補陽還五湯改善脊髓損傷的抗氧化功能及作用機制

范婷婷　萬彩云　盧青青　荊曉朔　張偉　范瑜潔　聶穎　李亮

摘要 目的：探討補陽還五湯（BYHWD）對脊髓損傷（SCI）大鼠的抗氧化作用及其機制。方法：將24只雄性SD大鼠隨機分為對照組、SCI組、BYHWD低劑量（BL）組、BYHWD高劑量（BH）組，每組6只。采用游泳力竭法聯(lián)合紅核脊髓束（RST）橫斷手術(shù)制備SCI氣虛血瘀證大鼠模型，對照組和SCI組予以生理鹽水灌胃，其他組予以BYHWD灌胃，1次/d。通過自發(fā)性直立探究行為（前肢使用率）實驗測試運動功能恢復(fù)情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，激光共聚焦觀察環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（CREB/BDNF）的表達。結(jié)果：干預(yù)后，BH組前肢和右前肢的利用率高于SCI組和BL組（P<0.05或P<0.01）;與SCI組比較，觀察組的MDA水平均下降，SOD水平均上升，以BH組水平變化最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;激光共聚焦法顯示，與SCI組比較，觀察組CREB、BDNF的表達均上升，以BH組表達變化最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：補陽還五湯可改善SCI大鼠的抗氧化功能，其機制涉及CREB/BDNF信號通路的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞 補陽還五湯;脊髓損傷;氣虛血瘀證;氧化應(yīng)激;神經(jīng)營養(yǎng)因子;紅核脊髓束;超氧化物歧化酶;丙二醛

Improve the Antioxidant Function and Action Mechanism of Spinal Cord Injury by Buyang Huanwu Decoction

FAN Tingting1，WAN Caiyun1，LU Qingqing1，JING Xiaoshuo1，ZHANG Wei2，F(xiàn)AN Yujie3，NIE Ying4，LI Liang1

（1 Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 2 College of Integrated Chinese and Western medicines，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 3 Department of Traditional Chinese Medicine，Hunan Brain Hospital，Changsha，Hunan 410007，China; 4 Department of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

Abstract Objective：To explore the effects and the underlying mechanism of Buyang Huanwu Decoction（BYHWD） antioxidant function in spinal cord injury rats.Methods：A total of 24 male rats were randomly divided into the following 4 groups：a control group，a spinal cord injury model group（SCI group），a low-dose of BYHWD group（BL group），a high-dose of BYHWD group（BH group），with 6 rats in each group.The rat model was established by swimming exhaustion combined with the transection of rubrospinal tract（RST）.The rats in control group and SCI group were given normal saline by gavage once，and the other groups were given BYHWD by gavage once.The recovery of motor function was observed by spontaneous vertical exploration test.MDA and SOD in serum was detected by ELISA.laser scanning confocal microscopy was adapted to detect the expression of CREB and BDNF.Results：Compared with the SCI group，the utilization rates of both forelimbs and the right forelimb of the BH group were higher than those of the SCI group and the BL group（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the SCI group，ELISA showed that the expression of MDA were decreased in the treatment group，while the expression of SOD was increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）;Compared with the SCI group，Laser scanning confocal microscopy showed that the expression of CREB and BDNF were increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：BYHWD could improve the antioxidant function through the CREB/BDNF pathway in spinal cord injury rats.

Keywords Buyang Huanwu Decoction; Spinal cord injury; Qi-deficiency and blood-stasis syndrome; Antioxidation; Brain derived neurotrophic factor; Rubrospinal tract; Superoxide dismutase; Malondialdehyde

