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    磁固相萃取聯(lián)合熒光法測(cè)定生物樣品中的卡維地洛

    2021-08-24 13:31:40秦艷芳趙冰欣李曉姣徐風(fēng)云
    分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:尿樣吸附劑乙醇

    秦艷芳,趙冰欣,李曉姣,徐風(fēng)云,吳 昊*

    (1.長(zhǎng)治幼兒師范高等專科學(xué)校,山西 長(zhǎng)治046000;2.山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,山西 臨汾041004)

    卡維地洛(Carvedilol,CAR,圖1)屬于α和β受體阻斷劑,可擴(kuò)張血管,保護(hù)心肌和神經(jīng)元,在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛和心力衰竭等疾病的治療,能顯著降低心血管患者的發(fā)病率和死亡率[1-2]。

    圖1 卡維地洛的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of carvedilol

    磁固相萃?。∕SPE)是21世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型固相萃取技術(shù),與傳統(tǒng)的固相萃取相比,具有操作簡(jiǎn)便快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。共價(jià)有機(jī)骨架材料(COFs)是一類由輕質(zhì)元素通過(guò)共價(jià)鍵連接的新型多孔有機(jī)材料,具有化學(xué)和熱穩(wěn)定性良好、比表面積大和孔徑可控等優(yōu)點(diǎn)[5],在樣品預(yù)處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。

    本研究采用Fe3O4納米材料、1,3,5-三甲基間苯三酚(Tp)和聯(lián)苯胺(BD),通過(guò)溶劑熱法合成了Fe3O4@COF(TpBD)復(fù)合材料。相比已有文獻(xiàn)[7],其合成方法所用試劑少,過(guò)程簡(jiǎn)單易操作,實(shí)驗(yàn)成本低。以Fe3O4@COF(TpBD)為MSPE吸附劑聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測(cè)血漿和尿液中的CAR含量的新方法,通過(guò)優(yōu)化相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù),在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)該分析方法進(jìn)行了評(píng)估。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    FeCl3·6H2O、乙二醇、無(wú)水乙酸鈉、1,2-乙二胺、1,3,5-三甲基間苯三酚(Tp)、聯(lián)苯胺(BD)(上海阿拉丁生化科技有限公司);無(wú)水乙醇、冰醋酸、高效液相色譜級(jí)甲醇、乙醇、乙腈(北京百靈威科技有限公司);CAR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國(guó)藥品生物制品檢定所);尿液及血漿取自長(zhǎng)治幼兒師范高等??茖W(xué)校校醫(yī)院。

    Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(Agilent Technologies,美國(guó));pHS-3C pH計(jì)(上海強(qiáng)生科技有限公司);KQ-500DV超聲波洗滌器(江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(JEOL,日本);D8 Advance X射線衍射儀(XRD)(Bruker,德國(guó));7407振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(Lake Shore,美國(guó));FT-IR360傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)(Nicolet,美國(guó));ASAP 2020比表面和孔隙度分析儀(Micromeritics,美國(guó))。

    熒光測(cè)量條件:(25±0.5)℃;λex=240 nm,λem=356 nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm;掃描速度為1 000 nm·min-1。

    1.2 磁性材料Fe3O4@COF(TpBD)的制備

    Fe3O4納米材料參照文獻(xiàn)[4]制備:將1.0 g FeCl3·6H2O分散于20 mL乙二醇中超聲處理,隨后緩慢加入3.0 g無(wú)水乙酸鈉,磁力攪拌30 min;加入10 mL 1,2-乙二胺攪拌30 min后,將混合溶液移至高壓反應(yīng)釜中加熱至200℃并保持8 h,自然冷卻至室溫。最后將黑色產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次,并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

    Fe3O4@COF(TpBD)復(fù)合材料通過(guò)溶劑熱法制備:取60 mg Fe3O4加至30 mL無(wú)水乙醇中超聲分散,然后依次加入63 mg(0.3 mmol)Tp和55.2 mg(0.3 mmol)BD,混合物超聲35 min后,移至高壓反應(yīng)釜中加熱至180℃,保持48 h。最后將產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次,并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

    1.3 樣品處理

    CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL):精確稱取10 mg CAR,加1 mL的冰醋酸溶解,再加適量超純水定容至100 mL。

    血樣處理:在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.0 mL血漿和8 mL乙腈脫蛋白,以4 000×g離心15 min。收集透明的上清液,待測(cè)。

