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    3例SUN5基因變異導(dǎo)致無頭精子癥的遺傳學(xué)分析和助孕治療結(jié)局

    2021-08-24 09:07:26倪菁菁夏彥清曲曉偉張慧娟張翠蓮郭海彬
    關(guān)鍵詞:錯義生殖精子

    馮 科,倪菁菁,夏彥清,曲曉偉,張慧娟,萬 鋒,洪 鍇,張翠蓮,郭海彬△

    (1. 河南省人民醫(yī)院生殖中心,河南省生殖醫(yī)學(xué)工程國際聯(lián)合實驗室, 鄭州 450003; 2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院遺傳流行病與基因組學(xué)研究中心, 江蘇蘇州 215000; 3. 北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科, 北京 100191)

    畸形精子癥是男性不育的常見原因之一[1],其中無頭精子癥(acephalic spermatozoa syndrome,ASS)是一種嚴(yán)重導(dǎo)致男性不育的罕見畸形精子癥,其特征是精液中含有無頭精子尾部和一些松散的精子頭部,主要表現(xiàn)為頭頸部連接處異常[2-3],精子在電子顯微鏡下通常顯示精子頭部和尾部之間缺少植入窩和基板[4]。ASS有2種亞型:一種類型表現(xiàn)為沒有細(xì)胞核的小“針頭樣”精子,另一種類型是頭頸部錯誤連接的精子[3,5]。從臨床上疾病的家族聚集性和罕見的近親家系導(dǎo)致發(fā)病等遺傳特征分析,考慮ASS可能為常染色體隱性遺傳性疾病,已有研究表明SUN5雙等位基因變異可導(dǎo)致ASS[6]。由于目前報道的ASS病例數(shù)較少,SUN5基因的致病變異譜尚不完整,基因型與表型之間的相關(guān)性仍不明確。本研究回顧性分析河南省人民醫(yī)院生殖中心發(fā)現(xiàn)的3例SUN5基因變異導(dǎo)致的ASS,其中有2個位點是未見報道的新發(fā)變異。結(jié)合臨床表型、精子形態(tài)學(xué)檢查、精子透射電鏡檢查,同時使用全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)技術(shù)篩查、Sanger測序驗證和變異致病性分析進(jìn)行研究,探索SUN5基因引起ASS的發(fā)病機(jī)制及輔助生殖助孕治療的結(jié)局。

    1 病例資料

    1.1 臨床資料和方法

    回顧性分析2015年8月至2019年5月就診于河南省人民醫(yī)院生殖中心男科的3例男性不育患者,包括家族史、臨床表型、實驗室檢查及輔助生殖技術(shù)助孕等臨床信息。

    1.2 精液分析和精子形態(tài)學(xué)檢測

    禁欲3~7 d后手淫法取精液于干燥的無菌容器內(nèi),置37 ℃恒溫操作臺上靜置60 min以上,待精液液化后采用西班牙全自動精子質(zhì)量分析儀分析。使用“拉薄”技術(shù)直接涂片,采用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)第五版改良巴氏染色法染色。參照WHO第五版精子形態(tài)判讀標(biāo)準(zhǔn),每份樣本由專業(yè)檢測人員人工鏡下分析至少200條精子,計算正常形態(tài)精子率、頭部、頸部、尾部畸形率。

    1.3 透射電鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)

    取患者及正常對照組的精液樣本,3 000×g離心10 min,棄上清,加入2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛固定24 h以上,磷酸鹽緩沖液洗滌4次,每次10 min,1%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸固定90 min,磷酸鹽緩沖液洗滌4次,每次10 min,然后依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%丙酮洗滌,每次10 min,用100%丙酮洗滌3次,每次10 min,加入812樹脂,37 ℃過夜聚合,用萊卡EMUC7超薄切片機(jī)切片,取切片在日本JEOLJEM-1400透射電鏡下觀察和拍照。

