超高效液相色譜－高分辨質(zhì)譜分析比較油茶籽油與橄欖油的甘油酯組成差異

胡 謙，張九凱，邢冉冉，陳 穎*，康文瀚，3，苗金梁

（1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京100048；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100176；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

橄欖油是地中海飲食的重要組成，由于其富含不飽和脂肪酸以及大量脂質(zhì)伴隨物（如酚類和生育酚等），而有益于人體健康。油茶是世界上四大木本油料作物之一，油茶籽油是從油茶籽中獲取，其物理化學(xué)性質(zhì)和脂肪酸組成與橄欖油非常相似，被譽為“東方橄欖油”［1］。2009年國家發(fā)改委、財政部、國家林業(yè)局發(fā)布《全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009－2020年）》，這是我國首次為一個樹種出臺國家級規(guī)劃，旨在大力推進油茶籽油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。油茶籽油作為我國特色的木本植物油具有非常大的發(fā)展前景，受到消費者的廣泛喜愛與認可。

食用油的主要營養(yǎng)成分為甘油三酯（Triacylglycerol，TAG），含量高達95%～98%［2］，其次為甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）、游離脂肪酸、酚類、甾醇和磷脂等。油茶籽油和橄欖油的營養(yǎng)價值和化學(xué)組分研究一直受到研究者的關(guān)注，已有許多研究比較了油茶籽油和橄欖油之間的理化性質(zhì)、脂肪酸和其它微量成分的差異。油茶籽油的油酸含量高于橄欖油，而棕櫚酸和硬脂酸低于橄欖油，維生素E、角鯊烯、植物甾醇可與橄欖油相媲美［3－4］。其β-谷甾醇含量比橄欖油高1.58倍，角鯊烯含量比橄欖油低50倍［5］。曹亮等［6］比較了油茶籽油和橄欖油油炸薯條后品質(zhì)特性的變化，發(fā)現(xiàn)在油炸過程中油茶籽油的酸價顯著低于橄欖油，而茴香胺值的增加速率顯著高于橄欖油。甘油三酯是食用油的主要營養(yǎng)成分，可為人體提供能量和必需脂肪酸。然而，油茶籽油和橄欖油之間甘油酯的組成差異尚無文獻報道。與甘油分子結(jié)合的脂肪酸鏈的長度與不飽和度不同，使得甘油三酯分子的種類復(fù)雜多樣，其在不同食用油中的組成和豐度存在非常大的差異。而且脂肪酸鏈的長度、不飽和度及酰基位置不同，會對甘油三酯的消化、吸收和代謝產(chǎn)生影響。確定甘油酯分子在食用油中的組成與豐度，對解析食用油的生物功能和營養(yǎng)健康品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用?；谫|(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于分析食用油中甘油三酯，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜［7－8］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用［9－10］和直接輸注質(zhì)譜［11－12］等。近年來，快速發(fā)展的超高效液相色譜－高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UPLC－HRMS）對復(fù)雜基質(zhì)中脂質(zhì)具有非常強大的分離和檢測能力［13］，廣泛應(yīng)用于食用油的脂質(zhì)分析［14］、品種鑒別［15－16］、真?zhèn)舞b別［17］和油料育種［18］等領(lǐng)域。

本研究旨在采用基于UPLC－HRMS的脂質(zhì)組學(xué)方法分析油茶籽油和橄欖油的甘油酯輪廓信息，采用獨立樣本t檢驗、聚類熱圖分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS－DA），以全面分析比較油茶籽油和橄欖油的甘油酯分子組成，為解析油茶籽油的功能和營養(yǎng)提供基礎(chǔ)，對推動我國油茶籽油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和推廣具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

油茶籽油樣品由贛州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所從各大油茶籽油加工企業(yè)收集，橄欖油購于北京各大商超，樣品經(jīng)烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心鑒定，并采用實驗室已有指紋圖譜方法驗證其真實性。為確保樣品的完整性，收集樣品時盡量覆蓋了不同產(chǎn)地和加工方式。22個油茶籽油和22個橄欖油樣本信息見表1。所有油茶籽油和橄欖油樣品避光儲藏于室溫。

