TrxR抑制劑AA1激活抗腫瘤免疫抑制胃癌進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

范有壽 邱志勝 趙亞萍 （金昌市第一人民醫(yī)院外一科，金昌737100）

胃癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球第四大常見惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移率、發(fā)病率和死亡率較高［1］。我國(guó)每年胃癌患者死亡人數(shù)高達(dá)49.8萬，病死率位居所有惡性腫瘤第三［2-3］。胃癌早期發(fā)病特征不明顯，多數(shù)到醫(yī)院治療的患者已是中晚期，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)［4］。因此，胃癌防控是急需解決的熱點(diǎn)問題。

硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是存在于細(xì)胞中的含硒同型二聚體黃素酶，其主要功能為調(diào)節(jié)氧化還原平衡，與細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成密切相關(guān)［5］。氯（三乙基膦）金（Ⅰ）［Chloro（triethylphosphine）gold（Ⅰ），AA1］是一種TrxR 抑制劑，屬于含金的烷基試劑，其作用原理與順鉑類似，最終導(dǎo)致DNA 損傷促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6-7］。研究顯示，AA1 對(duì) TrxR 的抑制作用較強(qiáng)，通過抑制TrxR 活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。但AA1 激活抗腫瘤免疫抑制胃癌進(jìn)展的作用及機(jī)制未見報(bào)道。本研究擬構(gòu)建荷瘤小鼠胃癌模型，觀察TrxR 抑制劑AA1 對(duì)胃癌腫瘤及小鼠免疫功能相關(guān)生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 鼠源胃癌MFC 細(xì)胞株購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。將鼠源胃癌MFC 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)，顯微鏡下觀察，長(zhǎng)成單層細(xì)胞時(shí)傳代。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠，雄性，4 周齡，體重（20.0±2.0）g，購(gòu)自浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)：SCXK（浙）2015-0033。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hy?clone 公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）試劑盒（英國(guó)Abcam 公司）；小鼠CD4+-APC、CD8+-PE流式試劑盒、淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD eBioscience 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；兔抗鼠c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體、羊抗兔二抗（美國(guó)Cell signaling公司）。

1.1.4 儀器 FA1004N 電子天平（上海民橋精密儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific公司，美國(guó)）；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；FCM 凝膠成像系統(tǒng)（Protein Sim?ple 公司，美國(guó)）；Bio-Rad 電泳儀、Attune NxT 流式細(xì)胞儀（Thermo Fisher公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 20 只SPF 級(jí) C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、AA1 組（實(shí)驗(yàn)組），每組10 只。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)［8-9］構(gòu)建荷瘤小鼠模型（注射給予鼠源胃癌MFC 細(xì)胞），造模后第7 天，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，>100 mm3為建模成功。給予AA1治療（25 mg/kg），每隔2 d 重復(fù)給藥1 次，共7 次，對(duì)照組給予等體積PBS。從給藥開始第1 天，每天測(cè)量腫瘤體積，給藥7 次后（第13 天）剝離腫瘤組織，觀察腫瘤形態(tài)并記錄腫瘤質(zhì)量。

1.2.2 MDA、SOD 含量測(cè)定 末次給藥后，采集荷瘤小鼠外周血，采用ELISA 法檢測(cè)2 組小鼠外周血中MDA、SOD含量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD8+細(xì)胞水平和NK細(xì)胞數(shù) 荷瘤小鼠取眼球外周血，加入荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離，分別加入APC anti-CD4、PE an?ti-CD8 和 PE anti-NK cell 抗體，混勻，40℃ 避光孵育30 min，標(biāo)記細(xì)胞表面抗原CD4、CD8、NK細(xì)胞染色，離心5 min，棄上清，加入PBS 1.5 ml混勻，重復(fù)離心5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS 重懸，置于離心管，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分別比較2 組外周血CD4+、CD8+細(xì)胞水平及NK細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Western blot 檢 測(cè) JNK 及 p-JNK 蛋白水平 取腫瘤組織液氮中研碎，加入RIPA 裂解液（1∶10），BCA 試劑盒測(cè)定腫瘤組織總蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，TBST 洗滌液漂洗3~4 次。加入一抗，4℃ 孵育過夜，漂洗3~4 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗3~4 次，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物ECL 工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白顯影圖進(jìn)行灰度分析，分別考察2 組荷瘤小鼠腫瘤組織中JNK、p-JNK蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)AA1 治療抑制胃癌進(jìn)展 以AA1 治療第1 天為起點(diǎn)，治療期間測(cè)量2 組小鼠腫瘤體積，AA1組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P<0.05，圖1A），治療后第13 天處死小鼠，剝離腫瘤組織（圖1B），測(cè)量2組腫瘤質(zhì)量，AA1組腫瘤質(zhì)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05，圖1C）。

圖1 AA1對(duì)荷瘤小鼠胃癌進(jìn)展的影響Fig.1 Effect of AA1 on progress of gastric cancer in tu?mor-bearing mice

2.2 AA1 治療對(duì)MDA、SOD 表達(dá)的影響 取荷瘤小鼠外周血，檢測(cè)MDA、SOD含量，AA1組小鼠MDA含量明顯低于對(duì)照組，SOD 含量明顯高于對(duì)照組（P<0.05，圖2）。

圖2 AA1對(duì)MDA、SOD表達(dá)的影響Fig.2 Effect of AA1 on expressions of MDA and SOD

2.3 AA1 對(duì)外周血 CD8+、CD4+、NK 細(xì)胞數(shù)的影響 如表1、圖3所示，取荷瘤小鼠眼球外周血，檢測(cè)外周血 CD4+、CD8+、NK 細(xì)胞數(shù)，AA1 組小鼠外周血CD4+、NK 細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組，而CD8+細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。

表1 AA1對(duì)CD8+、CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)的影響（，%）Tab.1 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+and NK cells（，%）

表1 AA1對(duì)CD8+、CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)的影響（，%）Tab.1 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+and NK cells（，%）

Note：Compared with Control group，1）P＜0.05.

