海南西瓜蔓枯病病原菌的鑒定及8種殺菌劑對其室內(nèi)毒力測定

杜公福，李漢豐，詹園鳳，黃小龍，戚志強，黨選民

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?，571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院；3.海南大學(xué)）

西瓜是海南的特色產(chǎn)業(yè)，以反季節(jié)種植為主，種植面積約1.5 萬hm2[1]，以露地栽培和小拱棚栽培為主。海南地區(qū)可全年種植西瓜，但由于生產(chǎn)區(qū)連年種植，連作障礙日益加重，加上高溫高濕的環(huán)境，易引發(fā)土傳病害。近幾年西瓜蔓枯病頻發(fā)，已成為海南西瓜重要的土傳病害之一，顯著降低了西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。西瓜蔓枯病作為一種侵染西瓜的世界性病害，在西瓜整個生育期均可發(fā)生，該病害主要通過土壤和灌溉等途徑傳播，空氣濕度高更有利于病菌孢子的存活和傳播，對西瓜生產(chǎn)造成嚴重影響。研究顯示，西瓜蔓枯病病株率一般為15%～25%，嚴重時高達80%，能在短時間內(nèi)使藤蔓枯死，病蔓率10%，嚴重發(fā)生時可減產(chǎn)15%[2～4]。

儋州市是海南西部最大的城市，光村、王五鎮(zhèn)等沿海地區(qū)非常適合種植西瓜，常年種植的品種有84-24、友都等麒麟瓜和瓊麗等精品小西瓜，西瓜產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為儋州市的瓜菜新產(chǎn)業(yè)。課題組于2016-2017 年在儋州市寶島新村西瓜生產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)西瓜莖蔓開裂并密生小黑點，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)主要為害莖基部，病株率約30%。為明確該病的病原菌，本文對海南地區(qū)引起西瓜莖蔓開裂病害的病原菌進行了分離、鑒定，并開展藥劑篩選試驗。

國內(nèi)抗蔓枯病的西瓜品種較少，尤其是抗蔓枯病的中小型西瓜品種[5]。生產(chǎn)中，西瓜蔓枯病以化學(xué)防治為主。查詢中國農(nóng)藥信息網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)登記用于防治蔓枯病的藥劑較少，有效成分主要是雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、啶氧菌酯、嘧菌酯、代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑等，市場上單劑或復(fù)配農(nóng)藥產(chǎn)品約有30個產(chǎn)品，相關(guān)藥效的研究報道較少。為了提高西瓜蔓枯病的防效，避免盲目用藥，選擇其中具有代表性的8種藥劑，對西瓜蔓枯病菌進行室內(nèi)毒力測定，篩選防治西瓜蔓枯病的理想藥劑，以期為防治西瓜蔓枯病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣本來源于儋州市寶島新村露地西瓜病株，品種為友都（海南富友種苗有限公司）。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.3 供試殺菌劑

22.5%啶氧菌酯懸浮劑（SC）：上海杜邦農(nóng)化有限公司；46%氫氧化銅水分散粒劑（WDG）：上海杜邦農(nóng)化有限公司；10%苯醚甲環(huán)唑WDG：先正達（蘇州）作物保護有限公司；27%春雷·溴菌腈可濕性粉劑（WP）：陜西湯普森生物科技有限公司；24%雙胍·吡唑酯WP：陜西上格之路生物科學(xué)有限公司；50%多菌靈WP：江蘇龍燈化學(xué)有限公司；18.7%丙環(huán)·嘧菌酯SC：瑞士先正達作物保護有限公司；11%精甲·咯·嘧菌懸浮種衣劑（FSC）：先正達（南通）作物保護有限公司。

1.4 病原菌分離純化及致病性測定

2017 年3 月將發(fā)病西瓜植株帶回實驗室，對發(fā)病部分進行病原菌分離，切取發(fā)病組織，用75%乙醇消毒，然后用無菌水清洗，將清洗過的組織晾干后移到PDA 平板中，置于生化培養(yǎng)箱于25℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長出菌落后，用接種針挑取菌絲體進行純化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；將純化的菌種（編號為MK06）接種到黃瓜果實上[6]，放入接種盒中保濕[7]，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（每天光照12 h）7 d左右，當(dāng)產(chǎn)生大量孢子時，用毛刷或刀片將孢子刮到無菌水中，用2 層紗布過濾菌液，采用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計算菌液濃度，使用無菌水將菌液配制成孢子含量為1×106個/mL 的菌懸液。