表1 油茶籽油與橄欖油樣本信息Table 1 Camellia oil and olive oil sample information

甲醇、乙腈和異丙醇（德國CNW公司），實驗用水（美國Fisher Chemical公司），乙酸銨（美國Sigma-Aldrich公司），所有試劑均為LC－MS級。每個食用油樣品精確稱?。?0±0.1）mg，溶于含有5 mmol/L乙酸銨的10 mL甲醇－異丙醇（1∶1，體積比）中，劇烈渦旋振蕩使充分溶解，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，置于－20℃保存。

1.2 UPLC－HRMS分析條件

SCIEX ExionLC AD超高效液相色譜系統(tǒng)、Triple TOF 5600型質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）。色譜柱采用Phenomenex Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）。流動相：A為含5 mmol/L乙酸銨的甲醇－乙腈－水（1∶1∶3，體積比）溶液，B為含5 mmol/L乙酸銨的異丙醇溶液。梯度洗脫：0.0～1.0 min，20%B；1.0～3.0 min，20%～70%B；3.0～13.0 min，70%～98%B；13.0～15.0 min，98%B；15.0～15.1 min，98%～20%B；15.1～18.0 min，20%B。流速：0.3 mL/min，柱溫：40℃，進樣量：1 μL。

使用Analyst TF 1.7.1軟件進行數(shù)據(jù)采集，采用TOF MS模式和信息依賴采集（IDA）模式采集正離子的MS和MS/MS譜圖，并結(jié)合動態(tài)背景扣除和實時多重質(zhì)量虧損。離子源溫度：550℃；噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣：207 kPa；霧化氣：345 kPa；輔助加熱氣：379 kPa；去簇電壓：80 V。在TOF MS模式，滯留時間：250 ms，掃描質(zhì)量范圍：m/z100～1 200。在IDA模式，碰撞能量：35 eV；擴展碰撞能量：15 eV；滯留時間：50 ms；掃描質(zhì)量范圍：m/z50～1 200。每間隔5個實驗樣品，使用自動校準系統(tǒng)（CDS）注入APCI校正液自動校準m/z準確度，以維持Triple TOF 5600系統(tǒng)的高質(zhì)量精度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用PeakView 2.2軟件中的MasterView插件，并參考LIPIDMAPS數(shù)據(jù)庫［19］，進行甘油酯的定性分析。輸入甘油酯的分子式、離子加合方式和保留時間，依據(jù)一級精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、保留時間和二級質(zhì)譜圖計算甘油酯的分子種類和峰面積。結(jié)合中性丟失質(zhì)量，推測甘油酯的脂肪?；溄M成［20］。質(zhì)量誤差設(shè)置為0.02 Da，保留時間窗口為0.4 min。建立每個食用油樣品的甘油酯分子和峰面積的數(shù)據(jù)矩陣，并對每個樣品總甘油酯的峰面積進行歸一化處理。

使用MEV 4.9軟件進行聚類熱圖分析，比較油茶籽油和橄欖油之間甘油酯相對含量的差異。使用SIMCA 15.0（瑞典Umetrics）軟件進行PCA和OPLS－DA建模。R2X和R2Y分別表示X矩陣和Y矩陣方差的分數(shù)，Q2表示模型的預(yù)測準確度。為確定模型的擬合質(zhì)量，進行200次置換檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)的液相色譜分離

采用UPLC－HRMS技術(shù)，分析了22個油茶籽油和22個橄欖油樣本的甘油酯輪廓，獲得了大量甘油酯的質(zhì)譜信息。為全面和準確地鑒定油茶籽油和橄欖油中的甘油酯，首先總結(jié)了甘油酯的液相色譜保留規(guī)律。