AA1 23.91±1.041）16.34±1.231）16.08±0.711）Groups CD4+CD8+NK Control 14.18±0.95 21.34±1.12 9.48±0.57

圖3 AA1對(duì)CD8+、CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)的影響Fig.3 Effect of AA1 on expressions of CD8+，CD4+ and NK cells

2.4 AA1 對(duì)JNK 通路的影響 2 組小鼠腫瘤組織中JNK 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），AA1組p-JNK表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05，圖4）。

圖4 2組JNK及p-JNK蛋白表達(dá)比較Fig.4 Comparison of JNK and p-JNK proteins expres?sions between two groups

3 討論

TrxR 為存在于細(xì)胞中的含硒同型二聚體黃素酶，具有抗氧化防御、細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成等作用，有望成為藥物的潛在治療靶點(diǎn)［5，10］。譚強(qiáng)等［11］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌小鼠 TrxR 活性與腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān)。雷虹［7］給予肝癌患者TrxR抑制劑AA1 治療，抗腫瘤活性較好。TrxR 對(duì)亞硫氰酸的選擇性代謝可促進(jìn)肺天然免疫和抗氧化防御［12］。本研究采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TrxR 抑制劑AA1 對(duì)胃癌荷瘤小鼠的抗癌作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)果顯示，AA1 組小鼠腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，腫瘤組織明顯減小，腫瘤質(zhì)量顯著降低，說明TrxR抑制劑AA1可抑制荷瘤小鼠胃癌發(fā)生發(fā)展。

在胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，細(xì)胞因子發(fā)揮一定調(diào)控作用［13］。SOD 水平改變可導(dǎo)致還原型復(fù)合物濃度下降，進(jìn)而提高胃黏膜上皮細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞早期異常分裂。MDA 是氧化型復(fù)合物，可通過誘導(dǎo)游離自由基形成增強(qiáng)游離自由基對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞的浸潤(rùn)和損傷程度，進(jìn)而促進(jìn)消化道腫瘤進(jìn)展［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，AA1 組小鼠 MDA 含量明顯低于對(duì)照組，SOD 含量明顯高于對(duì)照組，可見TrxR抑制劑AA1可提高荷瘤小鼠抗氧化能力。

研究顯示，中晚期胃癌患者外周血T 細(xì)胞免疫功能低下的原因可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［16］。在腫瘤抗原刺激下，脾細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞前體被激活，分泌免疫抑制因子，抑制機(jī)體免疫細(xì)胞活性，導(dǎo)致胃癌患者機(jī)體免疫功能低下［17］。而機(jī)體總的免疫功能狀況可由 CD4+和 CD8+T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)［18］。CD4+T細(xì)胞為輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞，可輔助體液免疫及細(xì)胞免疫功能，CD8+T 細(xì)胞為抑制/殺傷性T 細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞可協(xié)調(diào)B 細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，CD8+T細(xì)胞則抑制抗體合成、分泌及T 細(xì)胞增殖，CD8+T 細(xì)胞增多有利于腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)。CD4+、CD8+T 細(xì)胞在機(jī)體免疫過程中相互作用，二者在平衡狀態(tài)時(shí)才能維持機(jī)體免疫功能平衡與穩(wěn)定。T 細(xì)胞亞群變化是評(píng)估惡性腫瘤患者和免疫相關(guān)性疾病患者免疫功能的有效方法［19］。NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性作用，能夠非特異直接殺傷腫瘤細(xì)胞，其殺傷腫瘤作用不需要特異性抗體參與，也不需要靶細(xì)胞上的MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類分子表達(dá)，是抗腫瘤免疫的第一道屏障［20］。NK 細(xì)胞數(shù)減少可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降。本研究顯示，AA1 組外周血CD4+T、NK 細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組，而CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，提示AA1 組荷瘤小鼠免疫能力顯著提高。

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員［21］。JNK 家族包括 10 個(gè)由 3 個(gè)基因編碼的亞型。JNK1 和JNK2 存在于機(jī)體所有細(xì)胞和組織中，而JNK3 主要在心臟、大腦和睪丸中表達(dá)。研究表明，JNK磷酸化被激活在炎癥、凋亡、腫瘤壞死信號(hào)通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用［21-22］。本研究顯示，AA1 組小鼠p-JNK 表達(dá)顯著高于對(duì)照組，說明該組荷瘤小鼠JNK信號(hào)通路被激活，腫瘤發(fā)生發(fā)展受到抑制。

綜上，TrxR 抑制劑AA1 可激活荷瘤小鼠抗腫瘤免疫，抑制胃癌發(fā)生進(jìn)展，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、提高JNK 信號(hào)通路蛋白磷酸化表達(dá)有關(guān)，為深入探討其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。