鹽霉素對乳腺癌干細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制

曹露，吳開祥，張亞，孫雯雯，楊會，張樹鵬

山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科，山東泰安271000

近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，已成為威脅女性健康的“頭號殺手”。目前，乳腺癌的治療方法主要有外科手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療等［1-2］。以往認為，腫瘤細胞具有同一性，傳統(tǒng)腫瘤治療方法針對的是具有同一性的腫瘤細胞，放過了腫瘤干細胞，所以治療后常常會復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因［1］。消滅腫瘤干細胞有可能為腫瘤治療開辟新的途徑。2003年AL-HAJJ等［3］從乳腺癌組織中分離出具有CD44+/CD24-/low特殊表型的乳腺癌細胞，并將100個具有這種表型的乳腺癌細胞注射于NOD/SCID小鼠體內(nèi)，數(shù)月內(nèi)即可在體內(nèi)形成1 cm左右大小的腫瘤，而CD44+/CD24+表型的乳腺癌亞群細胞即使注射多于10 000個也未能形成腫瘤。結(jié)果表明，具有CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌亞群細胞有可能是乳腺癌干細胞。鹽霉素是一種新型的靶向殺傷腫瘤干細胞藥物［4］。GUPTA等［5］研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素具有特異性殺傷乳腺癌干細胞的作用，并且其對乳腺癌干細胞的殺傷作用是紫杉醇的100多倍。本研究觀察了鹽霉素對乳腺癌干細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7（以下稱MCF-7細胞），由山東第一醫(yī)科大學生命科學研究中心實驗室保存。鹽霉素，純度>99%，購自美國Sigma公司，試驗前用DMSO配制成濃度1.33 mmol/L鹽霉素溶液，4℃冰箱保存。顯微鏡，購自日本Olympus公司；酶標儀，購自美國BIO-RAD公司；FACS Calibur流式細胞儀，購自美國BD公司。MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，購自美國Genview公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。CD44-FITC、CD24-PE，購自美國Becton Dickinson公司；Caspase-3、Caspase-9、PARP、β-catenin、Survivin、Bcl-2、Bax、β-actin一抗，購自美國Cell Signaling Technology公司；通用型二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 乳腺癌干細胞鑒定

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 將MCF-7細胞接種于含20 ng/mL表皮生長因子、10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、0.4%B27細胞培養(yǎng)添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)1周左右，MCF-7細胞不斷增殖形成微球體，用0.125%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，800 r/min離心3 min，棄上清；收集細胞，以1×105個/mL密度接種于上述新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)下一代懸浮微球體細胞，依此類推。

1.2.2 乳腺癌干細胞檢測 取對數(shù)生長期MCF-7細胞和第3代懸浮微球體細胞，分別用胰蛋白酶-EDTA消化成單細胞懸液，收集MCF-7細胞和第3代懸浮微球體細胞各約1×106個，置于流式管中，PBS重懸，然后分別加入CD44-FITC、CD24-PE各5μL，充分混勻，4℃孵育30 min，采用流式細胞術(shù)檢測乳腺癌干細胞百分比。

1.3 乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞活性檢測 取第3代懸浮微球體細胞，用新鮮培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔200μL。隨機將細胞分為0.5、2、5、7、9μmol/L鹽霉素組，待微球體形成后，加入適量鹽霉素溶液，使鹽霉素終濃度分別為0.5、2、5、7、9μmol/L。另設(shè)陰性對照組，不予鹽霉素干預(yù)。繼續(xù)孵育12、24、48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μL，輕微振蕩，使結(jié)晶充分溶解。酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的吸光度值，計算細胞存活率。

1.4 乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞形態(tài)學觀察 取第3代懸浮微球體細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為2.5、5、9μmol/L鹽霉素組，待微球體形成后，加入適量鹽霉素溶液，使鹽霉素終濃度分別為2.5、5、9μmol/L。另設(shè)陰性對照組，不予鹽霉素干預(yù)。繼續(xù)孵育24 h，倒置相差顯微鏡下觀察乳腺癌干細胞形態(tài)學變化。

1.5 乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞凋亡率檢測 取第3代懸浮微球體細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為2、5、9μmol/L鹽霉素組，待微球體形成后，加入適量鹽霉素溶液，使鹽霉素終濃度分別為2、5、9μmol/L。另設(shè)陰性對照組，不予鹽霉素干預(yù)。繼續(xù)孵育24 h，收集5×105個細胞，結(jié)合緩沖液500μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC和PI各5μL，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞周期檢測 取第3代懸浮微球體細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為2、5、9μmol/L鹽霉素組，待微球體形成后，加入適量鹽霉素溶液，使鹽霉素終濃度分別為2、5、9μmol/L。另設(shè)陰性對照組，不予鹽霉素干預(yù)。繼續(xù)孵育24 h，收集1×106個細胞，加入75%乙醇固定，4℃過夜。次日，800 r/min離心6 min，棄上清，PBS 450μL重懸，然后加入核糖核酸酶A 5μL，37℃水浴30 min，再加入PI 1μL，避光反應(yīng)10 min。上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白檢測 取第3代懸浮微球體細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL。隨機將細胞分為0.5、2、5、9μmol/L鹽霉素組，待微球體形成后，加入適量鹽霉素溶液，使鹽霉素終濃度分別為0.5、2、5、9μmol/L。另設(shè)陰性對照組，不予鹽霉素干預(yù)。繼續(xù)孵育24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格。加入4×上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白30μg，SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用8%脫脂奶粉室溫封 閉4 h，分 別 加 入Caspase-3、Caspase-9、PARP、β-catenin、Survivin、Bcl-2、Bax、β-actin一抗，4℃孵育過夜。次日，加入通用型二抗，室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光，暗室中曝光、顯影。采用Image-Pro Plus軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌干細胞鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，MCF-7細胞以大小不等的微球方式生長，隨著培養(yǎng)時間延長，微球體積逐漸增大，以第3代懸浮微球細胞生長最為迅速，成球能力最強。經(jīng)流式細胞儀鑒定，在懸浮微球細胞中CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌干細胞比例為（87.0±0.4）%，而在MCF-7細胞中為（40.1±1.0）%，二者比較P<0.05。