反相液相色譜洗脫程序時長為18 min，由油茶籽油和橄欖油的基峰色譜圖（BPC，圖1）可知，油茶籽油與橄欖油的甘油酯出峰時間和豐度無明顯差異，因此需要分析每種甘油酯分子的豐度。反相液相色譜根據(jù)等效碳數(shù)（ECN）的大小對甘油酯進行洗脫，即等效碳數(shù)=脂肪?；偺紨?shù)－2雙鍵數(shù)（ECN=CN－2DB），等效碳數(shù)越大，保留時間越長［21］。以脂肪?；偺紨?shù)為54但雙鍵數(shù)不同的甘油三酯為例，TAG 54∶7、TAG 54∶6、TAG 54∶5、TAG 54∶4、TAG 54∶3、TAG 54∶2和TAG 54∶1的等效碳數(shù)依次增加，其保留時間依次增加，分別為10.1、10.4、10.8、11.1、11.4、11.7、12.1 min。不同等效碳數(shù)的甘油三酯被較好地分離，其中含3個雙鍵的脂肪?；偺紨?shù)為54的甘油酯豐度最高。根據(jù)食用油中甘油酯的保留時間，確定在6.5～7.5 min洗脫的主要為甘油二酯，在10.6～12 min洗脫的主要為甘油三酯。

2.2 脂質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

食用油中甘油酯的離子加合方式有3種：［M+NH4］+、［M+Na］+和［M+H］+，且［M+NH4］+的質(zhì)譜響應(yīng)最強，因此以［M+NH4］+的加合方式提取甘油酯分子。MasterView插件可查看每一脂質(zhì)的MS和MS/MS質(zhì)譜圖，無質(zhì)譜圖信息的甘油酯在后續(xù)分析中被排除。甘油酯定性依據(jù)母離子誤差≤5 ppm，且同位素分布誤差＜20%，然后依據(jù)MS/MS質(zhì)譜圖對甘油酯的脂肪酰基鏈進行鑒定，確定甘油酯的分子種類。［M+NH4］+離子在碰撞池內(nèi)易中性丟失1分子NH3和1分子脂肪酸（FA），形成［M－FA+H］+的離子碎片。由于空間位阻作用，sn－2位脂肪酸比sn－1和sn－3位脂肪酸更難丟失，即丟失sn－2產(chǎn)生的碎片比丟失sn－1和sn－3產(chǎn)生的碎片的質(zhì)譜響應(yīng)低，但無法準確區(qū)分sn－1和sn－3脂肪酸，因此在本研究中認為sn－1和sn－3位脂肪酸等同［22］。此外，?；炬湹臄嗔岩?guī)律也受到脂肪酸鏈長度及不飽和度的影響［23］。綜上，甘油酯在碰撞池內(nèi)的斷裂規(guī)律受到多種因素的影響，且甘油酯分子的脂肪?；溄M成可能不止1種，因此本研究尚無法依據(jù)譜圖準確確定甘油酯脂肪酰基鏈的sn位置分布。

圖2 為甘油三酯（TAG 52∶1）的提取離子流圖、同位素譜圖和二級離子質(zhì)譜圖。TAG 52∶1加合NH4生成帶1個正電荷的離子m/z878.817 8，產(chǎn)生3個 碎 片 離 子：m/z577.514 1、579.530 5和605.545 5。依據(jù)中性丟失質(zhì)量計算，分別對應(yīng)中性丟失了1分子的C18∶0、C18∶1和C16∶0。同理，其它TAG和DAG采用相同方法鑒定，并結(jié)合LIPIDMAPS數(shù)據(jù)庫輔助鑒定。表2為油茶籽油和橄欖油中檢測的甘油酯分子及其脂肪?；溄M成，油茶籽油和橄欖油的甘油酯分子組成較為類似。共檢測到55種甘油酯，包括43種甘油三酯和12種甘油二酯。55種甘油酯在油茶籽油中均被檢測到，橄欖油中檢測到34種甘油三酯和10種甘油二酯。相比于油茶籽油，橄欖油未檢測到2種甘油二酯（DAG 36∶6和DAG 38∶3）和9種甘油三酯（TAG 42∶1、TAG 44∶2、TAG 56∶6、TAG 58∶4、TAG 60∶4、TAG 60∶5、TAG 62∶2、TAG 62∶3和TAG 62∶4）。

