泰山磐石散對流產(chǎn)模型大鼠母胎界面NF-κB、IL-1β、TNF-α表達(dá)情況的影響*

鄒劍芬，冉添福，高愉婷，吳基緯，賈晶晶，鐘鴻鈺，江澍

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福建福州 350122

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福建福州 350122

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）被定義為妊娠20周前沒有外部干預(yù)就發(fā)生的妊娠丟失[1]。SA是妊娠最常見的并發(fā)癥之一，且病因復(fù)雜，盡管進(jìn)行了多年的研究，仍然對醫(yī)學(xué)構(gòu)成挑戰(zhàn)。SA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)炎性免疫反應(yīng)在SA中起關(guān)鍵作用[2]。而核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化及多種炎癥因子的釋放在其病理機(jī)制中具有重要作用[3]。又有研究[4]顯示，一些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor，TNF-α）、 白細(xì)胞介素1-β（interleukin-1β，IL-1β）等，能刺激NF-κB 信號通路激活，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和促進(jìn)局部免疫功能失衡。因此，本研究通過注射溴隱亭造大鼠流產(chǎn)模型，觀察泰山磐石散對流產(chǎn)模型大鼠母胎界面中NF-κB、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討泰山磐石散防治SA的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 采用SPF級SD大鼠，雄性15只，雌性30只，9周齡，體重200～250g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，合格證：18101000032，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。常規(guī)飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，自由飲水?dāng)z食，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，每日12h明暗環(huán)境。

1.2 藥品與試劑 泰山磐石散：人參3g，黃芪6g，白術(shù) 6g，當(dāng)歸 3g，川芎 2g，白芍藥 3g，熟地黃 3g，川續(xù)斷 3g，黃芩 3g，炙甘草 2g，砂仁 1.5g，糯米 6g。將所有藥物混合（除開砂仁），加入1000 mL自來水，浸泡30min，然后大火煮沸后文火再煮25min，加入研磨好的砂仁粉末繼續(xù)煎煮5min，以雙層紗布濾過，得藥液；在藥渣中再加入500 mL自來水，重復(fù)以上操作1次；2次藥液合并后，水浴蒸發(fā)藥液至41.5 mL，制成含生藥量 1 g/mL 的藥液，4℃保存。NF-κB p65、IL-1β、TNF-α抗體（美國Immunoway公司）；免疫組化試劑盒（中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；溴隱亭（2.5mg/片，瑞士諾華制藥有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 包埋機(jī)（德國MICROM公司）；半自動石蠟切片機(jī)（德國 MICROM公司）；生物組織烘片攤片機(jī)（中國孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司）；顯微鏡用數(shù)碼相機(jī)（日本Nikon公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，對雌性SD大鼠進(jìn)行稱重。將30只雌性SD大鼠按1﹕1比例和雄性SD大鼠合籠過夜配種，隨機(jī)平均分為正常組、模型組和治療組，于每日早晨觀察雌性大鼠有無陰道栓脫落。當(dāng)觀察到雌鼠有陰道栓脫落時(shí)作為妊娠第1天。正常組于孕1～11d灌服生理鹽水10 mL/kg/d，孕 6 ～ 8d 皮下注射 75% 乙醇 1 mL/kg/d（75%乙醇為溴隱亭的溶解劑）；模型組于孕1～11d灌服生理鹽水10 mL/kg/d，孕6～8d皮下注射溴隱亭溶液1 mL/kg/d；治療組于孕1～11d灌服中藥泰山磐石散湯劑10 mL/kg/d，孕6～8d皮下注射溴隱亭溶液1 mL/kg/d。

2.2 動物處置 于妊娠的第12天，腹腔注射20%烏拉坦溶液（注射量為5 mL/kg）麻醉孕鼠后，迅速剖開腹腔，觀察妊娠情況，剪取孕鼠的胚胎組織，將胚胎組織置于PBS緩沖液中洗滌，放入4%多聚甲醛固定保存。組織標(biāo)本固定12～24 h后進(jìn)行石蠟包埋。

2.3 方法 3組大鼠蛻膜組織母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織 NF-κB、IL-1β、TNF-α 表達(dá)分布情況 用免疫組織化學(xué)S-P法分析母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達(dá)分布情況，參照免疫組化試劑盒說明書操作。封片完成后將組織切片放到顯微鏡下觀察，母胎界面子宮側(cè)蛻膜細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為NF-κB、IL-1β、TNF-α表達(dá)。在母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織中隨機(jī)選取5個等大面積區(qū)域，用圖像分析軟件 Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行半定量分析，計(jì)算子宮側(cè)的平均光密度，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。平均光密度＝積分光密度／選擇區(qū)域面積。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 3組孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB的表達(dá)

在正常組中，NF-κB主要在母胎界面子宮側(cè)蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)且維持在較低的水平。與正常組相比，模型組中NF-κB在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)且表達(dá)明顯升高；經(jīng)泰山磐石散治療后NF-κB表達(dá)明顯下降，主要表達(dá)在胞質(zhì)中。其中正常組和模型組比較，治療組和模型組比較均具有顯著差異（P<0.01）。見表1，圖1。

圖1 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB表達(dá)情況（×200）

表1 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB平均光密度比較（±s）

表1 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB平均光密度比較（±s）

組別 只數(shù) 平均光密度正常組 10 0.0638±0.0055 模型組 10 0.1099±0.0038治療組 10 0.0674±0.0044

2 3組孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織IL-1β的表達(dá)

IL-1β主要在母胎界面子宮側(cè)蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。與正常組相比，模型組中IL-1β表達(dá)明顯升高，治療組較模型組明顯下降。其中正常組和模型組比較，治療組和模型組比較均具有顯著差異（P<0.01）。見表2，圖2。

