瑞巴派特在大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作中的作用

王貴紅，左 婷，李 然，左正才

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽安慶 246000)

痛風(fēng)是血尿酸升高、尿酸鹽(monosodium urate，MSU)結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)中引起關(guān)節(jié)腫痛的炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，發(fā)作時患者會出現(xiàn)劇烈疼痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。近30年來我國高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生率急劇升高[1]，目前我國痛風(fēng)患病率為1%～3%，且逐年上升，痛風(fēng)已成為嚴(yán)重危害人們身體健康的常見疾病。國內(nèi)外對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時的治療主要是使用非甾體抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素[2]，臨床中長期痛風(fēng)的患者常合并腎功能不全、代謝性疾病、消化道潰瘍等，隨著我國人口老齡化加劇，老年痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者越來越多，但上述三種藥物的使用卻受到限制。

瑞巴派特(rebamipide)作為一種治療消化道潰瘍、急慢性胃炎、急性加重期胃黏膜病變的藥物，已于臨床應(yīng)用20余年，安全性、耐受性良好。體外研究表明，胃黏膜保護(hù)劑瑞巴派特可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與Caspase-1抑制尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β的產(chǎn)生[3]。以往研究顯示，瑞巴派特通過抑制炎癥因子、氧化應(yīng)激等機(jī)制，對骨關(guān)節(jié)炎[4]和干燥綜合征[5]等炎癥性疾病有治療作用，但對于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎這種細(xì)胞因子在發(fā)病機(jī)制中起重要作用的炎癥性疾病，瑞巴派特的作用尚不明確，本研究的目的是通過動物實(shí)驗(yàn)探討瑞巴派特在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

42只雄性Sprague-Dawley大鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大鼠體質(zhì)量(240±20) g。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠在中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物房中進(jìn)行5～7 d的馴化，溫度25 ℃，濕度50%，12 h光暗交替周期。實(shí)驗(yàn)過程中所有大鼠均喂食標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料，本研究動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物管理與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)開始前對大鼠進(jìn)行稱重和標(biāo)記，使用Excel軟件創(chuàng)建隨機(jī)表，42只大鼠按隨機(jī)表法分為3組，每組14只。A組為口服瑞巴派特，B組為口服秋水仙堿，C組為口服安慰劑(生理鹽水)。瑞巴派特的劑量為每日200 mg/kg，以生理鹽水配制成9 mL溶液，每隔8 h灌胃3 mL。秋水仙堿的劑量為每日1 mg/kg，以生理鹽水配制成6 mL溶液，分兩次灌胃。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模6 h前，三組分別以各自相應(yīng)藥物3 mL灌胃一次，造模后，A組每隔8 h以瑞巴派特溶液3 mL灌胃一次，B組每隔8 h灌胃一次，第一次與第三次給予秋水仙堿溶液3 mL，第二次給予生理鹽水3 mL，C組每隔8 h以生理鹽水3 mL灌胃一次。

1.3 制備大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型

將MSU晶體(Sigma，St.Louis，MO，USA)混合在10%(體積分?jǐn)?shù))Tween-80溶液中，0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水，10%(體積分?jǐn)?shù))氯仿麻醉下，用1 mL注射器抽吸50 μL(內(nèi)含5 mg MSU)以針尖45°注入大鼠右踝關(guān)節(jié)。觀察0、6、12、24、48、72 h各時間點(diǎn)大鼠踝關(guān)節(jié)的臨床表現(xiàn)，分別于0、48、72 h每組各處死2只大鼠，于24 h時每組處死8只大鼠。用毛細(xì)采血管眼眶靜脈穿刺采集血樣，室溫下凝結(jié)30 min，10 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到1.5 mL微量離心管中，-80 ℃保存。

1.4 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的評估

通過臨床評分或腫脹指數(shù)[使用寬條(2～3 mm)和卡尺測量右踝關(guān)節(jié)腫脹]來監(jiān)測大鼠的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)情況。踝關(guān)節(jié)評分[6]：0=正常；1=踝關(guān)節(jié)輕度腫脹和發(fā)紅，可見體表骨性標(biāo)志，輕度跛行；2=踝關(guān)節(jié)明顯腫脹和發(fā)紅局限于踝關(guān)節(jié)，體表骨性標(biāo)志消失，明顯跛行；3=踝關(guān)節(jié)外肢體腫脹，腳完全離地，三足步態(tài)。各時間點(diǎn)于處死大鼠前觀察踝關(guān)節(jié)的臨床表現(xiàn)，測量右踝關(guān)節(jié)周長，腫脹指數(shù)=(測量時間點(diǎn)的關(guān)節(jié)周長-初始周長)/初始周長[6]。

取大鼠血清標(biāo)本，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(R&D Systems，Minnesota，USA)檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α水平。使用微板讀取器在450 nm處讀取光密度值。

1.5 組織學(xué)檢查

分離大鼠踝關(guān)節(jié)，以10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣過夜，從矢狀面切開，石蠟包埋，制成2 μm切片，蘇木精-伊紅染色。采用手動計數(shù)計算中性粒細(xì)胞的滑膜浸潤，并使用5分量表進(jìn)行評估[7]：0=正常，1=最小浸潤，2=輕度浸潤，3=中度浸潤，4=強(qiáng)浸潤。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSU誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)過程中所有實(shí)驗(yàn)動物生長良好，24 h時，C組剩余12只大鼠中有3只未出現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎，造模成功率75%。C組的臨床評分12 h高于6 h，24 h達(dá)到最大值，48和72 h持續(xù)下降，腫脹指數(shù)在24 h達(dá)到峰值，后逐漸下降，到72 h基本恢復(fù)正常(圖1)。A組和B組的臨床評分和腫脹指數(shù)隨時間推移未見顯著變化(圖2)。