中圖分類號：R289.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.008

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，常導(dǎo)致運動功能障礙，嚴(yán)重者可致癱瘓，以致殘率高，治愈率低為特點[1-4]。目前，SCI的治療手段主要包括手術(shù)、激素類藥物、物理療法等，雖然能在一定程度上緩解該疾病的癥狀，但對神經(jīng)功能恢復(fù)作用有限[5-6]。因此，有效治療SCI仍是臨床治療和科學(xué)研究中的一個巨大挑戰(zhàn)[7]。隨著現(xiàn)代對中醫(yī)藥應(yīng)用研究的大力開展，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療臨床疾病具有途徑豐富、靶點多樣的特點，對治療SCI有著獨特而確切的優(yōu)勢[8]。補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）在中醫(yī)學(xué)理論中為益氣活血法的代表方，可治療偏癱、疲乏、萎軟等癥狀。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）是環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其活化后可調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）的轉(zhuǎn)錄與表達。CREB/BDNF信號通路的激活在保護神經(jīng)元、促進突觸再生等神經(jīng)修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。有研究表明，在腦血管疾病中，機體抗氧化功能和CREB/BDNF信號通路的激活有關(guān)[11]，并且目前對BYHWD改善脊髓損傷的抗氧化功能及其機制的研究較少，因此，本實驗在建立SCI氣虛血瘀證大鼠模型后，采用行為學(xué)檢測大鼠肢體運動功能狀況、酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性作為抗氧化功能的指標(biāo)，激光共聚焦技術(shù)檢測環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（CREB/BDNF）的表達，共同研究CREB/BDNF信號通路在BYHWD改善SCI抗氧化功能中的作用及其機制，為該疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 購買Sprague-Dawley成年健康雄性大鼠24只，無特定病原體（SPF）級，體質(zhì)量200～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心代購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（許可證號：SCXK（湘）2019-0004，倫理編號：LL2021030503）。在衛(wèi)生清潔、溫度22～25 ℃和相對濕度為50%～70%的飼養(yǎng)環(huán)境中分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行造模給藥干預(yù)，每日按時等量供給高溫高壓滅菌飼料和水。

1.1.2 藥物 BYHWD處方：黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g。BYHWD處方中藥飲片購于老百姓大藥房連鎖股份有限公司，且嚴(yán)格遵循《中華人民共和國藥典》2015年版一部要求。將藥物飲片用電子秤精確稱量，加每份處方藥物重量的10倍量水浸泡0.5 h，煮至沸騰后加熱并保持沸騰0.5 h。紗布過濾煎液，再將煎液用濾紙抽濾得濾液。向所剩藥渣繼續(xù)加入8倍量水，重復(fù)上述操作再得濾液。合并2次濾液至不銹鋼鍋中，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。待膏劑欲形成時迅速取出，稱重，濃縮至生藥濃度為2 g/mL的膏劑，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 苯巴比妥鈉注射液（哈藥集團三精制藥有限公司，批號：H23021167），大鼠MDA ELISA試劑盒（上海樊克生物科技有限公司，批號：FK-S1922），大鼠SOD ELISA試劑盒（上海樊克生物科技有限公司，批號：FK-S1921），Anti-CREB Antibody（Sigma公司，美國，批號：MAB5432），Anti-BDNF antibody（Sigma公司，美國，批號：HPA056104）、山羊抗兔IgG-FITC（Santa Cruz公司，美國，批號：sc-2777），山羊抗小鼠IgG-TRITC（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZF-0313），山羊超敏二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K166918D），酶標(biāo)儀（Sunrise公司，瑞士，型號：F50），激光共聚焦顯微鏡（ZEISS公司，德國，型號：LSM710）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將24只大鼠隨機分為對照組、SCI組、BYHWD低劑量（BL）組、BYHWD高劑量（BH）組、每組6只。除對照組外其余3組均采用“游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)”進行大鼠氣虛血瘀證模型制備[12]：將大鼠放入水溫22～25 ℃，深度40 cm且無逃生平臺的玻璃圓柱桶內(nèi)進行游泳直到力竭，1次/d，1 h/次，持續(xù)21 d，建立“氣虛”狀態(tài)。經(jīng)過21 d的強迫游泳后，注射苯巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，固定于鼠臺，在手術(shù)顯微鏡下逐層分離大鼠頸背部肌肉組織，暴露C3、C4之間頸脊髓，橫斷右側(cè)紅核脊髓束（Rubrospinal Tract，RST），建立局部“血瘀”狀態(tài)。

