膽堿激酶α抑制劑MN58b對U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖及凋亡的影響①

岳芳倩 鄒有瑞 孫勝玉 王 哲 馬 輝 （寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川750004）

膠質(zhì)瘤是人腦中最常見原發(fā)性神經(jīng)惡性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%，由于其生長過程中浸潤廣泛，手術(shù)很難將其徹底切除，預(yù)后極差，病死率較高［1-3］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）是一類具有自我更新、多向分化潛能且致瘤性極強(qiáng)的細(xì)胞亞群，近年研究表明，膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后可能與GSCs關(guān)系密切［4-5］。

膽堿激酶（choline kinase，CHK）是磷酸膽堿生物合成過程中起關(guān)鍵作用的酶類，有膽堿激酶α（choline kinase alpha，CHKA）和膽堿激酶β（choline kinase beta，CHKB）2 個亞型［6］。在體內(nèi)，CHKB 僅具有乙醇胺激酶活性，而CHKA 兼具CHK、乙醇胺激酶雙重活性，在功能方面優(yōu)于CHKB，是膽堿激酶的優(yōu)勢亞型。近年研究顯示，CHKA 具有癌基因特性，在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的重要因子［7］。課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)CHKA 參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過程，與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未明確，推測其可能與GSCs聚集與活性有關(guān)。本研究擬探究CHKA在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況及其活性被抑制后GSCs 增殖、凋亡情況，初步探討CHKA 與GSCs的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG、小膠質(zhì)細(xì)胞株HMC3（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；DMEM、DMEM-F12、胎牛血清（美國Gibco 公司）；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、B27因子（美國Invitrogen 公司）；胰蛋白酶和青霉素、鏈霉素（上海碧云天公司）；兔抗人CHKA抗體、鼠抗人Nestin 抗體、兔抗人 CD133 抗體、兔抗人 GAPDH 抗體（美國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；CHK 抑制劑MN58b（上海一飛公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Pre?mix ExTaqTM（日本TaKaRa 公司）；凋亡試劑盒（聯(lián)科生物）；CCK8 試劑盒（日本同仁公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendrof 儀器公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及U87GSCs 提取 U87MG 細(xì)胞、HMC3 細(xì)胞 37℃ 水浴復(fù)蘇，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，鋪于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化U87MG細(xì)胞，以神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，置于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，更換為神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，即無血清DMEM-F12 中加入20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF 及 2%B27 因子，培養(yǎng) 3~5 d，培養(yǎng)中期半換液。

1.2.2 免疫熒光法鑒定U87GSCs 收集生長狀況較好的U87GSCs 腫瘤球重懸于含血清培養(yǎng)基中，在鋪有無菌蓋玻片的24 孔板中爬片4 h，棄培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗，0.1%Triton100X 通透 30 min，PBS清洗 3 次，5 min/次，山羊血清封閉 30 min，加入CD133、Nestin 抗體 4℃ 孵育過夜，PBS 緩沖液清洗3 次，5 min/次，加入相應(yīng)二抗，避光孵育 30 min，DAPI 染色 10 min，PBS 清洗 3 次，5 min/次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察熒光情況并拍照。

1.2.3 RT-PCR 檢測 CHKA 表達(dá) RNA 提取試劑盒提取U87MG、HMC3、U87GSCs 細(xì)胞總RNA，測定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。CHKA F：5'-CGGAAAGTGCTCCTGCGGCT-3'，R：5'-AACCAAGCTGTGCAGCCCAA-3'，以β-actin為內(nèi)參，按照說明書加樣體系檢測。

1.2.4 Western blot 檢測CHKA 蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解法提取不同細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量，30 μg/孔上樣，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳（80 V），轉(zhuǎn)至 PVDF 膜（300 mA，45 min），室溫封閉 1 h，加入 CHKA 一抗4℃ 孵育過夜，次日收集一抗，TBST 清洗5 次，5 min/次，加入相應(yīng)二抗孵育 2 h，TBST 漂洗 5 次，ECL顯影。