圖1 尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作大鼠模型Figure 1 Rat model of acute gout arthritis induced by monosodium urate crystals

圖2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)后5個時間點(diǎn)各組大鼠的臨床評分和腫脹指數(shù)Figure 2 Clinical score and swelling index of the three rat groups at the five time points after model induced

造模24 h時，C組的臨床評分[2 (1～3)]明顯高于A組[0 (0～1)]和B組[1 (0～2)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)；C組的腫脹指數(shù)[0.36 (0.16～0.52)]也明顯高于A組[0.11 (0～0.20)]和B組[0.12 (0～0.16)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

造模24 h時，C組滑膜組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤[5分量表評分為4 (2～4)]，A組[1 (0～2)]與B組[1 (0～2)]未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(圖3)。C組的中性粒細(xì)胞浸潤評估明顯高于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001, 表1)。

圖3 各組大鼠不同時間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞的浸潤(HE ×400)Figure 3 The infiltration of inflammatory cells in ankle joint synovium at the different time points of the three rat groups (HE ×400)

2.2 三組大鼠血清炎癥因子的變化

C組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈先升高后下降的趨勢，A組和B組各因子的水平無明顯變化規(guī)律(圖4)。

造模24 h后，C組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯高于A組和B組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 造模24 h后三組大鼠血清細(xì)胞因子、臨床表現(xiàn)、組織學(xué)變化的比較Table 1 Comparison of serum cytokines, clinical manifestations and histological changes in three rat groups at 24 h after modeling

IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor.圖4 造模后4個時間點(diǎn)三組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的變化Figure 4 Changes of serum IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α levels in three rat groups at the 4 time points after induced by MSU crystals

3 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時，沉積的MSU晶體可誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)滲入關(guān)節(jié)滑膜，伴有劇烈的紅腫熱痛和血管通透性增加[8]，癥狀在發(fā)病12～24 h內(nèi)達(dá)高峰，通常在1～2周內(nèi)緩解[9]。既往的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動物模型研究顯示，通過大鼠右踝關(guān)節(jié)注射MSU后成功誘導(dǎo)了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作[4]。本研究中觀察到安慰劑對照組大鼠右踝關(guān)節(jié)注射MSU后的臨床表現(xiàn)和炎癥細(xì)胞浸潤與痛風(fēng)患者急性發(fā)作的表現(xiàn)一致，炎癥反應(yīng)在造模后24 h前后最為明顯，表明本研究使用MUS晶體成功誘導(dǎo)了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作為一種炎癥性疾病，細(xì)胞因子在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用，目前認(rèn)為，IL-1β是誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要細(xì)胞因子，甚至有研究提出急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是IL-1β炎性疾病的原型[10]。Caspase-1可以激活促炎細(xì)胞因子IL-1和IL-8，在一種膠原蛋白實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，Caspase-1抑制劑抑制了IL-1β的產(chǎn)生，改善了疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程[11]。氧化應(yīng)激是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的另一重要因素，有研究表明，抑制活性氧生產(chǎn)和減少氧化應(yīng)激可以預(yù)防和緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作[12]。

瑞巴派特的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)前列腺素合成、激活生長因子、抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥[13]，同時通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子的激活，抑制IL-1β、TNF-α和IL-8的產(chǎn)生[14-15]。一項(xiàng)使用瑞巴派特治療環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎的動物模型研究顯示，瑞巴派特抑制了大鼠體內(nèi)的髓過氧化物酶、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[16]。一項(xiàng)小鼠骨關(guān)節(jié)炎動物模型的研究也顯示，瑞巴派特下調(diào)了IL-1β、TNF-α和NF-κB等的mRNA表達(dá)[17]。人類細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)中，瑞巴派特通過抑制Caspase-1與氧化應(yīng)激，有效抑制了由MSU晶體介導(dǎo)的IL-1β的激活和釋放[3]。既往研究結(jié)果提示，瑞巴派特可能具有預(yù)防痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在安慰劑組中，MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，于造模后24 h達(dá)到高峰，而瑞巴派特組和秋水仙堿組大鼠血清中各因子水平隨時間推移無明顯變化，與安慰劑組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，瑞巴派特組和秋水仙堿組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙堿均可抑制MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的產(chǎn)生，瑞巴派特抑制炎癥因子產(chǎn)生的效果與秋水仙堿相當(dāng)。

秋水仙堿是臨床廣泛使用的治療、預(yù)防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的首選藥物之一[2]。本研究顯示，在提前給予秋水仙堿和瑞巴派特口服的大鼠組，右踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后未觀察到明顯的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的臨床表現(xiàn)，關(guān)節(jié)組織病理也未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，而在給予安慰劑對照的大鼠組，我們觀察到了典型的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的臨床過程，關(guān)節(jié)滑膜組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤。在關(guān)節(jié)炎臨床評分、腫脹指數(shù)、中性粒細(xì)胞浸潤程度等方面，安慰劑對照組都明顯高于秋水仙堿組和瑞巴派特組(P<0.01)，瑞巴派特組和秋水仙堿組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙堿成功預(yù)防了MUS晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作，且兩者之間的療效相當(dāng)。

綜上所述，本研究通過在大鼠踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體成功誘導(dǎo)了大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作，大鼠造模前提前給予瑞巴派特和秋水仙堿可以抑制MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作，同時抑制關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤，抑制血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。