1.2.2 給藥方法 BL組以BYHWD 10 g/kg灌胃，BH組以BYHWD 40 g/kg灌胃，對照組和SCI組均以等量生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)干預(yù)28 d后處死所有動物。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 肢體行為學(xué)檢測 以RST橫斷術(shù)后0 d、術(shù)后1 d、14 d、28 d為時間點觀察大鼠前肢功能恢復(fù)情況，進行自發(fā)性直立探究行為（前肢使用率）測試。將每只大鼠放入高40 cm的透明玻璃缸內(nèi)，大鼠可自發(fā)豎起前肢攀沿玻璃缸壁進行探究活動。記錄大鼠在5 min內(nèi)使用雙側(cè)前肢觸碰缸壁進行探究行為的次數(shù)（N）、單獨使用右前肢觸碰缸壁進行探究行為的次數(shù)（n），計算總次數(shù)（N+n）。則雙側(cè)前肢、單側(cè)右前肢的使用率分別為N/（N+n）和n/（N+n）。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測血清中MDA、SOD的表達 采集在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的大鼠的靜脈全血2 mL，室溫靜置1 h后在4 ℃溫度下以1 200×g持續(xù)離心15 min，留上層血清樣本用于檢測，遵循大鼠MDA ELISA試劑盒與大鼠SOD ELISA試劑盒說明書進行實驗，在酶標(biāo)包被板上的樣品孔中依次加入樣品稀釋液40 μL、待測樣品10 μL，將待測樣品稀釋5倍;封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min，洗滌，在各反應(yīng)孔中，加新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體50 μL繼續(xù)溫育30 min，洗滌，加底物液50 μL顯色，避光反應(yīng)15 min，加入終止液25 μL，在450 nm波長下讀取光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算MDA SOD的實際表達量。

1.2.3.5 激光共聚焦技術(shù)檢測紅核神經(jīng)元中CREB、BDNF的表達 取固定后的大鼠腦組織樣本，分別進行連續(xù)冰凍切片，保證每片厚度為5 μm，依次裱貼于黏附載玻片上，切片入PBS洗滌2遍，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定30 min，用0.25% TritonX-100和5% BSA透膜封閉切片2 h，PBS洗滌2遍，滴加CREB抗體稀釋液（1∶100）與BDNF抗體稀釋液（1∶100），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，然后將切片在PBS中洗滌并分別與TRITC綴合的鼠抗IgG（1∶200）和FITC綴合的兔抗IgG（1∶200）孵育，在37 ℃的黑暗潮濕容器中放置1 h，PBS洗滌，二脒基苯基吲哚（DAPI）染核并封片，在激光共聚焦顯微鏡400倍下分別觀察紅色TRITC標(biāo)記（細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)）的CREB和綠色FITC標(biāo)記（細(xì)胞質(zhì)）的BDNF，計算平均光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析;不滿足正態(tài)性的資料采用Kruskal-Wallis，不符合方差齊性的資料則采用Dunnett′sT3法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況 SCI組、BL組與BH組大鼠在連續(xù)游泳后出現(xiàn)鼻尖難以透出水面，撈出后呈疲憊狀，目閉身搖，步履蹣跚，一觸即倒;手術(shù)造模后的大鼠蘇醒后出現(xiàn)右側(cè)前爪無法張開，呈屈曲狀態(tài)緊貼軀干。在游泳聯(lián)合手術(shù)造模以及給藥干預(yù)過程中均無大鼠死亡。

2.2 各組自發(fā)性直立試驗結(jié)果比較 在術(shù)后0 d，4組大鼠雙側(cè)前肢和單側(cè)右前肢利用率為40%～55%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。在強迫游泳結(jié)束行RST橫斷術(shù)后1 d，與正常組大鼠比較，其余3組的雙側(cè)前肢和單側(cè)右前肢利用率均為0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）;術(shù)后第14天和第28天，BL和BH組的雙側(cè)前肢和單側(cè)右前肢利用率均高于SCI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）;術(shù)后第28天，BH組的雙側(cè)前肢和單側(cè)右前肢利用率高于BL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 各組血清MDA、SOD水平比較 與正常組比較，SCI組、BL組與BH組的大鼠血清中MDA水平明顯上升，SOD水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01或P<0.05）。其中SCI組MDA水平最高，SOD水平最低;與SCI組比較，BL組與BH組的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）;與BL組比較，BH組大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見圖2。

