圣草酚通過調(diào)節(jié)Nrf2通路促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡①

張昆鵬 張曉愉 李少一 甄 品 尤江蓮 （邢臺市人民醫(yī)院，邢臺054001）

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死亡率中居第四位，是我國第二大健康負(fù)擔(dān)［1］。通常所用的化療法可以在某種程度上殺死癌細(xì)胞，但副作用給患者帶來了很多麻煩。它會導(dǎo)致電解質(zhì)失衡，脫水和營養(yǎng)不良，從而影響患者的生活質(zhì)量，這使得對新藥的需求變得迫在眉睫［2］。癌細(xì)胞逃脫凋亡的機(jī)制在腫瘤學(xué)研究中引起廣泛關(guān)注，利用藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要途徑之一［3］。凋亡由多種外在和內(nèi)在信號觸發(fā)，包括可能誘導(dǎo)某些促凋亡蛋白活化的各種細(xì)胞應(yīng)激或細(xì)胞毒性藥物，在這多種因素中，由ROS 驅(qū)動的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡備受關(guān)注。氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)是維持正常細(xì)胞功能和促進(jìn)細(xì)胞存活的基礎(chǔ)［4］。伴隨著比正常細(xì)胞更高的ROS 水平，癌細(xì)胞特征性地發(fā)展出幾種適應(yīng)性反應(yīng)，以維持與細(xì)胞生物學(xué)功能兼容的ROS 水平。因此，認(rèn)為對ROS 穩(wěn)態(tài)的干擾能夠破壞癌細(xì)胞的生物代謝并有效地誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［5］。圣草酚是一種天然的多酚黃酮類化合物，在水果、蔬菜和多種中藥中普遍存在。圣草酚具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護(hù)等作用［6］。已有研究表明，圣草酚通過誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡，G2/M 細(xì)胞周期阻滯和抑制m-TOR/PI3K/Akt 信號通路，對人肺癌A549 細(xì)胞發(fā)揮有效的抗癌活性［7］。雖已有研究表明圣草酚可誘導(dǎo)肝母細(xì)胞瘤HepG2 細(xì)胞凋亡，但高分化肝癌Huh7細(xì)胞株與肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞具有不同分泌物：Huh7細(xì)胞系能產(chǎn)生一些細(xì)胞質(zhì)蛋白，如白蛋白、a 抗胰蛋白酶、AFP 等；HepG2 細(xì)胞系可分泌ALB、a2-MG 等。因此，Huh7 細(xì)胞更適合用于肝細(xì)胞代謝方面的研究。故，圣草酚是否對高分化肝細(xì)胞肝癌Huh7 細(xì)胞凋亡具有作用尚不明確［8］。本文選取高分化肝細(xì)胞肝癌Huh7細(xì)胞株，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)來探究圣草酚對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 肝細(xì)胞HL-7702 和人肝癌細(xì)胞Huh7（上海通派生物科技有限公司）；圣草酚（HLPC≥99%，上海葉原生物科技有限公司，貨號：B29144），過氧化氫（純度≥98%，上海百舜生物科技有限公司，貨號：7722-84-1）；蓽茇酰胺（Piperlongumine，PL，可增加活性氧的水平，HLPC≥99%，上海藍(lán)木化工有限公司，貨號：S7551）；DMEM培養(yǎng)基（上?；鄯f生物科技有限公司，貨號：C21700500BT）；CCK-8 試劑盒（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab228554）；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液（上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：EELR1424）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJR0007）；BCA 試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Nrf2、HO-1、NOQ1 兔來源的單克隆抗體（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab36151、ab62352、ab189491、ab80588）。

1.1.2 動物 6 周齡的裸鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（冀）2018-004。將裸鼠飼養(yǎng)在恒溫（22±1）℃、相對濕度（55±5）%、12 h 光照/黑暗周期環(huán)境，并提供標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物食物和自來水。動物的護(hù)理和處理符合美國國立衛(wèi)生研究院編寫的《實(shí)驗(yàn)動物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝細(xì)胞HL-7702 和人肝癌細(xì)胞Huh7均在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 法測定圣草酚對細(xì)胞的毒性影響 將HL-7702 和Huh7 細(xì)胞分別接種到96 孔板中，用不同濃度的圣草酚處理培養(yǎng)48 h 后，將細(xì)胞與10 μl CCK-8 試劑連續(xù)混合2 h。通過酶標(biāo)儀測量450 nm 處的吸光度值。細(xì)胞活性=（各濃度圣草酚處理OD450n/m0μmo/l L圣草酚處理OD450nm）×100%。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 將Huh7 細(xì)胞分為對照組、H2O2組、圣草酚組、H2O2+圣草酚組，分別用0.5 mmo/l L H2O2或78μmo/l L圣草酚處理細(xì)胞48 h。