    尿樣處理:在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 mL新鮮人尿,4 000×g離心10 min。收集透明的上清液,待測(cè)。

    1.4 磁固相萃取過(guò)程

    準(zhǔn)確稱取5 mg吸附劑Fe3O4@COF(TpBD)置于50 mL含CAR樣品溶液的比色管中,超聲4 min,將釹鐵硼磁鐵置于比色管底部對(duì)吸附劑進(jìn)行分離,棄去上清液后,將吸附劑在40℃氮?dú)庵写蹈伞H缓鬁?zhǔn)確量取0.5 mL乙醇置于比色管底部進(jìn)行解吸,超聲5 min后使用釹鐵硼磁鐵分離解吸劑和吸附劑,重復(fù)解吸步驟2次,合并兩次解吸劑。最后將解吸劑用0.22 μm的針式過(guò)濾器過(guò)濾,濾液用于熒光分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Fe3O4@COF(TpBD)表征

    利用TEM分別對(duì)Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的形貌進(jìn)行了表征。如圖2A與圖2B所示,F(xiàn)e3O4呈球形,且大小均勻,表面被COF(TpBD)均勻包裹。元素分布圖像(圖2C)也表明Fe3O4@COF(TpBD)中Fe3O4(元素Fe、O)和COF(TpBD)(元素C、N、O)均勻緊密地結(jié)合。

    由Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的N2吸附-解吸等溫線(圖2D)可知,F(xiàn)e3O4的BET比表面積和孔體積分別為11.00 cm2/g和0.14 cm2/g,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的分別為32.26 cm2/g和0.18 cm3/g,相比Fe3O4均明顯增加。

    Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的磁化曲線(圖2E)表明,兩者均具有良好的磁性能,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的飽和磁化強(qiáng)度為27.7 emu/g,在外磁場(chǎng)作用下容易分離。

    從Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的XRD譜圖(圖2F)可以看到,F(xiàn)e3O4有6個(gè)特征峰(2θ=30.1、35.3、43.1、53.2、57.0、62.4)分別對(duì)應(yīng)于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面,COF(TpBD)在2θ=25.5處的特征峰對(duì)應(yīng)其(001)晶面。Fe3O4@COF(TpBD)圖譜中這兩種材料的峰都有體現(xiàn),說(shuō)明二者形成了復(fù)合材料,同時(shí)結(jié)晶度未發(fā)生變化。

    如Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的FT-IR譜圖(圖2G)所示,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)在584 cm-1處的吸收帶為Fe—O振動(dòng),3 432 cm-1和1 442 cm-1處的吸收帶分別是O—H基團(tuán)和芳香C====C單元的特征拉伸帶,1 292 cm-1和1 605 cm-1處吸收帶分別與C—N拉伸和C====N鍵有關(guān)。表明Fe3O4已成功被COF(TpBD)包裹。

    圖2 Fe3O4(A)和Fe3O4@COF(TpBD)(B)的TEM圖,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的元素分布圖(C),F(xiàn)e3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的N2吸附-解吸等溫線(D),F(xiàn)e3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的磁化曲線(E),F(xiàn)e3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的XRD圖譜(F)以及Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的FT-IR圖譜(G)Fig.2 TEM images of Fe3O4 nanocrystal clusters(A)and Fe3O4@COF(TpBD)(B),element mapping images of Fe3O4@COF(TpBD)(C),N2 adsorption-desorption isotherms of Fe3O4 and Fe3O4@COF(TpBD)(D),magnetic curves of Fe3O4 and Fe3O4@COF(TpBD)(E),XRD spectra of Fe3O4,COF(TpBD)and Fe3O4@COF(TpBD)(F),and FT-IR spectra of Fe3O4,COF(TpBD)and Fe3O4@COF(TpBD)(G)

    2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

    2.2.1 pH值溶液的pH值會(huì)對(duì)藥物與吸附劑間的吸附平衡產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)中溶液的pH值用B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)。在溶液pH 2.0~12.0范圍內(nèi)進(jìn)行MSPE和熒光檢測(cè)。結(jié)果如圖3A所示,隨pH值的升高,CAR的熒光強(qiáng)度變化不大。為了方便操作,實(shí)驗(yàn)選擇萃取溶液的pH值為6.0。

