加味椒艾丸貼敷神闕穴對輪狀病毒腹瀉小鼠NOD1/NF-κB信號通路的影響

肖瑤 劉百祥 封迎帥 余闐 吳海金 袁利群

〔摘要〕 目的 觀察加味椒艾丸貼敷神闕穴對輪狀病毒腹瀉小鼠NOD1/NF-κB信號通路的影響，探討其干預(yù)輪狀病毒感染性腹瀉的機(jī)制。方法 將40只SPF級ICR乳鼠中的10只分為正常對照組，其余30只采用猴輪狀病毒SA11株懸液灌胃造模2 d，造模成功后隨機(jī)分為模型組、丁桂貼組、加味椒艾丸組，每組10只。藥物干預(yù)敷貼連續(xù)5 d，末次給藥并禁食12 h后取材。收集各組小鼠糞便進(jìn)行糞便評分;ELISA檢測各組血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量;Western blot檢測各組小鼠小腸組織p65、NF-κB蛋白表達(dá);HE染色觀察各組小鼠腸組織病理形態(tài)。結(jié)果 （1）與正常對照組比較，模型組小鼠糞便評分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組和加味椒艾丸組糞便評分明顯降低（P<0.05）。（2）與正常對照組比較，模型組血清中TNF-α、Caspase-1含量明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組及加味椒艾丸組TNF-α、Caspase-1含量明顯下降（P<0.05，P<0.01）;與加味椒艾丸組比較，丁桂貼組Caspase-1含量明顯降低（P<0.01）。（3）與正常對照組比較，模型組p65、NF-κB蛋白表達(dá)升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組、加味椒艾丸組p65、NF-κB蛋白表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）。（4）正常對照組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮未見異常;模型組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮變性壞死，部分黏膜上皮缺失，且伴有不同程度的黏膜層血管擴(kuò)張;丁桂貼組和加味椒艾丸組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮部分缺失，黏膜層血管少量擴(kuò)張。結(jié)論 加味椒艾丸貼敷神闕穴能改善輪狀病毒腹瀉癥狀，可能通過降低血清中TNF-α、Caspase-1含量及小腸組織中p65、NF-κB蛋白表達(dá)來調(diào)控NOD1/NF-κB信號通路。

〔關(guān)鍵詞〕 輪狀病毒腹瀉;加味椒艾丸;神闕穴;敷貼;NOD1/NF-κB信號通路;糞便評分

〔中圖分類號〕R256.34 ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.012

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Jiawei Jiaoai Pills applied to Shenque （RN8） acupoint on NOD1/NF-κB signalling pathway of rotavirus diarrhea rats， and to explore the mechanism in treating rotavirus diarrhea. Methods The 10 of 40 SPF neonatal rat randomly selected as the control group， the remaining 30 rats by gastric perfusion of suspension of simian rotavirus SA11 strain for two days to establishment of rotavirus diarrhea rat model， which rats were randomly divided into the model group， Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group， with 10 rats in each group. The drug intervention application continued for 5 days. The samples were taken from the 12 hours after the last acupoint application. The feces of mice in each group were collected for diarrhea score; the content of serum TNF-α， IL-1β， Caspase-1 was detected by ELISA; the expression levels of p65， NF-κB were analyzed by Western blot; HE staining was used to observe the pathological morphology of intestinal tissues in each group. Results （1） Compared with the control group， faeces score of model group was significantly increased （P<0.01）; compared with the model group， faeces score was obvious decreased in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05）. （2） Compared with the contorl group， the levels of serum TNF-α， Caspase-1 were significantly reduced in model group （P<0.01）; compared with the model group， the levels of serum TNF-α， Caspase-1 were obvious decline in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05， P<0.01）; compared with Jiawei Jiaoai Pills group， the level of Caspase-1 was declined in the Dinggui application group （P<0.01）. （3） Compared with the control group， the expression levels of p65， NF-κB were higher in model group （P<0.01）; compared with the model group， the expression levels of p65， NF-κB were declined in the Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group （P<0.05， P<0.01）. （4） There was no abnormality in the ileum and colon mucosal epithelium in the control group， while the ileum and colon mucosal epithelium in the model group was degenerated and necrotic， with partial loss of mucosal epithelium and accompanied by different degrees of vascular dilatation in the mucosal layer. Mucosal epithelium of ileum and colon in Dinggui application group and Jiawei Jiaoai Pills group were partially absent， and blood vessels of mucosal layer were slightly dilated. Conclusion Jiawei Jiaoai Pills applied to Shenque （RN8） acupoint can improve the diarrhea symptoms of rotavirus diarrhea of rats， and regulate NOD1/NF-κB signaling pathway by down regulating the protein expression of serum TNF-α， Caspase-1 and intestinal tissue p65， NF-κB.