    1.4 基因組DNA提取和全外顯子組測序與Sanger測序驗證

    在患者知情同意下留取血液2 mL,通過基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)提取樣本DNA。將基因組DNA打斷成隨機(jī)片段,純化后進(jìn)行全基因組外顯子捕獲和富集,并制備基因組DNA文庫,然后使用Illumina Hiseq 2500測序儀進(jìn)行高通量測序,結(jié)合OMIM、HGMD、1000Genome、GenomAD等數(shù)據(jù)庫收錄的致病基因和變異的信息對檢出的變異進(jìn)行分析。利用蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件(SIFT、Mutation Taster和PolyPhen-2軟件)對該基因變異致病性進(jìn)行預(yù)測分析,對檢出的可能致病變異進(jìn)行Sanger測序驗證。

    1.5 蛋白序列同源性比對

    查找Uniprot和Ensembl數(shù)據(jù)庫中該基因的人類及其他哺乳動物的蛋白序列,使用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白序列同源性比對。

    1.6 輔助生殖技術(shù)助孕治療

    3例男性不育患者及配偶均簽字同意接受輔助生殖技術(shù)助孕治療。對其配偶實施促排卵治療,待卵細(xì)胞發(fā)育成熟后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。取卵日男方手淫取精后送體外受精(invitrofertilization, IVF)實驗室鏡檢,挑選形態(tài)相對正常的成熟精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療。受精卵在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3~5 d,選擇發(fā)育良好的胚胎進(jìn)行移植,如果因卵巢過度刺激綜合征等因素取消新鮮移植周期,則實施冷凍胚胎的復(fù)融移植,觀察并記錄相應(yīng)的胚胎實驗室數(shù)據(jù),隨訪并記錄女方移植后的妊娠結(jié)局。

    1.7 臨床診斷與家系分析

    3例患者均為散發(fā)的不育男性,年齡分別為25、42、26歲,3例患者的一般體格檢查無明顯異常。男性外生殖器發(fā)育正常,雙側(cè)睪丸體積正常,觸診雙側(cè)附睪及精索靜脈無結(jié)節(jié)、囊腫和壓痛。多次精液分析均提示可見大量幼稚精子,具有活動能力。性激素水平正常,染色體核型為46XY,生精基因AZF未見缺失,且患者父母均否認(rèn)出現(xiàn)類似病史,否認(rèn)近親結(jié)婚,家族中也未發(fā)現(xiàn)表型類似成員。

    1.8 精子改良巴氏染色涂片

    3例患者的精子經(jīng)改良巴氏染色后顯微鏡下觀察均可見大量無頭精子,99%無頭畸形,0.9%頸部畸形(圖1)。

    1.9 透射電子顯微鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)

    透射電子顯微鏡下正常的精子超微結(jié)構(gòu)包括頂體、細(xì)胞核、近遠(yuǎn)端中心粒、線粒體鞘以及“9+2”尾絲結(jié)構(gòu)等(圖2A),一個無頭精子尾部包括近遠(yuǎn)端中心粒、節(jié)段柱、線粒體鞘等結(jié)構(gòu)(圖2B),一個無尾的精子包含細(xì)胞核結(jié)構(gòu)但缺乏植入窩、基板和尾部(圖2C),一個精子首尾異常分離表明,頭部包含核和幾乎正常形態(tài)的頂體,尾部有正常排列的軸索,但缺乏核尾極的植入窩和基板(圖2D)。

    1.10 全外顯子組測序及變異的Sanger驗證

    3例患者均存在SUN5(NM_080675.3)基因變異,分別為1例純合錯義變異位點c.7C>T(p.Arg3Trp)、1例錯義變異位點c.1067G>A(p.Arg356His)和無義變異位點c.216G>A(p.Trp72*)的復(fù)合雜合變異、1例純合錯義變異c.1043A>T(p.Asn348Ile)。Sanger測序驗證結(jié)果表明患者攜帶的基因變異分別來自父母雙方。