2.2 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞存活率比較 不同濃度鹽霉素均能抑制乳腺癌干細胞存活，并且其抑制作用呈時間和濃度依賴性（P均<0.05）。各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞存活率比較見表1。

表1 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞存活率比較（xˉ±s）

2.3 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞形態(tài)學變化 倒置相差顯微鏡下觀察，陰性對照組懸浮培養(yǎng)的腫瘤細胞折光性好，邊界清晰，大小均一，以微球方式進行生長，隨著培養(yǎng)時間延長，微球體積逐漸增大；2.5、5、9μmol/L鹽霉素組干預(yù)24 h后，乳腺癌微球體逐漸解聚，密度降低，細胞大小不一、極度不規(guī)則，腫瘤細胞內(nèi)部出現(xiàn)顆粒，細胞出現(xiàn)水腫、固縮，細胞碎片產(chǎn)生，并且隨著鹽霉素濃度增加，凋亡現(xiàn)象越來越明顯。

2.4 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞凋亡率比較 見表2。

表2 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞凋亡率比較（%，xˉ±s）

2.5 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞周期變化 見表3。

表3 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞周期變化（xˉ±s）

2.6 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較 見表4。

表4 各組乳腺癌干細胞鹽霉素干預(yù)后細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較（xˉ±s）

3 討論

腫瘤干細胞理論認為，腫瘤組織如同一個器官，其內(nèi)部所有腫瘤細胞并不具有同一性，它們在細胞增殖和腫瘤形成能力方面存在較大差異。腫瘤組織重建僅是由部分具有特殊表型的亞群細胞增殖、分化形成，這種具有特殊表型的亞群細胞叫做腫瘤起始細胞，它可以實現(xiàn)自我更新和分化，能夠促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。由于這部分腫瘤細胞具有人正常干細胞壽命長、分裂緩慢等生物學特征，又被稱為腫瘤干細胞［1，6］。乳腺癌干細胞鑒定一直是近年來的研究熱點。VERSINI等［7］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性微乳頭狀癌和浸潤性導(dǎo)管癌組織CD44分子表達明顯高于正常乳腺組織。ZHANG等［8］在基底型乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，近90%的乳腺癌組織含有CD44+/CD24-/low表型的腫瘤細胞。O′CONOR等［9］在三陰性乳腺癌中亦發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌細胞比例與腫瘤復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。這些研究結(jié)果表明，CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌細胞是乳腺癌干細胞的亞群。

鹽霉素是從白色鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離出來的一種生物活性物質(zhì)，相對分子質(zhì)量為751 kD，屬于一元聚醚類抗生素。鹽霉素是一種高效、廣譜、低耐藥性和低殘留的抗生素，過去一直被作為廣譜抗球蟲藥應(yīng)用［10-11］。2009年GUPTA等［5］首次發(fā)現(xiàn)，鹽霉素具有特異性殺傷乳腺癌干細胞的作用。最近研究證實，鹽霉素對人類各種惡性腫瘤干細胞具有不同程度殺傷作用，如乳腺癌［7］、胃癌［8］、肺腺癌和鱗癌［12］、結(jié)直腸癌［13］和前列腺癌［14］。但其具體作用機制尚不完全清楚。

本研究采用無血清添加生長因子方法培養(yǎng)的MCF-7細胞主要呈CD44+/CD24-/low表型，并將富集CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌微球體細胞作為乳腺癌干細胞進行后續(xù)實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度鹽霉素均能抑制乳腺癌干細胞存活，并且其抑制作用呈時間和濃度依賴性；細胞形態(tài)學觀察和細胞凋亡檢測證實，鹽霉素能夠促進乳腺癌干細胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度鹽霉素能夠使乳腺癌干細胞G2/M期阻滯，表明鹽霉素在誘導(dǎo)乳腺癌干細胞凋亡過程中可能伴有細胞周期改變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素能夠?qū)aspase-9、Caspase-3剪接成有活性的Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3，并且PARP的切割產(chǎn)物也隨著鹽霉素濃度升高而增多；鹽霉素還能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，增強促凋亡蛋白Bax表達，表明鹽霉素能夠通過調(diào)控Bcl家族中Bcl-2、Bax表達，調(diào)控乳腺癌干細胞凋亡。此外，鹽霉素還能下調(diào)β-catenin、Survivin蛋白表達，并且其作用呈濃度依賴性，與張春影等［15］報道一致。由此，我們推測鹽霉素可能通過抑制β-catenin-Survivin-Caspase-3通路和干擾Wnt信號通路活性，誘導(dǎo)乳腺癌干細胞凋亡，從而抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，鹽霉素能夠抑制乳腺癌干細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與抑制β-catenin-Sur?vivin-Caspase-3通路和干擾Wnt信號通路活性有關(guān)。但鹽霉素對乳腺癌干細胞的具體作用機制仍不完全清楚，尚需進一步研究。