吸附伏安法對(duì)輔酶Q10的測(cè)定研究

劉昱宏，郭 斌，屠一鋒

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 錦州121000；2.蘇州大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇 蘇州215123）

輔酶Q10（CoQ10），又名癸烯醌、泛醌，分子量863.36，是輔酶Q的一種。輔酶Q擁有一條由6～10個(gè)異戊二烯所構(gòu)成的側(cè)鏈，而輔酶Q10的此側(cè)鏈的聚合度為10［1］。輔酶Q10分別以泛醌（氧化形態(tài)）和泛醇（還原形態(tài)）分布在細(xì)胞膜上，主要負(fù)責(zé)電子、質(zhì)子運(yùn)輸，在三磷酸腺苷的合成上起著至關(guān)重要的作用［2］，也是為心肌細(xì)胞提供能量的主要成分。大量醫(yī)學(xué)研究證明心臟疾病與輔酶Q10的缺乏有關(guān)［3－5］，其在醫(yī)學(xué)和保健品領(lǐng)域主要用于強(qiáng)化心肌功能，是預(yù)防動(dòng)脈硬化形成的最有效的抗氧化成分，也是各類心血管疾病的主要協(xié)同用藥。因此，體內(nèi)輔酶Q10的定量分析對(duì)上述疾病的防治具有重要作用。

目前，常用的輔酶Q10檢測(cè)方法有高效液相色譜（HPLC）、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）、紫外－可見(jiàn)分光光度（UV－Vis）等方法，現(xiàn)行的《中華人民共和國(guó)藥典》2015版采用色譜法［6－11］，近年來(lái)也報(bào)道了一些新的、高效的檢測(cè)方法。Temova等［12］使用HPLC－UV方法測(cè)定藥物和補(bǔ)劑中的輔酶Q10含量，首次實(shí)現(xiàn)同步測(cè)定輔酶Q10和其他5種脂溶性維生素。Schou－Pedersen等［13］研究了相同條件下HPLC－ECD和LC－MS/MS兩種方法對(duì)輔酶Q10的測(cè)定靈敏度，HPLC－ECD表現(xiàn)出色，定量檢出限（LLOQ）低至10 nmol/L。但所有聯(lián)用HPLC分離的檢測(cè)方法所需時(shí)間普遍較長(zhǎng)，儀器成本和使用成本均較高，不利于普及應(yīng)用。

本文使用吸附伏安法對(duì)輔酶Q10進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)利用輔酶Q10在玻碳電極上的吸附作用，可有效提高其測(cè)定靈敏度。在單因素分析基礎(chǔ)上使用Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得檢出限為19.0 nmol/L，接近HPLC法水平。在達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)，吸附伏安電流和輔酶Q10濃度的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，可用于輔酶Q10的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ALS/DY2325 Bi－potentiostat電化學(xué)工作站（日本比·艾斯公司），三電極體系：工作電極為玻碳電極（φ=3 mm），對(duì)電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極。

輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品（USP，＞98.5%，上海麥克林生化科技有限公司），使用乙醇溶解，并根據(jù)需要稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；甲醇、乙醇、硫酸（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；甲醇、乙醇按一定比例混合并加入0.12 mol/L硫酸作為支持電解質(zhì)；用于溶解輔酶Q10的乙醇和電解質(zhì)溶液使用前均通氮?dú)獬? min，以防止還原態(tài)輔酶Q10被氧化；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 吸附伏安測(cè)試條件在－0.2～0.6 V范圍內(nèi)，以不同掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描，以所得峰電流和掃速之間關(guān)系判斷輔酶Q10電化學(xué)反應(yīng)的控制步驟，依據(jù)研究結(jié)果優(yōu)化相關(guān)測(cè)試參數(shù)（如預(yù)富集時(shí)間、溫度、支持電解質(zhì)溶液組成以及樣品制備條件等）。

1.2.2 實(shí)際樣品的處理測(cè)試樣品為輔酶Q10膠囊和軟膠囊，由藥店隨機(jī)購(gòu)得。輔酶Q10膠囊顆粒狀內(nèi)容物用乙醇超聲溶解并定容，輔酶Q10軟膠囊內(nèi)油狀內(nèi)容物使用乙醇超聲提取，8 000 r/min離心15 min后吸取黃色上清液，反復(fù)數(shù)次直至殘?jiān)耆拾咨?，合并提取液并定容?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 輔酶Q10電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理及主要影響因素