〔Keywords〕 rotavirus diarrhea; Jiawei Jiaoai Pills; Shenque （RN8） acupoint; NOD1/NF-κB signaling pathway; faeces score

輪狀病毒（rotavirus， RV）是全球嬰幼兒腹瀉最常見的病原體，是兒童腹瀉的主要原因，尤其是3歲以下兒童發(fā)病率較高[1-2]。RV感染的急性腹瀉嬰幼兒會伴有明顯腸道菌群失衡、血清炎癥因子水平升高現(xiàn)象，其發(fā)病主要原因是自身免疫功能降低，病原微生物入侵，導(dǎo)致炎癥感染，RV感染性腸炎在一定程度上會導(dǎo)致呼吸、心肌及神經(jīng)系統(tǒng)損害[3-4]。目前，對于RV腹瀉并無特效藥物，近年來，研究[5-6]表明，中醫(yī)藥在治療腹瀉方面具有一定的臨床療效。治療RV腹瀉的早期臨床研究[7-8]表明，加味椒艾丸穴位貼敷涌泉穴或神闕穴治療嬰幼兒RV腹瀉較貼臍療效更優(yōu)，能縮短病程，并且在治療嬰幼兒急性腹瀉的臨床療效優(yōu)于單純西醫(yī)治療。但加味椒艾丸穴位貼敷治療RV腹瀉具體作用機(jī)制尚不明確，本次動物實(shí)驗(yàn)通過研究加味椒艾丸貼敷神闕穴對RV腹瀉小鼠的NOD1/NF-κB信號通路的影響，從分子生物學(xué)水平闡明加味椒艾丸貼敷治療RV腹瀉的作用機(jī)制，為臨床治療RV腹瀉提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 ?動物

SPF級ICR乳鼠40只，鼠齡9～10 d，體質(zhì)量（7.9±0.4） g，動物倫理審批號：2020（3）009，許可證號：SYXK（湘）2020-0015。實(shí)驗(yàn)前所有乳鼠糞便予RV抗原快速檢測試劑檢測結(jié)果為陰性，乳鼠由湖南省人民醫(yī)院臨床研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 ?RV毒種及增殖

感染病毒為猴RV細(xì)胞系（RV SA11株），由湖南省人民醫(yī)院臨床研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。羅猴胎腎細(xì)胞MA104細(xì)胞系用于病毒增殖（批號：HZ-CC100930，武漢華美生物工程有限公司）

1.3 ?藥物

加味椒艾丸藥物組成：川椒、干姜、赤石脂、烏梅、熟艾、黃連、黃芩、檳榔，均由藥劑專業(yè)人員專門采購，以上8味藥各3 g等比配伍，研磨成粉備用，用醋調(diào)勻成糊狀封存，使用時制成直徑0.5 cm×0.5 cm，質(zhì)量約0.5 g的藥帖，置于醫(yī)用膠布上備用[9]。加味椒艾丸（湖南振興中藥有限公司），丁桂兒臍貼1.6 g/貼（批號：2002901A，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。

1.4 ?主要試劑

小鼠RV抗原ELISA試劑盒（批號：CSB-EQ027718MO）、Caspase-1 ELISA試劑盒（批號：CSB-EL004543MO）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：CSB-E04741m）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒（批號：CSB-E08054m）均購自武漢華美生物工程有限公司;A群RV抗原檢測試劑盒[批號：2020101285，英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司];兔抗NF-κB1多克隆抗體（批號：13586，美國CST公司）;p65[批號：sc-8008，圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司]。