1.2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 將裸鼠隨機(jī)分為對照組、PL 組、圣草酚組、PL+圣草酚組，每組8 只。在裸鼠左腋下皮下注射 Huh7 細(xì)胞（5×104個(gè)/ml），繼續(xù)在 SPF 條件下正常飲食飼養(yǎng)。當(dāng)Huh7腫瘤直徑達(dá)到約3 mm時(shí)，每天腹腔注射PL 2.5 mg/kg或圣草酚40 mg/kg治療15 d［9-10］。頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，測定移植瘤體積和重量。

1.2.5 DCFH-DA探針測定ROS的含量 將細(xì)胞用DMEM 洗滌 2 次，然后在 5 μmo/l L DCFH-DA 中于37℃溫育30 min。用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，并在孵育后在裂解緩沖液中裂解。在最佳激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長下527 nm 測量熒光值。ROS 相對水平=各實(shí)驗(yàn)組熒光值/對照組熒光值。

1.2.6 試劑盒檢測SOD 和MDA 水平 收集1.2.3處理細(xì)胞，加入PBS 冰上超聲裂解細(xì)胞，然后再置于4℃離心機(jī)中，12 000 g 離心10 min，收集上清液備用。收集1.2.4 各組裸鼠血液，于4℃離心機(jī)中，3 000 g離心20 min，收集上清液備用。取Huh7細(xì)胞上清液和裸鼠血清按照SOD 和MDA 試劑盒說明檢測SOD和MDA水平。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取1.2.3處理細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，并按1×106個(gè)/ml的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μl FITC 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和5μl 碘化丙啶，避光孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot 檢測 Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白相對表達(dá)水平 用RIPA 裂解液提取總蛋白，并用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF 膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗（Nrf2 1∶1 000、HO-1 1∶1 500、NQO1 1∶800、GAPDH 1∶1 000）在4℃封閉過夜，加入對應(yīng)山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Quantity One 軟件進(jìn)行分析蛋白條帶灰度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.9 TUNEL 染色檢測細(xì)胞凋亡 取腫瘤組織固定后，常規(guī)石蠟切片，玻片預(yù)先用多聚賴氨酸處理以防止脫片。切片脫蠟入水后按TUNEL 染色試劑盒使用說明操作，DAB 染色，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下檢查。棕褐色細(xì)胞代表凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0 構(gòu)建的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)經(jīng) shapiro-wilk 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組比較進(jìn)行One-Way ANOVA 分析，兩兩比較使用SNK檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圣草酚對HL-7702和Huh7細(xì)胞毒性作用 結(jié)果顯示，圣草酚呈劑量依賴性抑制HL-7702 和Huh7細(xì)胞活性。相同濃度的圣草酚對Huh7 細(xì)胞抑制作用比HL-7702抑制作用強(qiáng)，且隨著濃度增加，差異越顯著，這說明圣草酚對肝癌細(xì)胞具有選擇抑制作用。Huh7 細(xì)胞圣草酚 IC50為 126.58 μmo/l L，HL-7702 細(xì)胞圣草酚 IC10為 77.96 μmo/l L，因此選擇對正常肝細(xì)胞HL-7702 無毒害作用的圣草酚濃度78μmo/l L進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如圖1。

圖1 通過CCK-8法檢測圣草酚對HL-7702和Huh7細(xì)胞毒性作用Fig.1 Cytotoxic effect of Eriodictyol on HL-7702 and Huh7 cells by CCK-8 method

2.2 圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh 7 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組相比，H2O2組和圣草酚組ROS 水平和MDA 含量顯著上升，SOD 活性顯著下降（P<0.05）；與 H2O2組相比，H2O2+圣草酚組 ROS 水平和MDA 含量顯著上升，SOD 活性顯著下降（P<0.05），如圖2。這說明圣草酚可改變肝癌細(xì)胞Huh7 氧化應(yīng)激水平。

圖2 圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響Fig.2 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced oxidative stress in Huh7 cells

2.3 圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh7 細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，H2O2組和圣草酚組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與H2O2組相比，H2O2+圣草酚組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），如圖3。這說明圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌Huh7細(xì)胞凋亡。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced apoptosis in Huh7 cells was examined by flow cytometry

2.4 圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh7 細(xì)胞Nrf2 通路的影響 如圖4 所示：與對照組相比，H2O2組和圣草酚組細(xì)胞中核 Nrf2、HO-1、NOQ1 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）；與 H2O2組相比，H2O2+圣草酚組細(xì)胞中核Nrf2、HO-1、NOQ1 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）。這說明圣草酚抑制Nrf2通路激活。