以玻碳電極為工作電極，在－0.2～0.6 V范圍內(nèi)，考察不同掃描速率（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 V/s）時(shí)0.5 μmol/L輔酶Q10的循環(huán)伏安曲線，以探討輔酶Q10的電化學(xué)行為。結(jié)果顯示，峰電流（I）隨掃描速率的增大而增大，且與掃描速率（v）呈線性相關(guān)，其線性方程為：I=0.216+13.1 v，r2=0.997，符合Laviron理論：Ip=nFQν/4RT，可判斷輔酶Q10在玻碳電極上的電化學(xué)反應(yīng)受吸附控制［14－18］，因此可通過(guò)預(yù)富集提高測(cè)定靈敏度。進(jìn)一步考察不同預(yù)富集時(shí)間（0～45 min，間隔時(shí)間5 min）對(duì)輔酶Q10循環(huán)伏安電流的影響，顯示輔酶Q10在玻碳電極上的循環(huán)伏安峰電流值隨富集時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，且在富集25 min時(shí)獲得最大電流，該結(jié)果支持吸附控制電化學(xué)過(guò)程的觀點(diǎn)。但預(yù)富集時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則電流逐步下降，其原因可能是還原態(tài)的輔酶Q10被溶解氧部分氧化。

對(duì)多項(xiàng)測(cè)定條件進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)在制備輔酶Q10樣品溶液時(shí)宜采用超聲振蕩以加快其溶解速度并提高溶解效率，在測(cè)定時(shí)，溫度、支持電解質(zhì)溶液溶劑組成有顯著的影響，采用單因素分析法可分別對(duì)上述因素進(jìn)行優(yōu)化。樣品制備時(shí)進(jìn)行超聲振蕩可快速溶解輔酶Q10，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致其形態(tài)變化，由圖1A可知，超聲溶解時(shí)間以不超過(guò)2 min為宜。由圖1B可知，測(cè)定電流值隨溫度升高呈先增加后降低的趨勢(shì)，溫度為25℃左右時(shí)，輔酶Q10的循環(huán)伏安電流響應(yīng)值最高。其原因可能是，隨著溫度升高，輔酶Q10的傳質(zhì)速度加快，有利于其在電極表面的吸附富集，而溫度過(guò)高則可能加快輔酶Q10在電極表面的脫附，從而導(dǎo)致電流值下降［19］。已有研究多使用乙醇作為溶劑對(duì)輔酶Q10進(jìn)行測(cè)定［6－13］，由圖2C可知，支持電解質(zhì)溶液中溶劑構(gòu)成對(duì)輔酶Q10的電化學(xué)響應(yīng)有較為顯著的影響，本實(shí)驗(yàn)以甲醇∶乙醇配比為1∶1時(shí)，獲得的電流響應(yīng)值較高。

圖1 樣品超聲時(shí)間（A）、測(cè)定溫度（B）、溶劑比例（C）對(duì)循環(huán)伏安電流的影響；樣品超聲時(shí)間不同時(shí)所得溶液的紫外吸收光譜（D）Fig.1 Effects of ultrasonic time（A），detection temperature（B）and solvent composition（C）on CV current；UV spectra of CoQ10 solution under different ultrasonic time（D）CCoQ10=0.5 μmol/L

2.2 測(cè)定條件優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果

以上單因素試驗(yàn)初步揭示了相關(guān)因素的影響規(guī)律，使用Box－Behnken響應(yīng)面分析法［20－22］以考察各因素的影響及交互作用，可進(jìn)一步優(yōu)化上述測(cè)定條件，因此進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。設(shè)置樣品超聲時(shí)間、測(cè)定溫度、溶劑配比分別為因素A、B、C，以3次平行測(cè)定平均值計(jì)數(shù)，得出回歸方程為：y=2.10－0.210A－0.232B+0.206C+0.239AB+0.256AC－0.170BC－0.295A2－0.795B2－0.441C2。

方程預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（Predicted R2=0.753）與修正相關(guān)系數(shù)（Adjusted R2=0.948）差值小于0.2，說(shuō)明該模型的擬合程度良好，方程相關(guān)系數(shù)R2=0.977，說(shuō)明模型成立。方差分析結(jié)果見(jiàn)表1，表明A、B、C均為顯著影響因素，且顯著性A＞B＞C。