1.2.5 CCK8 檢測細(xì)胞增殖活性 收集U87GSCs細(xì)胞懸液，離心，棄上清，采用含不同劑量DMSO 溶解的MN58b溶液（10、20、40 μmo/l L）重懸，1×104個/100 μl 鋪于96 孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，在各時間段加入10μl CCK8 溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測不同藥物濃度在不同時間點(diǎn)各孔450 nm處吸光度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用20μmo/l L MN58b溶液和DMEM溶液處理U87GSCs，培養(yǎng)48 h，收集上清中的細(xì)胞，預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌，離心，棄上清，500μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，在各處理管中加入5μl Annexin V-APC 和10μl 7-AAD，移液器吹打均勻，室溫下避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U87GSCs 陽性表達(dá) CD133、Nestin 分子標(biāo)志物 免疫熒光結(jié)果顯示，將U87MG細(xì)胞重懸于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中24 h，可見部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中且聚集成不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)，48~72h期間半換液，腫瘤細(xì)胞團(tuán)逐漸呈圓球形生長，折光性良好，提示U87MG 采用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后可形成類似神經(jīng)干細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞球，其表面陽性表達(dá)腫瘤干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD133 和神經(jīng)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物Nestin，表明神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的細(xì)胞球?yàn)榈湫虶SCs（圖1）。

圖1 U87GSCs免疫熒光結(jié)果（×200）Fig.1 U87GSCs immunofluorescence results（×200）

2.2 正常小膠質(zhì)細(xì)胞、GSCs 及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CH?KA 表達(dá) RT-PCR 結(jié)果顯示，U87GSCs、U87MG 細(xì)胞 CHKA 表達(dá)顯著高于 HMC3 細(xì)胞（F=31.3，P<0.001，圖 2A）。Western blot 結(jié)果顯示，U87GSCs、U87MG 細(xì)胞 CHKA 表達(dá)顯著高于 HMC3 細(xì)胞（F=5.24，P<0.05，圖2B、C）。

圖2 CHKA在U87GSCs、U87MG、HMC3細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 CHKA expressions in U87GSCs，U87MG，HMC3 cells

2.3 CHKA 抑 制 劑 MN58b 抑 制 U87GSCs 增殖 CCK8 結(jié)果顯示，隨 MN58b 濃度增加，U87GSCs 增殖能力逐漸被抑制（圖3），與0 mol/L MN58b 組相比，不同MN58b 濃度組各時間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，P<0.001）。隨作用時間延長，不同MN58b濃度對U87GSCs 增殖抑制率差異顯著，40 μmol/L MN58b作用72 h對U87GSCs增殖抑制最為明顯（F=18.33，P<0.05）。

圖3 MN58b對U87GSCs增殖的影響Fig.3 Effect of MN58b on proliferation of U87GSCs

表1 不同濃度MN58b對培養(yǎng)不同時間U87GSCs的抑制率比較（）Tab.1 Comparison of inhibition rates of different concen?trations of MN58b on U87GSCs in different cul?ture time（）

表1 不同濃度MN58b對培養(yǎng)不同時間U87GSCs的抑制率比較（）Tab.1 Comparison of inhibition rates of different concen?trations of MN58b on U87GSCs in different cul?ture time（）

Concentration 0 10μmol/ L 20μmol/ L 40μmol/ L F P 24 h 0.79±0.04 0.64±0.08 0.58±0.08 0.52±0.06 9.13<0.001 48 h 1.11±0.11 0.70±0.09 0.48±0.03 0.36±0.04 57.32<0.001 72 h 1.54±0.06 0.71±0.05 0.39±0.06 0.30±0.03 388.9<0.001 23.72 0.79 8.03 18.33 0.90 0.50<0.05<0.05 F P? ?? ?