圖2 TAG 52∶1的鑒定Fig.2 Identification of TAG 52∶1

表2 UPLC－HRMS分析油茶籽油與橄欖油的甘油三酯與甘油二酯組成Table 2 Triacylglycerols and diacylglycerols composition of camellia oil and olive oil by UPLC－HRMS analysis

（續(xù)表2）

HRMS技術(shù)可從分子層面對甘油酯進行分析，已廣泛應(yīng)用于確定食用油的甘油酯組成。Luo等［24］使用超高效合相色譜－HRMS技術(shù)，結(jié)合母離子精確質(zhì)量和碎片離子譜圖，確定了橄欖油中23種甘油三酯。Tu等［25］使用超臨界流體色譜－HRMS技術(shù)，在橄欖油中檢測到11種甘油三酯和12種甘油二酯，在油茶籽油中檢測到11種甘油三酯和3種甘油二酯。Wei等［26］采用UPLC－HRMS技術(shù)在橄欖油和油茶籽油中均檢測到11種甘油三酯。本研究采用UPLC－HRMS技術(shù)結(jié)合提取離子流圖、同位素譜圖和二級離子質(zhì)譜圖，在油茶籽油中檢測到43種甘油三酯和12種甘油二酯，橄欖油中檢測到34種甘油三酯和10種甘油二酯，獲得了更詳細的油茶籽油和橄欖油的甘油酯組成信息。并結(jié)合中性質(zhì)量丟失解析了每種甘油酯的二級質(zhì)譜圖，確定了脂肪?；溄M成。

2.3 脂質(zhì)相對含量的比較分析

通過MasterView插件提取每種甘油酯的峰面積并做歸一化處理，比較油茶籽油和橄欖油中甘油酯相對含量的差異。圖3為油茶籽油和橄欖油中相對含量大于1%的甘油酯，以平均值和標準偏差表示。油茶籽油中相對含量最高的5種甘油酯依次為TAG 54∶3（34.5±1.8%）、TAG 52∶2（14.5±0.8%）、TAG 54∶4（14.3±0.8%）、TAG 52∶3（7.4±0.5%）和TAG 54∶5（5.4±0.6%）。橄欖油中相對含量最高的5種甘油酯依次為TAG 54∶3（30.3±2.1%）、TAG 52∶2（18.0±1.0%）、TAG 54∶4（11.8±1.1%）、TAG 52∶3（9.2±0.7%）和TAG 54∶2（5.9±0.9%）。獨立樣本t檢驗表明，油茶籽油與橄欖油中DAG 36∶3、TAG 50∶1、TAG 50∶2、TAG 52∶1、TAG 52∶2、TAG 52∶3、TAG 54∶2、TAG 54∶3、TAG 54∶4和TAG 54∶5的相對含量存在顯著差異（p＜0.01）。此外，在油茶籽油中檢測到而未在橄欖油中檢測到的2種甘油二酯和9種甘油三酯的相對含量均低于1%。

圖3 油茶籽油與橄欖油中相對含量大于1%的甘油酯Fig.3 Glycerolipids with relative content greater than 1%in camellia oil and olive oil

以55種甘油酯的峰面積，對22種油茶籽油和22種橄欖油進行聚類熱圖分析（圖4）。上側(cè)樹狀為油茶籽油和橄欖油間的聚類，左側(cè)為甘油酯的聚類，中部顏色表示甘油酯相對含量的高低。在聚類熱圖中，油茶籽油和橄欖油被較好地分為兩類，可以準確描述油茶籽油和橄欖油中甘油酯相對含量的差異。