    1.11 變異致病性預(yù)測分析

    對3個錯義變異位點c.7C>T(p.Arg3Trp)、c.1067G>A(p.Arg356His)、c.1043A>T(p.Asn348Ile)的致病性進(jìn)行預(yù)測,SIFT、Mutation Taster和PolyPhen-2軟件功能預(yù)測結(jié)果均為有害(表1);而無義變異位點c.216G>A(p.Trp72*)導(dǎo)致肽鏈合成提前終止,對蛋白功能影響可能較大。

    表1 3位患者SUN5基因變異的致病性評價Table 1 Pathogenicity prediction of SUN5 gene mutation in 3 patients

    1.12 變異位點的保守性分析

    3例患者檢出的錯義變異位點p.Arg3Trp、p.Arg356His和p.Asn348Ile在人類和其他哺乳動物同源蛋白的相同位點高度保守,發(fā)生的錯義變異極有可能對蛋白功能有害。

    1.13 輔助生殖技術(shù)助孕結(jié)局

    3例男性患者及配偶同意接受ICSI助孕治療,均成功生育血親后代(表2)。

    表2 3例患者的基本參數(shù)和ICSI實驗室數(shù)據(jù)Table 2 Basic parameters and ICSI laboratory data of 3 patients

    A, sperm morphology of normal control group; B, C, D, sperm morphologies of a patient (modified Pap staining, ×200)圖1 正常形態(tài)精子和1例患者經(jīng)改良巴氏染色的無頭精子形態(tài)Figure 1 Morphology of normal sperm and a patient of acephalous sperm with modified pasteurization stain

    2 討論

    目前,不孕不育是影響全球人類健康的主要醫(yī)學(xué)和社會問題。大約8%~18%的育齡夫婦面臨生育問題[7],而男性因素、尤其是異常的精子發(fā)生和射精障礙占59%。精子形態(tài)與其功能密切相關(guān),精子形態(tài)上的任何缺陷都可能會導(dǎo)致其功能異常[8]。無頭精子癥早期也被稱為針形精子癥或斷頭精子癥,大部分精子頭部滯留在睪丸內(nèi)。在精液中大部分精子都是不包含遺傳物質(zhì)的尾部,實際上是完全無法自然受精的[9]。

    A, sperm ultrastructure of the normal contral group; B, C, D, sperm ultrastructures of a patient (×20 000, 80 kV)圖2 正常精子超微結(jié)構(gòu)和1例患者的精子超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Ultrastructure of normal sperm and the ultrastructure of a patient’s sperm

    人的SUN5基因全長約22.7 kb,包含13個外顯子,定位于20q11.21,編碼的SUN5蛋白含有379個氨基酸,有一個SUN結(jié)構(gòu)域,特異表達(dá)于睪丸組織[10],定位在成熟精子頭頸部連接區(qū)域。SUN5基因是第一個被人類發(fā)現(xiàn)的ASS的致病基因,隨后又相繼發(fā)現(xiàn)致病基因PMFBP1、TSGA10。SUN蛋白有5種,所有的SUN蛋白都存在于生精細(xì)胞中,其表達(dá)和定位受到嚴(yán)格的控制。SUN5蛋白是在減數(shù)分裂的早期產(chǎn)生的,其特征是C-末端為保守的SUN結(jié)構(gòu)域,N-末端為跨膜區(qū)域,中間為卷曲螺旋區(qū)域,一般通過與KASH(Klarsicht, ANC-1, and Syne/Nesprin homology)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成核骨架和細(xì)胞骨架的連接子(linker of nucleoskeleton and cytoskeleton,LINC)復(fù)合體[11],參與細(xì)胞核的錨定[12]、遷移[13]和精子發(fā)生等過程[14]。SUN5蛋白定位于核膜及植入窩區(qū)域,可能參與頭尾黏連作用(將耦合裝置與精子頭部細(xì)胞核膜連接)。在附睪的精子中,SUN5蛋白位于頭部與尾部之間的交界處,通過高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)完成翻譯后修飾[15]。SUN5基因的變異導(dǎo)致了SUN5蛋白嚴(yán)重減少或缺失,某些變異可以改變SUN5蛋白在精子頭尾交界處的分布,從而導(dǎo)致頭尾之間被截斷。Zhu等[6]研究結(jié)果表明,雙等位基因SUN5的變異能夠?qū)е氯藷o頭精子癥,從而引起男性不育,為常染色體隱性疾病。動物研究也發(fā)現(xiàn)SUN5定位于精子頸部,錨定精子頭和尾部。經(jīng)過小鼠模型中的精子超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),SUN5缺失后,盡管精子頭尾連接耦合裝置(head to tail coupling apparatus, HTCA)可以正常組裝,但在精子變形之初HTCA就從精子核膜植入窩處分離,隨著精子不斷延長,最終HTCA連同精子尾巴一起從精子頭部脫落,產(chǎn)生沒有受精功能的無頭精子。