2.4 激光共聚焦技術(shù)檢測CREB、BDNF在中腦紅核區(qū)的表達 激光共聚焦結(jié)果各組大鼠中腦紅核區(qū)均有CREB和BDNF陽性表達，其中紅色熒光為CREB的陽性表達，綠色熒光為BDNF的陽性表達，藍(lán)色熒光為二脒基苯基吲哚（DAPI）染核表達，圖像合并后，綠色與紅色熒光重合部分，表明CREB與BDNF共定位。與對照組比較，SCI組、BL組中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)目顯著減少，BH組中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF陽性染色細(xì)胞減少程度較輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與SCI組比較，BL組與BH組大鼠中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與BL組比較，BH組大鼠中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖3、圖4。

3 討論

脊髓與中醫(yī)學(xué)理論中的督脈異名而同類，SCI后多表現(xiàn)出偏癱、神經(jīng)反射異常、疼痛、疲乏、口角流涎等癥狀。中醫(yī)學(xué)者大多認(rèn)為其病機與督脈受損，淤血留滯，阻滯氣機，氣血運行不暢加之久臥傷氣相關(guān)，多歸屬于氣虛血瘀證[13]。因此，根據(jù)中醫(yī)學(xué)中“勞則氣耗”的理論，采用“游泳力竭法”，連續(xù)21 d強迫大鼠游泳直到筋疲力竭，制備大鼠“氣虛”狀態(tài)模型[14]。在此基礎(chǔ)上，行RST橫斷術(shù)建立SCI局部血瘀狀態(tài)，RST起源于中腦的紅核，可以調(diào)節(jié)大鼠前肢的精細(xì)運動功能，因此RST受損時，出現(xiàn)運動功能障礙的可能性較大，且RST大部分纖維下行于對側(cè)脊髓，因此在不損傷對側(cè)脊髓的前提下選擇RST一側(cè)橫斷，簡單易行[15-16]。RST橫斷術(shù)不會造成椎弓板損傷，造成的創(chuàng)傷和出血也較少，優(yōu)于傳統(tǒng)造模方式。因此采用游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)制備大鼠SCI氣虛血瘀證模型是可行的。

BYHWD在現(xiàn)代醫(yī)療中多應(yīng)用于心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。研究表明，BYHWD能明顯改善SCI大鼠肢體運動功能，修復(fù)SCI，可能與其改善微循環(huán)、改善軸漿運輸能力、拮抗神經(jīng)元凋亡、抑制神經(jīng)軸突生長抑制因子、促進神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維生長等因素有關(guān)[17-20]。因此，本研究在BL組、BH組大鼠手術(shù)造模后給予不同劑量的補陽還五湯，觀察補陽還五湯對SCI大鼠運動功能的恢復(fù)效果，并探討其可能的作用機制。除對照組外，其余組在連續(xù)21 d的強迫游泳后，均出現(xiàn)目閉身搖，疲軟無力的癥狀，說明游泳力竭法可致氣虛。在行為學(xué)測試中，在RST術(shù)后第1天，與對照組比較，SCI組、BL和BH組在RST橫斷術(shù)后，前肢雙側(cè)及單側(cè)利用率均為0，大鼠身懶喜靜，說明造模后，嚴(yán)重?fù)p傷大鼠前肢運動功能，造模成功。第14天和第28天，與SCI組比較，BL和BH組的前肢利用率均高于SCI組，氣虛癥狀減輕，精神狀態(tài)良好，且第28天，BH組的前肢利用率均高于BL組，氣虛癥狀明顯減輕，精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，說明BYHWD對改善SCI后前肢運動功能有明顯作用，且BH組療效優(yōu)于BL組，提示恢復(fù)時間相同，療效可能與劑量成正比。且與第14天比較，第28天時，BL組與BH組大鼠前肢利用率均明顯上升，精神狀態(tài)恢復(fù)良好，提示在相同劑量條件下，療效可能與治療時間成正比。因此，補陽還五湯治療對SCI后運動功能恢復(fù)效果顯著，加快康復(fù)速度。