圖4 油茶籽油（YCZY）和橄欖油（GLY）的聚類熱圖分析Fig.4 Clustering heat map analysis of camellia oil（YCZY）and olive oil（GLY）

本研究發(fā)現(xiàn)無論是油茶籽油還是橄欖油，相對含量最高的前5種甘油酯分子的脂肪?；溇?～3條油酸（C18∶1）。三油酸甘油酯（TAG 54∶3）是橄欖油中最主要的甘油三酯，這與Tu等［25］研究一致，也是油茶籽油中最主要的甘油酯。研究表明油茶籽油的油酸含量明顯高于橄欖油［3］，本實驗發(fā)現(xiàn)在甘油酯組成上油茶籽油中三油酸甘油酯的相對含量（34.5±1.8%）顯著高于橄欖油（30.3±2.1%）（p＜0.01）。Wei等［26］采用UPLC－HRMS技術(shù)分析表明，三油酸甘油酯在油茶籽油（47.69%）中的含量高于橄欖油（45.13%），油茶籽油和橄欖油中三油酸甘油酯的相對含量高于本研究的結(jié)果。可能是由于本文檢測的甘油酯分子種類更多，詳細且全面地了解食用油中甘油酯的組成是對甘油酯準確定量的關(guān)鍵。

據(jù)文獻報道，大豆油最主要的甘油三酯依次為三亞油酸甘油酯（TAG 54∶6）和油酸二亞油酸甘油酯（TAG 54∶5），菜籽油最主要的甘油三酯為三油酸甘油酯（TAG 54∶3）和二油酸亞油酸甘油酯（TAG 54∶4），葵花籽油最主要的甘油三酯為油酸二亞油酸甘油酯（TAG 54∶5）和三亞油酸甘油酯（TAG 54∶6）［26］。食用油中甘油三酯是膳食脂質(zhì)的重要來源，油茶籽油和橄欖油主要的甘油酯較為類似，而與其它食用油的差異較大。甘油酯的組成差異會對油脂的消化吸收產(chǎn)生不同程度的影響。

2.4 PCA與OPLS－DA模型

油茶籽油與橄欖油的基峰色譜圖（圖1）差異不明顯，甘油酯分子組成非常類似，但不同甘油酯在豐度上存在差異。為從整體上比較油茶籽油與橄欖油的甘油酯輪廓差異，對甘油酯的相對含量進行PCA和OPLS－DA建模分析。PCA是一種無監(jiān)督的多變量統(tǒng)計分析方法，能對大量、多維的數(shù)據(jù)進行降維分析，且無需樣品的背景信息，可用于分析樣本的歸類趨勢和異常［27］。而OPLS－DA是一種有監(jiān)督的分析方法，可忽略組內(nèi)的隨機誤差，突出組間差異［28］。

無監(jiān)督的PCA是數(shù)據(jù)分析的第一步，圖5A是油茶籽油和橄欖油PCA的得分圖，所有樣本均在95%的置信區(qū)間內(nèi)，未觀察到異常樣本。油茶籽油與橄欖油在第一主成分和第二主成分上聚集成不同的2類，未出現(xiàn)重疊，第一主成分的貢獻率為62.7%，第二主成分的貢獻率為18.3%，說明油茶籽油和橄欖油間的甘油酯豐度存在明顯差異。隨后進行有監(jiān)督的OPLS－DA，以最大程度地提高組間差異，突出關(guān)鍵變量和潛在差異物，油茶籽油與橄欖油在OPLS－DA得分圖上聚集成2類（圖5B）。OPLS－DA模型的R2X=0.739，R2Y=0.952，Q2=0.933。S－plot圖（圖5 C）中離原點越遠的甘油酯對模型貢獻越大，在油茶籽油和橄欖油中差異越大。OPLS－DA模型經(jīng)200次置換檢驗（圖5D），R2截距為0.013 1，Q2截距為－0.269。R2Y和Q2的值接近1，差值為0.019，且R2截距＜0.3，Q2截距＜0.05，表明該模型擬合較好，未出現(xiàn)過擬合［29］。雖然有2種甘油二酯和9種甘油三酯僅在油茶籽油中檢測到，但這些甘油酯對模型的貢獻不明顯（VIP值＜1.0），即可能在脂質(zhì)整體組成上的貢獻不大，所以認為這些甘油酯不是關(guān)鍵甘油酯。依據(jù)VIP值＞1.0且p值＜0.01篩選油茶籽油和橄欖油的關(guān)鍵甘油酯，結(jié)果表明，TAG 54∶3、TAG 54∶4和TAG 54∶5是油茶籽油中的關(guān)鍵甘油酯，TAG 50∶1、TAG 50∶2、TAG 52∶1、TAG 52∶2、TAG 52∶3和TAG 54∶2是橄欖油的關(guān)鍵甘油酯。

