基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討桃紅四物湯治療類風濕關節(jié)炎的作用機制

趙晶晶　鄭福增　周子朋　張安琪　郭嘉

摘要 目的：運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討桃紅四物湯治療類風濕關節(jié)炎的作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。方法：運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索桃紅四物湯的有效成分及作用靶點，通過GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank數(shù)據(jù)庫收集疾病相關靶點。運用Cytoscape 3.6.1軟件構建“化合物-靶點”網(wǎng)絡，借助STRING平臺構建交集靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡，并使用Cytoscape對網(wǎng)絡進行拓撲分析，獲取核心基因，通過R語言進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，最后將核心基因與主要活性成分進行分子對接驗證。結果：TCMSP檢索得到桃紅四物湯治療RA的有效成分41個，對應靶點154個;拓撲分析得到AKT1、JUN、TP53、MMP9、MAPK14等10個核心基因。GO富集分析共涉及生物過程（BP）2 316個，細胞組分（CC）75個，分子功能（MF）205個，KEGG通路富集分析篩選得到158條與RA相關通路，主要涉及P13K-AKT、白細胞介素17、腫瘤壞死因子等信號通路，集中調(diào)控炎癥、血管翳形成、細胞增殖與凋亡等。分子對接結果表明，主要活性化合物能夠分別與核心靶點結合，并展現(xiàn)出較好的親和力。結論：本研究對桃紅四物湯治療RA的多成分、多靶點、多通路的作用與機制進行初步探討，可為后續(xù)基礎研究提供參考，為臨床應用提供理論依據(jù)。

關鍵詞 類風濕關節(jié)炎;桃紅四物湯;網(wǎng)絡藥理學;分子對接

Study on the Mechanism of Taohong Siwu Decoction in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jingjing1， ZHENG Fuzeng2， ZHOU Zipeng2， ZHANG Anqi1， GUO Jia1

（1 Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China; 2 Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of action of Taohong Siwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis by using network pharmacology and molecular docking technology， so as to provide theoretical basis for clinical application.Methods：TCMSP was used to retrieve the effective components and targets of Taohong Siwu Decoction， and disease-related targets were collected from GeneCards， OMIM， TTD， PharmGkb and DrugBank databases.Cytoscape 3.6.1 track software was used to build “compound-targets” network.With the help of the STRING intersection target protein interaction network， and Cytoscape was used for network topology analysis， and the core genes was obtained.By R language， GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis were conducted.Finally， molecular docking verification of core genes and main active ingredients performed molecular docking verification.Results：It was predicted that there were 41 active components and 154 corresponding targets in the treatment of RA by Taohong Siwu Decoction.Topological analysis revealed AKT1， JUN， TP53， MMP9， MAPK14 and other 10 core genes.GO enrichment analysis involved biological process（BP） 2 316， 75 cell components（CC）， molecular function（MF） 205， KEGG pathway enrichment analysis filter to get 158 RA related pathways， mainly involving P13K-AKT， interleukin 17， tumor necrosis factor signaling pathways and other pathway， such as centralized control inflammation， pannus formation， cell proliferation and apoptosis， etc.The results of molecular docking showed that the main active compounds can bind to the core targets respectively and exhibit good affinity.Conclusion：In this study， the effect and mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of RA with multiple components， multiple targets and multiple pathways were preliminarily discussed， so as to provide reference for subsequent basic research and theoretical basis for clinical application.

Keywords Rheumatoid arthritis;Taohong? Siwu Decoction;Network Pharmacology; Molecular Docking

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.004

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以滑膜增生和炎癥為特征的自身免疫性疾病，可發(fā)病于任何年齡段[1]。RA在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率在0.5%～1%之間，是成人最常見的慢性炎癥疾病之一[2]。RA不僅導致患者身體功能和生命質量下降，而且給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[3]。因此，如何更有效地控制RA并延緩其發(fā)展成為醫(yī)學研究的熱點。

中醫(yī)藥在治療RA有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗。研究表明，中醫(yī)藥能有效緩解疼痛、消除腫脹、改善功能障礙、減輕骨侵蝕、提高生命質量等，在治療RA方面起重要作用[4]。桃紅四物湯源于《醫(yī)宗金鑒》，該方以強勁的破血之品桃仁、紅花為主，力主活血化瘀，輔以四物湯養(yǎng)血活血。藥理研究顯示桃紅四物湯具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進骨折愈合等作用，臨床治療RA療效顯著[5-7]。然而桃紅四物湯治療RA的藥理學機制尚不明確。本研究基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接方法，全面闡釋桃紅四物湯治療RA的主要活性成分、潛在靶標和關鍵通路，為臨床用藥和基礎研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點篩選 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索桃紅四物湯（桃仁、紅花、當歸、川芎、芍藥、熟地黃）有效活性成分及其對應靶點，篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Like，DL）≥0.18。并通過人類蛋白質數(shù)據(jù)庫（UniProt Database，https：//www.uniprot.org/）將靶基因名稱規(guī)范為官網(wǎng)名稱。