    目前,SUN5基因變異相關(guān)的ASS均符合常染色體隱性遺傳規(guī)律,等位基因上存在兩個有害變異即可能致病。本文報道的3例ASS均存在SUN5基因上的致病變異,分別為兩個純合變異和一個復(fù)合雜合變異,包括兩個未報道的新發(fā)錯義變異位點c.7C>T(p.Arg3Trp)和c.1067G>A(p.Arg356His),兩個已報道的致病變異位點c.216G>A(p.Trp72*)和c.1043A>T(Asn348Ile)[6],以上位點在正常人群中變異率極低,其中c.216G>A(p.Trp72*)變異位點為無義變異,編碼第72位氨基酸Trp的密碼子變?yōu)榻K止密碼子,預(yù)測可能導(dǎo)致肽鏈的合成中斷或發(fā)生無義介導(dǎo)的mRNA降解,造成嚴(yán)重的蛋白功能缺失[6];第348和356位氨基酸位于SUN5蛋白的SUN結(jié)構(gòu)域內(nèi),且第356位氨基酸存在已知的另一變異p.Arg356Cys,若該結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生基因變異,可能嚴(yán)重破壞SUN5蛋白與其他相鄰蛋白的相互作用,如KASH或LINC蛋白[6]。3個錯義變異位點同源蛋白的氨基酸殘基高度保守,保證蛋白質(zhì)功能正常,變異致病性預(yù)測均為有害,以上結(jié)果均支持c.7C>T(p.Arg3Trp)和c.1067G>A(p.Arg356His)可能為ASS新發(fā)現(xiàn)的致病變異位點。綜合以上遺傳學(xué)分析得出,SUN5基因變異極有可能導(dǎo)致人類ASS的發(fā)生,同時新發(fā)現(xiàn)的變異位點也進(jìn)一步豐富了SUN5基因在ASS患者中的致病變異譜。

    ASS患者精子主要表現(xiàn)為頭尾分離或頭頸部異常,實際上無頭精子不含遺傳物質(zhì),但研究表明頭尾部連接異常的精子可能不會影響受精率和臨床妊娠,大多數(shù)ASS患者通過ICSI可以實現(xiàn)妊娠[16-17]。本研究3例患者的配偶均行該基因相應(yīng)變異位點的驗證,均未發(fā)現(xiàn)相同基因位點變異,通過ICSI治療均成功生育親生子代。即使SUN5基因變異患者通過ICSI治療可具有良好的妊娠結(jié)局,仍然需要注意ASS的遺傳風(fēng)險,在進(jìn)行輔助生殖前,建議男女雙方同時進(jìn)行遺傳咨詢和篩查。在臨床診斷時可通過WES技術(shù)進(jìn)行輔助檢查,及早確定治療方案和輔助生殖助孕方式,減輕家庭和社會的負(fù)擔(dān)。新發(fā)現(xiàn)的SUN5基因變異位點為闡明致病機(jī)制提供了線索和方向,同時也擴(kuò)大了ASS的致病變異譜。

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