2.4 MN58b 促進(jìn)U87GSCs 凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，加入DMSO 溶液的U87GSCs 凋亡率為1.87±0.45，加 入 CHKA 抑 制 劑 MN58b 溶 液 的U87GSCs 凋亡率為7.47±0.74，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=11.22，P<0.001，圖 4），提 示 CHKA 抑 制 劑MN58b可促進(jìn)U87GSCs凋亡。

圖4 DMSO和MN58b對U87GSCs凋亡的影響Fig.4 Effect of DMSO and MN58b on apoptosis of U87GSCs

3 討論

近年研究表明，GSCs可能是膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放化療產(chǎn)生耐受性，以及膠質(zhì)瘤預(yù)后不良和復(fù)發(fā)的根源［8-9］。但其發(fā)揮作用的具體作用機(jī)制尚未闡明，但可以確定的是GSCs 獨(dú)特的生物學(xué)特性與膠質(zhì)瘤對放化療不敏感、易復(fù)發(fā)密切相關(guān)［10］，如GSCs 可穩(wěn)定自我更新及高度增殖侵襲生長，使其在周圍正常腦組織中不斷浸潤生長，手術(shù)難以完全切除，而其極強(qiáng)的致瘤特性及高分化潛能使其比一般膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐放化療能力，因此，GSCs 作為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)已成為膠質(zhì)瘤研究重點(diǎn)。

CHKA 是膽堿激酶蛋白家族成員，在卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等人類腫瘤形成過程中扮演重要角色，且在惡性腫瘤發(fā)展和預(yù)后過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。MN58b 是 CHKA 小分子抑制劑 HC-3 的衍生物，與HC-3一樣可抑制CHKA 活性從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，另外MN58b 還可加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而觸發(fā) 腫 瘤 細(xì) 胞 凋 亡［13］。 HERNáNDEZ-ALCOCEBA等［14］研究顯示，MN58b 作為 CHKA 抑制劑在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和移植瘤生長過程中起明顯抑制作用。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多體素1H-MRS 參數(shù)膽堿/肌酸（Cho/Cr）代謝差異區(qū)域與膠質(zhì)瘤中腫瘤干細(xì)胞富集密切相關(guān)［15-16］。初步研究證實(shí)，Cho/Cr 低代謝區(qū)腦膠質(zhì)瘤組織中含有少量神經(jīng)GSCs，而Cho/Cr 高代謝區(qū)神經(jīng)GSCs含量明顯高于Cho/Cr低代謝區(qū)，神經(jīng)GSCs 分布與Cho 含量呈正相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，給予CHKA 特異性抑制劑MN58b，U87MG 增殖明顯被抑制，而其凋亡能力則被促進(jìn)。CHKA 作為Cho 代謝過程中的關(guān)鍵酶可能與GSCs發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確，推測其可能通過對GSCs 生物功能的調(diào)節(jié)從而影響膠質(zhì)瘤不良預(yù)后。因此，課題組從不同細(xì)胞系入手發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及GSCs 中CHKA 表達(dá)明顯高于正常小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后采用CHKA 特異性抑制劑MN58b 降低CHKA 生物活性，并進(jìn)一步通過CCK8 實(shí)驗(yàn)證明CHKA的生物活性被抑制后U87GSCs增殖能力明顯被抑制，同時采用流式細(xì)胞儀檢測U87GSCs 凋亡，發(fā)現(xiàn)CHKA活性被抑制后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，CHKA 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及GSCs 中表達(dá)明顯高于正常小膠質(zhì)細(xì)胞，且CHKA 生物活性被MN58b 抑制后可有效抑制GSCs 增殖，促進(jìn)其凋亡。因此，CHKA 可能是一種促癌基因，有望成為膠質(zhì)瘤診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，而MN58b 作為CHKA 的特異性抑制物可以作為抑制CHKA 的靶向藥物，與目前膠質(zhì)瘤的治療藥物相結(jié)合可能將會有效抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。