圖2 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織IL-1β表達(dá)情況（×200）

表2 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織IL-1β平均光密度比較（±s）

表2 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織IL-1β平均光密度比較（±s）

組別 只數(shù) 平均光密度正常組 10 0.0180±0.0013模型組 10 0.0552±0.0016治療組 10 0.0201±0.0011

3 3組孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織TNF-α的表達(dá)

與正常組相比，模型組母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織TNF-α表達(dá)明顯升高，治療組較模型組明顯下降。其中正常組和模型組比較，治療組和模型組比較均具有顯著差異（P<0.01）。見表3，圖3。

圖3 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織TNF-α表達(dá)情況（×200）

表3 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織TNF-α平均光密度比較（±s）

表3 孕鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織TNF-α平均光密度比較（±s）

組別 只數(shù) 平均光密度正常組 10 0.0137±0.0010模型組 10 0.0508±0.0012治療組 10 0.0146±0.0011

討 論

目前，對于SA的西醫(yī)治療尚缺乏安全有效的治療方案。SA的發(fā)生發(fā)展與多種病理過程相關(guān)，其中NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是其發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，NF-κB在妊娠過程中發(fā)揮著重要作用，不僅被認(rèn)為是妊娠著床的重要調(diào)節(jié)因子，而且妊娠的成功維持依賴于對NF-κB的抑制[5]。一般情況下，NF-κB在胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞被刺激并經(jīng)過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，被激活的NF-κB從胞質(zhì)中遷移進(jìn)入胞核內(nèi)，調(diào)控炎癥相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。IL-1β和TNF-α是促炎性細(xì)胞因子，且二者均能激活NF-κB，活化的NF-κB能夠增加TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平[4]，而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又可以反過來繼續(xù)活化NF-κB，從而形成正反饋回路放大了炎癥信號。在妊娠過程中，適量的TNF-α有利于細(xì)胞代謝及胚胎發(fā)育，但多數(shù)研究認(rèn)為，它對妊娠是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子。過表達(dá)的TNF-α可導(dǎo)致免疫平衡失調(diào)，刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生，嚴(yán)重可造成流產(chǎn)[6]。IL-1β在生理濃度可促進(jìn)卵泡生長，排卵和黃體的形成以及植入和胚胎發(fā)育[7]。但I(xiàn)L-1β也是炎癥反應(yīng)過程中重要的炎癥介質(zhì)，過表達(dá)的IL-1β可與其他細(xì)胞因子協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞毒性和炎性反應(yīng)，影響胚胎發(fā)育[8]。因此，TNF-α和IL-1β兩者可能相互促進(jìn)，產(chǎn)生協(xié)同作用，引起母胎界面的過度免疫炎癥反應(yīng)。由此推測，抑制NF-κB的活化、降低促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)可能達(dá)到防治SA的目的。

本次免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組孕鼠相比，模型組流產(chǎn)大鼠母胎界面中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)均顯著升高（P<0.01），且NF-κB在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)，表明流產(chǎn)大鼠母胎界面發(fā)生了NF-κB的活化及多種炎癥因子的釋放。與相關(guān)研究結(jié)果相符[9，10]，提示了SA的發(fā)生與母胎界面過度炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)。與模型組相比，治療組母胎界面中NF-κB、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），且NF-κB核移位明顯減少，表明泰山磐石散可能通過有效抑制NF-κB的活化，降低IL-1β和TNF-α等炎癥因子的合成和釋放，以達(dá)安胎的療效。

中藥保胎名方泰山磐石散源自徐春甫的《古今醫(yī)統(tǒng)大全》，以八珍湯為基礎(chǔ)方，去八珍之茯苓，加黃芪、黃芩、川續(xù)斷、糯米、砂仁組成，具有益氣健脾、養(yǎng)血補(bǔ)腎安胎之功。因茯苓有淡滲利濕之效，恐傷胎氣，故棄之；黃芪、人參、白術(shù)、炙甘草同用共成益氣健脾之功，且黃芪有升提的作用，故能舉胎防墮以固胎元；配以四物湯（當(dāng)歸、熟地黃、川芎、白芍藥）養(yǎng)血和血以滋養(yǎng)胎元；黃芩、川續(xù)斷皆為安胎之要藥，且黃芩清熱之力較強(qiáng)，使諸藥補(bǔ)而不滯，而川續(xù)斷既善補(bǔ)肝腎、又能調(diào)血脈，與熟地黃合用，增強(qiáng)補(bǔ)益肝腎之功而保胎元；砂仁、糯米調(diào)氣和胃。諸藥合用使氣血調(diào)，沖任固，胎元安?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，上述中藥中人參、黃芪、白術(shù)等具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能[11]；黃芩[12]、白芍[13]、炙甘草[14]等具有良好的抗炎作用。本此實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一度證明，泰山磐石散具有一定的抗炎作用，可能通過調(diào)節(jié)母胎界面的過度炎癥免疫反應(yīng)，使胚胎能正常著床、發(fā)育。

綜上所述，3組大鼠母胎界面中NF-κB、IL-1β、TNF-α均有表達(dá)。與正常妊娠組相比，模型組流產(chǎn)大鼠的母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平均明顯增高（P<0.01），且NF-κB在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)；經(jīng)泰山磐石散治療后大鼠母胎界面子宮側(cè)蛻膜組織NF-κB、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），且NF-κB核移位明顯減少。因此，我們推測，泰山磐石散能夠有效防治SA，可能是通過抑制NF-κB的活化、減少促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的合成和釋放實(shí)現(xiàn)的。