表1 回歸模型及方差分析Table 1 The variance analysis of regression equation

對(duì)方差分析結(jié)果進(jìn)行分析，可見(jiàn)A因素對(duì)結(jié)果有更大的顯著性影響，而A因素參與的交互作用的顯著性較小，說(shuō)明A因素是一個(gè)較為獨(dú)立的因素，但與其它因素間并非完全無(wú)交互作用。參考圖1A所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超過(guò)2 min的超聲時(shí)間將導(dǎo)致輔酶Q10的檢測(cè)電流顯著降低，原因應(yīng)與其形態(tài)變化有關(guān)，如圖1D所示，過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致其UV吸收降低，這可理解為超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)促使更多氧氣溶解進(jìn)入樣品溶液中而使部分樣品逐步被氧化，這一過(guò)程會(huì)持續(xù)到檢測(cè)過(guò)程，從而與因素B、C發(fā)生交互作用。另一方面，超聲振蕩引起聲空化過(guò)程導(dǎo)致的局部溫度升高使樣品以蒸發(fā)方式損失一部分也可能是原因之一［23］。

在此基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析（圖2）可以獲得更為精確的優(yōu)化結(jié)果。

圖2 超聲時(shí)間與溫度（A）、超聲時(shí)間與溶劑比例（B）、溫度與溶劑比例（C）對(duì)輔酶Q10電流值影響的響應(yīng)面分析Fig.2 RSM analysis of the current response toward ultrasonic time and temperature（A），ultrasonic time and solvent ratio（B）and temperature and solvent ratio（C）

以上優(yōu)化得到的最佳條件為：超聲時(shí)間1.88 min，溫度23.3℃，甲醇∶乙醇溶劑配比為1.1∶1，電流值的預(yù)測(cè)值為2.176 μA。結(jié)合實(shí)際情況，調(diào)整超聲時(shí)間為1 min 50 s，溫度為25℃，溶劑配比為1.1∶1，重復(fù)4次平行測(cè)定的平均值為2.054 μA，與由回歸方程給出的理論值相吻合。證實(shí)該模型能精準(zhǔn)地反映各因素對(duì)電流值的影響，可作為玻碳電極上CV測(cè)定輔酶Q10的最優(yōu)條件。

2.3 輔酶Q10的吸附伏安響應(yīng)與分析性能

在優(yōu)化條件下測(cè)定不同濃度（0.025、0.25、0.5、1.25、2.5、12.5、25.0 μmol/L）輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液的CV電流并進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)行輔酶Q10的定量測(cè)定，并根據(jù)回歸方程計(jì)算檢出限（LOD）。結(jié)果顯示，其氧化峰電流隨輔酶Q10濃度的增大而增大（圖3），且與輔酶Q10濃度的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，線性范圍為0.025～25.0 μmol/L，線性方程為I=2.554+1.479lgC，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.997，LOD（［lgLOD=（3SD－a）/b］）為19.0 nmol/L。取0.5 μmol/L輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定5次，RSD為1.1%，證明該方法的精密度良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吸附伏安法可靈敏地測(cè)定輔酶Q10，與其他檢測(cè)輔酶Q10的方法相比，本方法表現(xiàn)出很好的分析性能，其線性范圍及檢出限均達(dá)到較高水平（見(jiàn)表2）。

表2 輔酶Q10測(cè)定方法的性能對(duì)比Table 2 Comparison for the detection performances of CoQ10 with different methods

圖3 不同濃度輔酶Q10的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms for different concentration of CoQ10

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，采用CV法對(duì)3種膠囊樣品中的輔酶Q10進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行3種不同濃度水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。測(cè)得回收率為85.9%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～11%。該結(jié)果在可接受的范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法測(cè)定輔酶Q10是一種切實(shí)有效的方法。

表3 樣品中輔酶Q10的測(cè)定結(jié)果及回收率Table 3 The detected results and recoveries of CoQ10 in real samples

3 結(jié)論

本研究實(shí)現(xiàn)了輔酶Q10的吸附伏安法測(cè)定，并采用Box－Behnken響應(yīng)面方法優(yōu)化了樣品處理及測(cè)定條件為：樣品提取超聲時(shí)間為1 min 50 s，測(cè)定溫度為25℃，電解質(zhì)溶劑配比為1.1∶1的甲醇－乙醇。上述條件下，循環(huán)伏安電流與輔酶Q10濃度的對(duì)數(shù)在0.025～25.0 μmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，LOD為19.0 nmol/L，可對(duì)輔酶Q10進(jìn)行精確的定量分析。