cè)藥物膜滲透能力的重要理化參數(shù)，尤其在藥物的腸吸收過程中，要求藥物具有合適的脂溶性和水溶性[8]。lgP值對(duì)于胃腸道中藥物的吸收速率有顯著影響，當(dāng)lgP值>5，藥物脂溶性太強(qiáng)，水溶性低，腸道吸收后難以進(jìn)入血液或淋巴液中；而lgP值較低(1gP<-2)時(shí)，藥物水溶性強(qiáng)，脂溶性低，不能穿過細(xì)胞脂質(zhì)膜而難以吸收；理想的藥物lgP值為-1.0

藥物在有機(jī)相和水相中分配過程相當(dāng)復(fù)雜，其在水相中可發(fā)生酸式或堿式解離，了解不同pH值條件下的表觀油水分配系數(shù)具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，在pH值梯度變化的PBS溶液中，三葉苷的表觀油水分配系數(shù)隨著pH值上升而減小，在酸性或偏酸性條件下lgP>0；在堿性條件下，lgP<0。因此，三葉苷在pH值偏高的腸段可能發(fā)生解離，脂溶性減小，導(dǎo)致膜通過效率降低。

在口服吸收過程中，藥物在胃腸道的溶出及腸壁上的通透性至關(guān)重要，本研究根據(jù)胃腸道pH值的梯度變化，測(cè)定了三葉苷在不同 pH值緩沖液的平衡溶解度和油水分配系數(shù)，為后續(xù)藥物吸收代謝研究以及新制劑、新劑型的研發(fā)提供了重要依據(jù)。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，三葉苷體內(nèi)溶解性低，lgP推測(cè)其膜通過性較好，因此，需要采用適當(dāng)?shù)闹苿┦侄胃纳破潴w內(nèi)溶解性，有效提高其口服生物利用度，從而更好地進(jìn)行藥理、藥效學(xué)評(píng)價(jià)。