1.5 ?主要儀器

352型酶標(biāo)儀、AC8型洗板機(jī)均購自上海雷勃生物技術(shù)有限公司;TG16W型微量高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;PP-1105型電泳儀（北京凱元信瑞儀器有限公司）;TGL-16c型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;TGL-16型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;L4158型掃描儀[愛普生（中國）有限公司]。

2 方法

2.1 ?模型的建立

40只SPF級ICR乳鼠實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只設(shè)為正常對照組，其余30只小鼠進(jìn)行造模，采用經(jīng)口灌服（自然吸允法）法，用微量加樣器將猴RV SA11株懸液50 μL/d經(jīng)乳鼠口灌服，1次/d，連續(xù)2 d[9]。分別單籠飼養(yǎng)，第3天收集造模組小鼠糞便，用無菌棉拭子采集糞便于無菌試管中，用RV抗原快速檢測試劑檢測，結(jié)果呈陽性表明RV腹瀉模型造模成功。

2.2 ?分組及給藥

模型建立后按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、加味椒艾丸組、丁桂貼組3組，每組10只。正常對照組與模型組分別用淀粉調(diào)糊敷貼神闕穴，藥物干預(yù)組分別用加味椒艾丸、丁桂兒臍貼敷貼神闕穴，1次/d，敷貼時間12 h，連續(xù)5 d。

2.3 ?穴位定位

參照“十五”國家規(guī)范統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》實(shí)驗(yàn)動物鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位及擬人對照點(diǎn)法定位[10]。神闕穴：根據(jù)類比原理，按人體該穴的體表穴位法，取小鼠胸腹正中，胸骨柄上緣至外生殖器連線上3/4與下1/4交界點(diǎn)。

2.4 ?觀察指標(biāo)

2.4.1 ?糞便觀察 ?基于糞便的顏色、形態(tài)對糞便進(jìn)行評分[11-12]，1分：正常大便;2分：淡黃色軟便;3分：淡黃色稀便;4分：水樣便。分值≥2分為腹瀉，無法獲得糞便的乳鼠視為無腹瀉。

2.4.2 ?ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量 ?末次給藥后，禁食禁飲12 h，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，以摘眼球取血法收集血樣，ELISA檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1的水平。具體檢測方法參照試劑盒提供的流程標(biāo)準(zhǔn)操作。

2.4.3 ?Western blot檢測腸組織中p65、NF-κB蛋白表達(dá) ?將胃幽門下端到盲腸前端的腸組織沖洗，取1/3腸組織用PBS緩沖液漂洗2～3次，勻漿后加入蛋白提取試劑。刮下細(xì)胞使其充分裂解，30 min后收集上清液，取一部分使用BCA法測定蛋白濃度。剩余部分變性后于-20 ℃保存，按照說明書配制10%的丙烯酰胺凝膠，電泳30 min、轉(zhuǎn)膜150 min，封閉1 h，一抗稀釋液4 ℃搖床過夜，用TBST洗3次，二抗室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次后顯影成像。

2.4.4 ?HE染色觀察腸組織病理改變 ?對剩余的2/3結(jié)腸與回腸組織進(jìn)行脫水、浸蠟，并且包埋、切片后，再用HE染色對切片進(jìn)行染色，鏡下觀察組織病理形態(tài)變化。

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件整理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用“x±s”表示，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性者用多因素方差分析，兩兩比較用LDS檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性用Dunnett T3檢驗(yàn)。否則用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組小鼠糞便評分比較

與正常對照組比較，模型組小鼠糞便評分明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組及加味椒艾丸組評分明顯下降（P<0.05）;丁桂貼組與加味椒艾丸組評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

3.2 ?各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、Caspase-1含量比較

各組小鼠IL-1β組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與正常對照組比較，模型組小鼠TNF-α、Caspase-1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組與加味椒艾丸組TNF-α、Caspase-1表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）;與加味椒艾丸組比較，丁桂貼組Caspase-1含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。

3.3 ?各組小鼠小腸p65、NF-κB蛋白表達(dá)比較

與正常對照組比較，模型組p65、NF-κB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，丁桂貼組與加味椒艾丸組p65、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與丁桂貼組比較，加味椒艾丸組p65、NF-κB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3.4 ?各組小鼠腸組織HE染色結(jié)果