BYHWD具有顯著的抗氧化作用，在SCI后，神經(jīng)元缺血缺氧狀態(tài)下將會產(chǎn)生和釋放大量氧自由基，這些產(chǎn)物可破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)胞損傷從而影響神經(jīng)細(xì)胞的功能[21-23]。因此，抑制自由基產(chǎn)生和清除自由基有利于SCI早期治療。研究發(fā)現(xiàn)，MDA可反映自由基水平，是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志。而SOD為氧自由基清除劑，代表機體清除氧自由基的能力[24]。測定MDA、SOD可顯示體內(nèi)自由基的水平，是反映機體抗氧化功能的重要標(biāo)志[25]。CREB是受多種因素調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，其活化后在BDNF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及信號通路激活中發(fā)揮重要作用[26，27]。BDNF主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進突觸再生和營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用[28-30]。研究表明，SCI后神經(jīng)元軸突受損，軸突損傷可能導(dǎo)致軸突運輸能力減弱或消失，進而導(dǎo)致神經(jīng)元胞體萎縮或死亡，神經(jīng)元胞體死亡可導(dǎo)致BDNF缺乏，削弱脊髓修復(fù)能力[31]。且腦血管疾病臨床實驗研究證明，氧化應(yīng)激反應(yīng)可降低BDNF水平，BDNF水平降低則削弱對氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用[32-33]。而SCI后，氧化應(yīng)激與CREB/BDNF信號通路的關(guān)系尚無相關(guān)研究報道。因此，本實驗采用ELISA測定MDA、SOD變化情況反映BYHWD治療SCI的抗氧化功能變化;采用激光共聚焦技術(shù)測定CREB、BDNF在紅核神經(jīng)元中表達水平及定位。共同說明BYHWD治療SCI過程中，抗氧化作用與CREB/BDNF信號通路的關(guān)系。ELISA和激光共聚焦檢測結(jié)果表明，與對照組比較，SCI組的大鼠血清中MDA水平上升，SOD水平下降，說明SCI造模后的大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)明顯，抗氧化能力受損嚴(yán)重。且氧化應(yīng)激狀態(tài)下，中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF表達水平降低，說明氧化應(yīng)激抑制CREB/BDNF信號通路，損害紅核神經(jīng)元功能。與SCI組比較，BL組與BH組的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，同時中腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF表達水平也增加，說明BYHWD干預(yù)可削弱氧化應(yīng)激的影響，抑制和清除氧自由基，激活CREB/BDNF信號通路，提高SCI后大鼠機體的抗氧化能力，而抗氧化能力增強對CREB/BDNF信號通路亦有促進作用，二者相互影響，促進修復(fù)神經(jīng)元功能。與BL組比較，BH組大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，腦紅核區(qū)內(nèi)CREB、BDNF水平上升明顯，說明BYHWD對SCI的抗氧化功能以及抗氧化能力對CREB/BDNF信號通路促進作用可能與BYHWD劑量正相關(guān)。實驗中各指標(biāo)測試結(jié)果與大鼠行為學(xué)測試結(jié)果一致，也佐證了本實驗研究的假設(shè)，說明BYHWD干預(yù)對SCI發(fā)揮抗氧化作用，激活CREB/BDNF信號通路，促進SCI修復(fù)。

綜上所述，BYHWD可改善SCI后氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強機體抗氧化功能，且抗氧化功能與CREB/BDNF信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，二者相輔相成，改善SCI大鼠運動功能，促進SCI修復(fù)，且呈劑量依賴性，為臨床診療提供新的思路。但是BYHWD治療SCI的最佳劑量范圍、周期以及何種化合物在抗氧化功效中發(fā)揮重要作用等方面還有待進一步的實驗探索[34]。

參考文獻

[1]Anwar MA，Al Shehabi TS，Eid AH.Inflammogenesis of secondary spinal cord injury[J].Front Cell Neurosci，2016，10：98.