1.2 疾病相關靶點 以“Rheumatoid Arthritis”為檢索詞，應用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//genealacart.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www.omim.org/）、治療靶標數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//http：//db.idrblab.net/ttd/）、藥物基因組學知識庫（PharmGkb，https：//www.pharmgkb.org/）、藥物和疾病數(shù)據(jù)庫（DrugBank，https：//go.drugbank.com/）進行檢索，獲得RA相關靶點。

1.3 藥物與疾病交集靶點篩選及“化合物-靶點”網(wǎng)絡構建 利用R語言將化合物潛在靶點與疾病靶點取交集，獲得桃紅四物湯治療RA的交集靶點。由Cytoscape3.6.1繪制“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，節(jié)點（Node）代表有效活性成分或靶點、邊（Edge）代表節(jié)點間的相互關系。本研究通過自由度（Degree）的大小來分析網(wǎng)絡中的節(jié)點，節(jié)點的自由度值越大，則其在網(wǎng)絡中的地位越重要，說明其參與的生物功能越多，生物學重要性越強[8]。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建和核心靶標篩選 將交集基因上傳至STRING平臺（https：//string/db.org/）構建共同靶點PPI網(wǎng)絡，選擇“Multiple Proteins”模式，蛋白種屬設為“Home Sapiens”，最小互作分數(shù)值為0.9，其他參數(shù)保持默認，獲得PPI網(wǎng)絡，構建PPI網(wǎng)絡模型。然后將所得文件導入Cytoscape 3.6.1，利用插件CytoNCA計算每個節(jié)點的打分，篩選打分較高的節(jié)點再次構建網(wǎng)絡，從而得出PPI網(wǎng)絡中核心基因。

1.5 GO和KEGG富集分析 將交集靶點導入R語言，進行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析由生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3個部分組成。以P<0.05作為篩選標準，并對富集分析結果進行可視化處理。

1.6 主要活性成分-靶點分子對接 為驗證篩選出的桃紅四物湯治療RA的可能關鍵靶點的準確性，將調(diào)控網(wǎng)絡度值靠前的活性成分與PPI網(wǎng)絡拓撲得到的核心的靶點進行分子對接。在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載核心靶點蛋白結構;在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載化合物結構。使用Autodock Vina軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 桃紅四物湯有效成分及靶點 篩選得到61個有效成分，其中川芎7個，當歸2個，紅花22個，芍藥13個，生地黃2個，桃仁23個，共同8個。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中找到對應基因名的靶點有208個。

2.2 桃紅四物湯治療RA作用靶點預測 通過檢索GeneCards、OMIM、TTD、Pharmgkb、DrugBank數(shù)據(jù)庫刪除重復值后得到4 614個疾病相關靶點。利用R語言得到桃紅四物湯治療RA的潛在基因154個。見圖1。

2.3 “化合物-靶點”網(wǎng)絡分析 利用Cytoscape 3.6.1軟件構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡。見圖2。正方形代表化合物，其中綠色代表桃仁，紅色代表川芎，深藍色代表紅花，淺藍色代表當歸，青色代表芍藥，紫色代表熟地黃，黃色代表桃紅四物湯治療RA的靶點。分析網(wǎng)絡可知，該圖包括195節(jié)點和374條邊。Degree較高的化合物分別是槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、黃芩素（Baicalein）、胡蘿卜素（Carotene）、谷固醇（Beta-Sitosterol）等。

2.4 PPI網(wǎng)絡構建和核心靶點篩選 將篩選得到的桃紅四物湯治療RA的154個基因上傳至String數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，并保存CSV文件。見圖3。將CSV文件導入Cytoscape3.6.1軟件并利用CytoNCA插件進行拓撲分析，篩選得到的基因有AKT1、JUN、TP53、MAPK14、MMP9等。見圖4。

2.5 生物過程和通路富集分析 通過R語言對交集靶點進行GO和KEGG富集分析，分析發(fā)現(xiàn)，GO富集分析主要涉及氧化反應、對脂多糖等2 316條生物過程，膜筏、膜微結構域等75條細胞組分，DNA-結合轉錄激活因子活性、血紅素結合等205條分子功能;KEGG通路富集分析共涉及158條目，主要包括PI3K-AKT信號通路、乙型肝炎信號通路、前列腺癌信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路。并根據(jù)靶點數(shù)及P值分別篩選前30條目繪制氣泡圖。見圖5。氣泡圖中顏色深淺代表P值的大小，顏色越深，P值越小，相關性越大。氣泡的大小代表富集條目的靶點數(shù)目，氣泡越大說明對應的靶點越多。并根據(jù)排名找到這些靶點最關鍵的PI3K/AKT信號通路，同時用紅色表示藥物靶點在該信號通路上具體作用點。見圖6。

2.6 分子對接驗證結果 將“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖中度值前3的活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚與拓撲分析得到的關鍵靶點AKT、JUN、MAPK14對接，對接得分表1。利用Pymol軟件對結果進行輸出優(yōu)化。見圖7。最低結合能越低，靶蛋白與活性成分之間結合活性度越高，說明二者之間結合能力越好[9]。結果表明靶蛋白與主要有效成分具有較強的結合能。