圖5 油茶籽油與橄欖油中甘油酯的主成分分析與正交偏最小二乘法判別分析Fig.5 Principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least squares－discriminant analysis（OPLS－DA）of glycerolipids in camellia oil and olive oil

油茶籽油和橄欖油中的主要脂質(zhì)為甘油三酯。與甘油分子結(jié)合的脂肪酸的脂肪?；溛恢?、鏈長、不飽和度不同，會導(dǎo)致甘油三酯的消化、吸收和代謝產(chǎn)生差異［30］。膳食脂質(zhì)的消化起始于胃的乳化，10%～30%的甘油三酯會被胃脂肪酶水解為脂肪酸和甘油二酯，甘油三酯的主要消化是在小腸被胰脂肪酶水解為sn－2位甘油一酯和游離脂肪酸，進而通過被動擴散被小腸上皮細胞吸收［31］。從甘油酯組成上看，油茶籽油和橄欖油富含三油酸甘油酯，其在胃腸道中水解為1分子2-油酸甘油一酯和2分子油酸。一項甘油三酯體外消化模型研究表明，甘油三酯的sn－1和sn－3位上的單/多不飽和酸會限制最大游離脂肪酸釋放量和表觀速率常數(shù)，即三棕櫚酸甘油酯＞三硬脂酸甘油酯＞三油酸甘油酯［32］。不同游離脂肪酸的消化率會存在明顯差異，一般認為短鏈＞長鏈，飽和＞不飽和［32］。油茶籽油和橄欖油富含油酸，研究表明高油酸花生油和橄欖油（富含單不飽和脂肪酸）補充喂養(yǎng)可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善高果糖高脂飲食小鼠的代謝綜合征［33］。本研究篩選到油茶籽油的3種關(guān)鍵甘油酯，橄欖油的6種關(guān)鍵甘油酯，可作為進一步揭示油茶籽油功能和營養(yǎng)的靶標。

3 結(jié)論

本文采用UPLC－HRMS技術(shù)分析了油茶籽油和橄欖油中甘油酯的組成，發(fā)現(xiàn)油茶籽油和橄欖油的BPC差異較小，兩者的甘油酯分子組成非常相似。建立了油茶籽油和橄欖油的55種甘油酯分子數(shù)據(jù)庫，獲得了全面的甘油酯分子組成信息，發(fā)現(xiàn)了大量在油茶籽油和橄欖油中未報道的甘油酯分子。進一步以甘油酯分子的峰面積為分析變量進行多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)油茶籽油和橄欖油具有顯著的分類趨勢。篩選出3種甘油酯作為油茶籽油的關(guān)鍵脂質(zhì)，6種甘油酯作為橄欖油的關(guān)鍵脂質(zhì)。結(jié)果表明，UPLC－HRMS技術(shù)可全面分析食用油的甘油酯組成，結(jié)合多變量統(tǒng)計分析可用于區(qū)分油茶籽油和橄欖油，為解析油茶籽油的營養(yǎng)和功能提供基礎(chǔ)。