[2]do Vale Ramos RC，Alegrete N.The role of pharmacotherapy in modifying the neurological status of patients with spinal and spinal cord injuries[J].Rev Bras Ortop，2015，50（6）：617-24.

[3]Jain NB，Ayers GD，Peterson EN，et al.Traumaticspinalcordinjury in the UnitedStates，1993-2012[J].JAMA，2015，313（22）：2236-2243.

[4]Ma L，Mu Y，Zhang Z，et al.Eugenol promotes functional recovery and alleviates inflammation，oxidative stress，and neural apoptosis in a rat model of spinal cord injury[J].Restor Neurol Neurosci，2018，36（5）：659-668.

[5]Ahuja CS，Martin AR，F(xiàn)ehlings M.Recent advances in managing a spinal cord injury secondary to trauma[J].F1000Res，2016，5：F1000 Faculty Rev-1017.

[6]Cerqueira SR，Oliveira JM，Silva NA，et al.Microglia response and in vivo therapeutic potential of methylprednisolone-loaded dendrimer nanoparticles in spinal cord injury[J].Small，2016，12（8）：972.

[7]Cong Y，Wang C，Wang J，et al.NT-3 promotes oligodendrocyte proliferation and nerve function recovery after spinal cord injury by inhibiting autophagy pathway[J].J Surg Res，2020，247：128-135.

[8]孫忠人，徐思禹，田洪昭，等.中藥及有效成分治療脊髓損傷的研究概況[J].中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（6）：3003-3006.

[9]Motaghinejad M，Motevalian M，F(xiàn)atima S，et al.The neuroprotective effect of curcumin against nicotine-induced neurotoxicity is mediated by CREB-BDNF signaling pathway[J].Neurochem Res，2017，42（10）：2921-2932.

[10]Feng H，Wang C，He W，et al.Roflumilast ameliorates cognitive impairment in APP/PS1 mice via cAMP/CREB/BDNF signaling and anti-neuroinflammatory effects[J].Metab Brain Dis，2019，34（2）：583-591.

[11]Chen F，Zhou CC，Yang Y，et al.GM1 ameliorates lead-induced cognitive deficits and brain damage through activating the SIRT1/CREB/BDNF pathway in the developing male rat hippocampus[J].Biol Trace Elem Res，2019，190（2）：425-436.

[12]吳萬豐，聶慧芳，胡立娟，等.補陽還五湯對缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群及其血漿代謝產(chǎn)物的影響[J].中草藥，2021，52（1）：118-128.

[13]Xian-Hui D，Xiao-Ping H，Wei-Juan G.Neuroprotective effects of the Buyang Huanwu decoction on functional recovery in rats following spinal cord injury[J].J Spinal Cord Med，2016，39（1）：85-92.

[14]Hu WJ，Zhang BT，Wu R.Comparison of bulbar conjunctival microcirculation in rabbits of five subtypes of blood stasis syndrome[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2013，33（9）：1261-1266.

[15]Liang H，Paxinos G，Watson C.The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse[J].Brain Struct Funct，2012，217（2）：221-232.

[16]García-Alías G，Truong K，Shah PK，et al.Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries[J].Exp Neurol，2015，266：112-119.

[17]齊英娜，譚明生，王延雷，等.補陽還五湯對大鼠急性上頸脊髓損傷后血小板活化因子的影響[J].中國骨傷，2018，31（2）：170-174.

[18]周彬，范瑜潔，聶穎，等.補陽還五湯聯(lián)合BMSCs移植對脊髓損傷氣虛血瘀證紅核神經(jīng)元的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，39（5）：568-572.

[19]王宏江，段曉娜，王鵬，等.游泳訓(xùn)練聯(lián)合補陽還五湯對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生抑制因子的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2017，39（3）：222-225.