3 討論

RA屬于中醫(yī)“痹癥”“尪痹”“歷節(jié)”等范疇。該病是由于機體正氣虛弱、衛(wèi)外不固、邪氣入侵，導致經(jīng)絡痹阻不通、氣血瘀滯，從而出現(xiàn)關節(jié)腫脹疼痛、畸形、活動受限等臨床表現(xiàn)的一類病癥。多數(shù)醫(yī)家認為瘀血既是RA的重要病因之一，又是重要的病理產(chǎn)物之一，強調(diào)活血化瘀法在類風濕關節(jié)炎的治療中十分重要[10]。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證實，活血化瘀法可改善毛細血管通透性，減少炎癥滲出，改善血液循環(huán)，促進炎癥吸收，紅四物湯以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、行氣，臨床用于治療類風濕關節(jié)炎療效顯著[6，11]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的科學技術，對桃紅四物湯治療RA的機制進行研究，發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯有效成分通過減輕炎癥、抗氧化、抑制破骨細胞活性等途徑發(fā)揮治療RA作用。通過分析得到最主要的活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、胡蘿卜素、谷固醇、楊梅酮、豆固醇等。大量研究表明，槲皮素不僅可以通過抑制免疫細胞分泌炎癥介質（IFNg、TNF-α、IL-2等），還可通過抑制與核因子κB相關的基因表達來抑制炎癥介質的分泌[12]。Lou等[13]研究證實木犀草素具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的活性作用，并且木犀草素還能影響滑膜成纖維細胞的增殖和功能，下調(diào)降解酶活性，影響金屬蛋白酶和細胞因子的表達，從而發(fā)揮治療RA作用。Lee等[14]通過實驗發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導的關節(jié)炎小鼠中，與對照組比較，山柰酚給藥減輕了關節(jié)炎的發(fā)病頻率和嚴重程度，證實山柰酚在體外和體內(nèi)降低了破骨細胞化，并與破骨細胞標志物的抑制有關。

本研究根據(jù)核心靶點屬性參數(shù)，結合GO和KEGG分析，可知桃紅四物湯治療RA主要涉及AKT1、JUN、TP53、MAPK14等核心靶點，P13K-AKT、流體剪應力與動脈粥樣硬化、AGEs/RAGE、乙型肝炎等信號通路調(diào)控RA。PI3K是一種參與細胞生長及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，活化后可導致脂質底物磷酸化并激活下游AKT，通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Caspase3、核因子κB、mTOR等，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡與代謝過程[15-16]。許多研究表明，PI3K-AKT信號通路作為細胞內(nèi)主要的信號傳導途徑之一，廣泛存在于滑膜中，與RA-FLS的活化、黏附、血管生成和基質降解密切相關[17]。PI3K-AKT信號通路是RA發(fā)生發(fā)展中的重要因素，PI3K蛋白家族可被多種細胞因子激活，在細胞分化、代謝、炎癥、細胞活力和誘發(fā)癌癥發(fā)揮重要作用[18]。

有實驗證實JUN蛋白在RA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，在膠原誘導的小鼠關節(jié)炎模型中，使用一種新的抑制劑抑制滑膜成纖維細胞中JUN的表達，可減輕小鼠骨侵蝕癥狀[19]。VEGF是RA病理性血管新生的重要誘導劑，導致血管新生，形成血管翳，引起骨、軟骨和關節(jié)的破壞[20]。

陳英等[21]研究發(fā)現(xiàn)RA并發(fā)動脈粥樣硬化患者中炎癥介質TNF-α、IL-6、IL-17明顯升高。它們參與內(nèi)皮細胞活化，是RA滑膜組織中形成血管翳的關鍵步驟，也是動脈粥樣硬化性CVD的發(fā)病機制，內(nèi)皮活化誘導細胞表達趨化因子和黏附分子，使白細胞遷移到關節(jié)腔或血管內(nèi)膜，進一步促進中性粒細胞活化，從而導致局部炎癥形成和發(fā)展[22-23]。

通過分子對接可以看到配體和受體的結合能均≤-6 kcal/mol，結合位點均有穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵，構象穩(wěn)定，對接最穩(wěn)定的是槲皮素、木犀草素與AKT1的結合（-9.8 kcal/mol）。分子對接結果表明桃紅四物湯活性成分與受體蛋白穩(wěn)定結合，起到治療RA的作用。

綜上所述，桃紅四物湯治療RA具有多靶點、多途徑、多通路的特點，本研究不僅為臨床應用治療提供了科學依據(jù)，而且為探索新的治療方法提供了思路。

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（2020-11-06收稿 責任編輯：魏慶雙 徐穎）

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（81804050）;2018年度河南省中醫(yī)藥科學研究重點課題（2018ZY1011）

作者簡介：趙晶晶（1995.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥防治風濕病，E-mail：zjj951108@163.com

通信作者：鄭福增（1962.09—），男，學士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治風濕病，E-mail：zhengfuzengyx@126.com