采取柯赫氏法則進行致病性測定。將上述配好的菌懸液用噴霧法接種到具3～4 片真葉的健壯西瓜幼苗上，對照采用無菌水噴霧，設(shè)置3 次重復(fù)，每重復(fù)10 株，將接種后的植株放于26～28℃玻璃柜中，保濕。待接種植株發(fā)病后進行調(diào)查，并對發(fā)病株進行病原菌的再次分離和鑒定。

1.5 病原菌鑒定

挑取純化好的菌絲在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用CTAB 法進行病原菌DNA 的提取和純化，送PCR 產(chǎn)物至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對測序結(jié)果進行同源性比對分析，并用Mega 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 毒力測定

根據(jù)菌絲生長抑制預(yù)試驗結(jié)果，各藥劑設(shè)置5個濃度（表1），配制成供試藥劑母液，進行毒力測定，每個濃度3 次重復(fù)（平板），每重復(fù)3 個平板，以不加藥劑但含等量無菌水的PDA 平板為對照。采用十字交叉法測量菌落直徑，以平均值代表菌落大小。

表1 8種藥劑及其濃度梯度

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用第7 天的平均菌落直徑凈增長值，分別計算每種藥劑各個濃度的實際抑制率，然后建立回歸方程，參考慕立義[8]的算法，根據(jù)最小二乘法求出EC50值。

抑制率（%）=（對照菌落直徑平均數(shù)-處理菌落直徑平均數(shù)）/對照菌落直徑平均數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

葉片剛?cè)静r，出現(xiàn)水漬狀小斑點，然后慢慢形成灰褐至黃褐色小圓斑，病斑邊緣顯現(xiàn)黃色暈圈；隨著病情發(fā)展，病斑中間變成灰白色，濕度大時會有小黑點著生，病斑中心容易干裂。莖蔓染病時，病斑多呈不規(guī)則長條形，病健交界處稍凹陷，淺灰褐色至深褐色，濕度大時有小黑點（圖1），后引起莖蔓縱裂，嚴重時導(dǎo)致植株凋萎。

圖1 田間發(fā)病癥狀

2.2 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則進行致病性測定，在西瓜上接種病菌后第7 天，西瓜葉片開始表現(xiàn)出病狀，其莖基部變?yōu)辄S褐色，向內(nèi)縊縮，并有開裂癥狀，一段時間后葉片萎蔫枯死（圖2）。接種發(fā)病癥狀與田間觀察相同，對照西瓜植株沒有出現(xiàn)病癥。將發(fā)病西瓜葉片上的病斑進行組織分離，獲得的病原菌與原接種菌MK06 一致。

圖2 致病性測定

2.3 病原菌鑒定

菌株MK06 在PDA 培養(yǎng)基上菌落正面近圓形，菌絲灰白色，似輪紋狀擴展（圖3），菌落背面可見輻射狀墨綠色菌絲（圖4）。分生孢子器近球形，直徑65.0～150.0 μm，成熟遇水時釋放出大量分生孢子（圖5），并可形成孢子鏈。分生孢子有單孢形和雙孢形2種形態(tài)，孢子兩端鈍圓，無色，卵圓形或圓柱形，平均大小為5.2 μm×2.1 μm（圖6）。該病菌的形態(tài)特征與陸家云[9]描述的Phoma cucurbitacearum（與Stagonosporopsis cucurbitacearum同物異名）的形態(tài)特征相似。

圖3 菌落正面

圖4 菌落背面

圖5 分生孢子器（200 倍顯微）

圖6 分生孢子（400 倍顯微）

2.4 病原菌的rDNA-ITS 序列分析

利用測序出的病原菌MK06 的ITS 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，顯示菌株MK06 與Stagonosporopsis cucurbitacearum（MF401571.1、HQ914649.1、EU167573.1）聚在同一個分支上（圖7），與已報道的Stagonosporopsis cucurbitacearum同源性達100%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及分子測序比對，鑒定西瓜蔓枯病菌為Stagonosporopsis cucurbitacearum。

圖7 病原菌ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.5 藥劑毒力測定結(jié)果

由表2 可知，24%雙胍·吡唑酯WP 和11%精甲·咯·嘧菌FSC 的毒力較強，EC50值分別為0.101 7、0.391 1 mg/L，均小于1 mg/L；其次是10%苯醚甲環(huán)唑WDG 和18.7%丙環(huán)·嘧菌酯SC，EC50值分別為1.393 3、3.037 6 mg/L；27%春雷·溴菌腈WP 和22.5%啶氧菌酯SC 毒力效果一般，EC50值分別為10.753 0、20.982 6 mg/L；毒力效果較差的為46%氫氧化銅WDG 和50%多菌靈WP，EC50值分別為60.703 9、151.477 0 mg/L。