[20]Guo ZP，Huang MN，Liu AQ，et al.Buyang Huanwu decoction up-regulates Notch1 gene expression in injured spinal cord[J].Neural Regen Res，2015，10（8）：1321-133.

[21]邵樂，夏相宜，王宇紅，等.補陽還五湯精簡方對氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，39（2）：163-167.

[22]孫忠人，徐思禹，李全，等.近5年中藥治療脊髓損傷相關(guān)機制研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（11）：132-135.

[23]肖玉煥，韓麗，李浩然，等.靈芝多糖防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進展[J].中草藥，2020，51（24）：6391-6395.

[24]Peng Y，Wang Y，Li J，et al.Utility of NSE，ProGRP and LDH in diagnosis and treatment in patients with small cell lung cancer[J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2016，19（9）：590-594.

[25]Sarkar C，Jones JW，Hegdekar N，et al.PLA2G4A/cPLA2-mediated lysosomal membrane damage leads to inhibition of autophagy and neurodegeneration after brain trauma[J].Autophagy，2020，16（3）：466-485.

[26]向芃，謝可煒，姜金星，等.蛋白激酶A部分通過環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號防止足細(xì)胞凋亡[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，36（1）：6-12.

[27]Tao H，Li X，Wei K，et al.Cyclic AMP prevents decrease of phosphorylated ezrin/radixin/moesin and chloride intracellular channel 5 expressions in injured podocytes[J].Clin Exp Nephrol，2015，19（6）：1000-1006.

[28]Khan IU，Yoon Y，Kim A，et al.Improved healing after the co-transplantation of HO-1 and BDNF overexpressed mesenchymal stem cells in the subacute spinal cord injury of dogs[J].Cell Transplant，2018，27（7）：1140-1153.

[29]Liu B，Li LL，Tan XD，et al.Gadd45b mediates axonal plasticity and subsequent functional recovery after experimental stroke in rats[J].Mol Neurobiol，2015，52（3）：1245-1256.

[30]Wang Y，Li W，Wang M，et al.Quercetin reduces neural tissue damage and promotes astrocyte activation after spinal cord injury in rats[J].J Cell Biochem，2018，119（2）：2298-2306.

[31]曾歡歡，黃英如，李子健，等.大黃素對大鼠急性脊髓損傷后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響研究[J].中國中藥雜志，2018，43（9）：1886-1893.

[32]Jing L，Wang JG，Zhang JZ，et al.Upregulation of ICAM-1 in diabetic rats after transient forebrain ischemia and reperfusion injury[J].J Inflamm（Lond），2014，11（1）：35.

[33]Abe Y，Honsho M，Kawaguchi R，et al.A peroxisome deficiency-induced reductive cytosol state up-regulates the brain-derived neurotrophic factor pathway[J].J Biol Chem，2020，295（16）：5321-5334.

[34]劉建春，張紅珍，郭文娟，等.補陽還五湯對自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠神經(jīng)保護作用的機制探討[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2019，25（14）：55-61.

（2020-11-25收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81302899）——基于cAMP/PKA/RhoA信號通路探討益氣活血法促進BMSCs移植修復(fù)脊髓損傷的機制;湖南省自然科學(xué)基金項目（2018JJ2289）——補陽還五湯介導(dǎo)鈣超載修復(fù)脊髓損傷的機制研究;湖南省自然科學(xué)基金項目（2019JJ80071）——基于紅核蛋白質(zhì)組學(xué)探討益氣活血法修復(fù)脊髓損傷的分子機制;湖南省自然科學(xué)基金項目（2019JJ50310）——基于mTOR通路探討益氣活血法對脊髓損傷大鼠紅核自噬的調(diào)節(jié)機制;湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金項目（2018ZYX01）——基于線粒體能量代謝異常探討益氣活血法挽救脊髓損傷凋亡細(xì)胞的機制

作者簡介：范婷婷（1994.06—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，E-mail：940071039@qq.com

通信作者：李亮（1980.02—），男，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，中醫(yī)情志病基礎(chǔ)研究，E-mail：superliliang@126.com