圖4 Western blot 檢測圣草酚對H2O2誘導(dǎo)Huh7 細(xì)胞Nrf2通路的影響Fig.4 Effect of Eriodictyol on H2O2-induced Nrf2 path?way in Huh7 cells was detected by Western blot

2.5 圣草酚對肝癌Huh 細(xì)胞移植瘤的影響 與對照組相比，PL 組和圣草酚組移植瘤體積和重量顯著降低，ROS水平和MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Nrf2、HO-1、NOQ1表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）；與PL組相比，PL+圣草酚組移植瘤體積和重量顯著降低，ROS水平和MDA 含量顯著增加，SOD 活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增多，核Nrf2、HO-1、NOQ1 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），如圖5。這說明圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌移植瘤細(xì)胞的凋亡，并抑制Nrf2通路激活。

圖5 圣草酚對肝癌Huh7細(xì)胞移植瘤的影響Fig.5 Effect of Eriodictyol on liver cancer Huh7 cell transplanted tumor

3 討論

盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)步，但全世界肝癌的發(fā)病率仍在逐年上升，肝癌患者五年生存率仍然很低。因此，迫切需要更有效的治療來提高肝癌患者的生活質(zhì)量?；熕幬飶V泛用于提高癌癥患者的存活率，但這些藥物顯示出各種各樣的副作用。化療藥物在癌癥治療中的主要策略是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，開發(fā)新的促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的藥物勢在必行。圣草酚通過PI3K/Akt/NF-κB 信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果表明，圣草酚選擇性抑制肝癌細(xì)胞的活性。同時(shí)還證明，低毒性的圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞和移植瘤細(xì)胞的凋亡，并抑制Nrf2通路激活。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都具有逃脫凋亡的能力。許多蛋白包括細(xì)胞表面受體、配體、蛋白酶和有絲分裂組分，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生存與凋亡的平衡［12］。有研究表明，圣草酚誘人肝癌細(xì)胞抗癌和凋亡作用與細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)［13］。氧化應(yīng)激通過線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。ROS包括超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫，都是通過細(xì)胞過程（如線粒體代謝）的產(chǎn)物。PL 為促氧化藥物，可以增加ROS 水平，目前可用于選擇性地殺死癌細(xì)胞［15］。ROS 的產(chǎn)生與抗氧化劑系統(tǒng)清除自由基的能力之間的不平衡會導(dǎo)致氧化應(yīng)激。正常細(xì)胞中會產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)ROS，以調(diào)節(jié)一系列生理功能，包括炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)，從而促進(jìn)病原體和致癌物的消除，降低心血管疾病的發(fā)生和甲狀腺激素的生物合成等［16］。過量的ROS 水平則會對細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞成分（如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）受損，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17］。本研究表明，圣草酚可升高H2O2誘導(dǎo)的Huh7細(xì)胞和PL 處理的Huh7 細(xì)胞移植瘤中ROS 水平和MDA 含量，降低SOD 活性。實(shí)際上，膜脂質(zhì)的過氧化被認(rèn)為是破壞氧化應(yīng)激的首要目標(biāo)，MDA 是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物［18］。SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除機(jī)體內(nèi)氧自由基［19］。同時(shí)，本研究還表明，圣草酚可升高H2O2誘導(dǎo)的Huh7 細(xì)胞和PL處理的Huh7 細(xì)胞移植瘤細(xì)胞凋亡率。這說明圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌Huh7 細(xì)胞凋亡，這與圣草酚可誘導(dǎo)肝癌HepG2 細(xì)胞的凋亡結(jié)果相一致［8］。

Nrf2信號傳導(dǎo)途徑是細(xì)胞防御系統(tǒng)最關(guān)鍵的途徑之一，該途徑調(diào)節(jié)了許多可以抵消氧化應(yīng)激的抗氧化劑和細(xì)胞保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄［20］。如，低聚原花青素通過Nrf2-ARE 途徑保護(hù)A549細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［21］。Nrf2 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其在細(xì)胞核中的積累和激活有利于氧化損傷，也有利于癌細(xì)胞，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因素［22］。在氧化應(yīng)激期間，會激活復(fù)雜的氧化應(yīng)激響應(yīng)系統(tǒng)。特別是，Nrf2 暴露于親電試劑或ROS 中，可以誘導(dǎo)一系列保護(hù)性蛋白，例如 HO-1 和 NQO1［23］。本研究表明，圣草酚抑制細(xì)胞核Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)，說明圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞和移植瘤細(xì)胞的凋亡與抑制Nrf2通路激活有關(guān)。

綜上所述，圣草酚促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞和移植瘤細(xì)胞的凋亡，并抑制Nrf2 通路激活，說明圣草酚具有治療肝癌的潛在能力。但是本文僅是相關(guān)機(jī)制的初步探討，具體的分子通路機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。