表2 8種藥劑對西瓜蔓枯病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

西瓜蔓枯病是毀滅性病害，世界各地均有相關(guān)報道，但其病原菌的命名比較混亂，頗具爭議。1885年Giovanni Passerini 首次在甜瓜上分離到蔓枯病菌，并將病原菌命名為Didymella melonisPass.[10]。1891 年，William Dudley、Casimir Roumeguere 和Frederick Chester 3 位真菌學(xué)者分別在美國黃瓜、法國黃瓜、美國西瓜植株上發(fā)現(xiàn)該菌，并根據(jù)其寄主植物及分生孢子形態(tài)分別命名為：Phyllosticta cucurbitacearumSacc.，Ascochyta cucumisFautr.&Roum.以及Phyllosticta citrullinaChester[11，12]。

早期國內(nèi)學(xué)者裘維番等根據(jù)病菌的形態(tài)學(xué)特征，將甜瓜等葫蘆科植物蔓枯病菌鑒定為瓜類球腔菌Mycosphaerella melonis，其無性型為殼二孢屬（Ascochyta）[13～16]。國際上多使用有性態(tài)為亞隔孢殼屬的瓜類黑腐球殼菌Didymella bryoniae（Auersw.）Rehm.，無性態(tài)為莖點霉菌Phoma cucurbitacearum（Fr）Sacc.[17]。到2010 年，Aveskamp 等[18]利用形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記方法，把Phoma細分出眾多分支，認為蔓枯病菌無性態(tài)應(yīng)命名為Stagonosporopsiscucurbitacearum（Fr.）Aveskamp Gruyter &Verkley。然而，另有一些學(xué)者認為在大多蔓枯病菌寄主植物上既可以發(fā)現(xiàn)其無性孢子也能發(fā)現(xiàn)其有性子實體，所以劃分有性型和無性型意義不大。2015 年，Stewart 等[19，20]在Aveskamp和Garampalli 的研 究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)蔓枯病菌Satgonosporopsis由3 個親緣關(guān)系相近且形態(tài)學(xué)難以區(qū)分的種組成，分別是Satgonosporopsis cucurbitacearum、Satgonosporopsis citrulli和Satgonosporopsis caricae。根 據(jù)Stewart等[19，20]對蔓枯病菌最新的分類方法，譚蕊[21]對西南地區(qū)274株西瓜進行蔓枯病病原菌鑒定，其中234株病原菌為Satgonosporopsis citrulli，40 株 為Satgonosporopsis caricae，未見Satgonosporopsis cucurbitacearum，Satgonosporopsis citrulli為優(yōu)勢種，且不同菌種間致病力、產(chǎn)孢能力具有一定差異。本研究收集鑒定的西瓜蔓枯病菌為Satgonosporopsis cucurbitacearum，結(jié)合譚蕊[21]研究認為，我國西瓜蔓枯病病原確實存在3 個致病種，且不同地理區(qū)域優(yōu)勢種群可能不同。目前正在收集海南地區(qū)西瓜蔓枯病菌株，以期明確優(yōu)勢種群，為西瓜抗病育種及防治提供理論基礎(chǔ)。

當(dāng)前生產(chǎn)上，用于防治西瓜蔓枯病的藥劑比較單一，很容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。尤其是作用位點單一的內(nèi)吸性藥劑，如長期大量防效下降或失效[22]。國外已報道西瓜蔓枯病菌對嘧菌酯[23]、甲基硫菌靈和苯菌靈[24]產(chǎn)生了抗藥性，國內(nèi)已報道西瓜蔓枯病菌對多菌靈產(chǎn)生抗藥性[25]。在室內(nèi)毒力測定試驗中，本研究結(jié)果與李雨等[2]的測定結(jié)果基本一致，苯醚甲環(huán)唑和含吡唑醚菌酯的藥劑抑菌活性較好。而其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（啶氧菌酯）及多菌靈抑菌活性較差，這與Liu 等[25]的結(jié)果相似。因此，建議在西瓜生產(chǎn)中選擇24%雙胍·吡唑酯WP 和11%精甲·咯·嘧菌FSC 防治蔓枯病，盡量避免長期使用作用位點單一的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑單劑（嘧菌酯、肟菌酯、醚菌酯等），或選擇其復(fù)配藥劑，延長藥劑使用壽命，保證殺菌效果[26，27]。