    2.2.2 吸附劑用量考察了吸附劑用量在1~8 mg范圍內(nèi)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響(圖3B)。結(jié)果表明,當(dāng)吸附劑用量為5 mg時(shí),CAR的熒光強(qiáng)度最大。因此,實(shí)驗(yàn)選用5 mg吸附劑。

    2.2.3 萃取時(shí)間考察了萃取時(shí)間為1~10 min時(shí)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響(圖3C)。結(jié)果顯示,熒光強(qiáng)度隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,當(dāng)萃取時(shí)間為4 min時(shí),CAR的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值,吸附過(guò)程達(dá)到平衡。因此,萃取時(shí)間確定為4 min。

    2.2.4 解吸條件分別考察了乙酸、甲醇、乙醇和乙腈4種有機(jī)溶劑對(duì)CAR的解吸效果(圖3D)。當(dāng)選用乙醇為解吸劑時(shí)CAR的熒光強(qiáng)度最大。并考察了乙醇用量(0.2~0.8 mL)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響(圖3E)。結(jié)果表明,改變乙醇用量,CAR的熒光強(qiáng)度變化不明顯,為了方便操作,選用乙醇的體積為0.5 mL。另外,采用0.5 mL乙醇為解吸劑,考察了解吸時(shí)間在1~10 min范圍內(nèi)時(shí)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響(圖3F)。結(jié)果表明,解吸時(shí)間為5 min時(shí),CAR熒光強(qiáng)度最大。故選擇最佳解吸時(shí)間為5 min。

    圖3 溶液pH值(A)、吸附劑的用量(B)、萃取時(shí)間(C)、解吸劑(D)、解吸劑的體積(E)和解吸時(shí)間(F)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of sample solution pH value(A),adsorbent amoun(tB),adsorption time(C),desorption solvent types(D),desorption solution volume(E)and desorption time(F)

    2.3 方法選擇性

    在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,考察了某些共存物質(zhì)以及常見離子對(duì)CAR(10 ng/mL)測(cè)定的影響??刂茰y(cè)量誤差在±5%以內(nèi),1 000倍的尿素,800倍的Mg2+,700倍的K+、HPO42-,600倍的Na+、SO42-,400倍的Cl-,160倍的Ac-,120倍的Ca2+,56倍的Al3+,8倍的Cu2+等不會(huì)對(duì)測(cè)定造成干擾??梢娫摲椒ň哂泻芎玫倪x擇性。

    2.4 方法分析

    在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,制備了一系列CAR溶液,以熒光強(qiáng)度(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x,ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性回歸方程為y=8.138x+4.555,R=0.999 2。結(jié)果表明方法在1~100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性。CAR的檢出限(S/N=3)為0.19 ng/mL,定量下限(S/N=10)為0.63 ng/mL,對(duì)溶液中CAR的富集倍數(shù)為113倍。可見該方法的靈敏度高,線性范圍寬。

    為考察方法的重現(xiàn)性,按照磁固相萃取步驟對(duì)1 ng/mL CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液于日內(nèi)和日間進(jìn)行6次平行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果表明,其日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%,日間RSD為3.6%。

    2.5 樣品分析

    為了驗(yàn)證本方法的可行性及有效性,在尿樣和血樣中分別加入高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)“1.3”方法處理后,按照磁固相萃取過(guò)程進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)?;厥章蕼y(cè)定結(jié)果如表1 所示,其范圍為95.9%~98.7%。說(shuō)明方法的準(zhǔn)確性較好,可有效測(cè)定尿樣和血樣中CAR的含量。

    表1 加標(biāo)尿樣和加標(biāo)血樣中CAR的熒光測(cè)定(n=3)Table 1 Fluorimetric determination of CAR in spiked urine and spiked plasma(n=3)

    2.6 方法比較

    相比其他文獻(xiàn)方法(表2),本文所建立的方法線性范圍寬,在加標(biāo)樣品中回收率高。

    表2 生物樣品中CAR檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of determination for CAR in biological samples

    3 結(jié)論

    本研究合成了Fe3O4@COF(TpBD)復(fù)合材料,并以Fe3O4@COF(TpBD)作為MSPE吸附劑,聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測(cè)CAR含量的新方法。結(jié)果表明,該方法檢測(cè)范圍寬、靈敏度高且回收率好,適用于尿樣和血樣中CAR含量的測(cè)定。

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