正常對照組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮未見異常;模型組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮變性壞死，部分黏膜上皮缺失，且伴有不同程度的黏膜層血管擴(kuò)張;丁桂貼組和加味椒艾丸組小鼠回腸和結(jié)腸黏膜上皮部分缺失，黏膜層血管少量擴(kuò)張。見圖4。

4 討論

RV腹瀉屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，其發(fā)病多與感受外邪，內(nèi)傷脾胃有關(guān)。而小兒臟腑多嬌嫩，感受外邪易傷脾胃，導(dǎo)致泄瀉。神闕穴屬于任脈之穴位，《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》載錄神闕穴能“治泄利不止”，此亦RV腹瀉最為常見與最主要的臨床癥狀。現(xiàn)代解剖學(xué)證實(shí)，神闕穴[13]周圍血運(yùn)豐富，具有豐富的靜脈網(wǎng)，且該處皮膚較薄，有利于藥物滲透吸收。前期研究[8]顯示，加味椒艾丸具有燥濕運(yùn)脾、導(dǎo)滯清痢之功，運(yùn)用該藥貼敷神闕穴有利于藥物直達(dá)病所，增強(qiáng)療效。

RV腹瀉與相關(guān)炎癥因子破壞腸上皮機(jī)械屏障有關(guān)，如TNF-α、IL-6炎癥因子啟動炎癥反應(yīng)并形成級聯(lián)效應(yīng)損傷腸黏膜導(dǎo)致腸內(nèi)感染[14]。NF-κB信號通路誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因主要有TNF-α、IL如IL-1、IL-6及IL-8等，而NF-κB信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要與Caspase的激活有關(guān)[15]。在疾病的病理進(jìn)程中，病毒感染后腸組織細(xì)胞在相關(guān)因子的作用下激活NF-κB 信號通路，腸上皮細(xì)胞中過度的炎癥小體激活足以導(dǎo)致腹瀉和病理改變[16]。RV腹瀉可能的病理機(jī)制與腸道炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)，如RV感染性腹瀉患者在早期的血清檢測中IFN-γ、IL-6、TGF-β等炎癥因子水平較正常者升高[17-18]。在Caspase家族中，Caspase-1蛋白具有對IL前體的活化作用，參與細(xì)胞凋亡，同樣NOD蛋白活化NF-κB也會介導(dǎo)炎癥發(fā)生[19]。如NOD樣受體家族中含有吡啶結(jié)構(gòu)域-3（NLRP3）的炎性小體通過Caspase-1的切割和隨后的IL-1β和IL-18的激活和分泌負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)的激活[20]。在NOD1信號通路中，泛素化在信號級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可導(dǎo)致NF-κB的亞基p65、p50的核易位，NOD蛋白可介導(dǎo)激活NF-κB，通過NF-κB相關(guān)信號通路介導(dǎo)下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)口灌猴RV造模的小鼠血清TNF-α、Caspase-1含量明顯升高（P<0.01）;在腸組織蛋白表達(dá)檢測中，p65、NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），表明腸RV感染可導(dǎo)致NOD1/NF-κB信號通路激活，導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子釋放入血，引起腸組織黏膜層血管擴(kuò)張，并出現(xiàn)回腸和結(jié)腸黏膜上皮變性壞死等病理改變。經(jīng)加味椒艾丸貼敷干預(yù)后，小鼠血清中TNF-α、Caspase-1含量明顯下降（P<0.05， P<0.01），p65、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05， P<0.01），提示加味椒艾丸敷貼神闕穴通過NOD1/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，對治療RV感染性腹瀉小鼠的可能作用機(jī)制是抑制炎癥相關(guān)的TNF-α、Caspase-1因子及NF-κB蛋白的表達(dá)，起到緩解腸道炎癥作用，從而改善腹瀉癥狀及腸組織病理。然而NOD1/NF-κB信號通路尚有諸多分子，且加味椒艾丸敷貼神闕穴治療RV腹瀉對相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控作用機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

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