王立俠 韓金芬 馬明明 (鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)電生理室,鄭州450000)
缺血性腦卒中又稱腦梗死,是由腦部供血障礙而引起的局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化,其發(fā)病率和致殘率較高,是導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要原因之一[1-2]。研究顯示,miRNA 在急性缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。研究報(bào)道,miR-150-5p 與缺血性腦卒中患者二級預(yù)防治療的中期預(yù)后有關(guān),參與腦血栓形成的生理病理過程[4]。缺血性腦卒中患者外周血miR-150-5p 表達(dá)顯著降低,可作為缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物[5]。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoidin domain receptor 1,DDR1)是一種受體型蛋白酪氨酸激酶,其激活可活化一系列細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo),參與多種疾病過程[6]。抑制DDR1 活化可降低缺氧缺血腦損傷新生鼠皮層組織中微管相關(guān)蛋白Tau 磷酸化水平,促進(jìn)乙酰膽堿釋放,DDR1 抑制劑對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷具有保護(hù)作用[7]。但miR-150-5p對缺血性腦損傷的影響及機(jī)制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn),缺氧缺糖可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[8]。本研究采用缺氧缺糖(oxygen-glucose depri?vation,OGD)處理大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞建立神經(jīng)損傷模型,探究miR-150-5p對OGD 誘導(dǎo)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制是否與DDR1相關(guān),為相關(guān)腦疾病治療提供新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級孕16~18 d SD 大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012-0002。
1.1.2 主要試劑與儀器 Neurobasal 培養(yǎng)基、B27、高糖DMEM、無糖DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自Hyclone 公司;熒光定量試劑盒購自美國 Progema 公司;RIPA 蛋白裂解液、BCA 試劑盒購自江蘇碧云天公司;MTT 試劑盒購自美國Sig?ma 公司;乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(PI)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京So?larbio 公司;CO2孵育箱、Thermo FC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司;FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng) 無菌條件下分離大鼠大腦皮層組織,剪成1~2 mm3組織塊,0.25%胰蛋白酶消化15 min,加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基終止消化,離心得細(xì)胞沉淀,重懸,過200 目篩,離心,置于神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(98%Neurobasal+2%B27),輕輕吹打制成細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先包被過L-多聚賴氨酸的6 孔板中,37℃、5%CO2培養(yǎng)。
1.2.2 OGD模型建立與細(xì)胞分組 取培養(yǎng)5 d的原代大腦皮層神經(jīng)元,棄培養(yǎng)基,加入無糖DMEM培養(yǎng)基(無糖DMEM 預(yù)先放入缺氧培養(yǎng)箱中去除培養(yǎng)基中的氧氣),置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃、95%N2、5%CO2)進(jìn)行OGD 培養(yǎng)90 min,換為神經(jīng)元專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),正常對照(Con)組不做任何OGD 處理。將miRNC、miR-150-5p、anti-miR-NC、anti-miR-150-5p 轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)細(xì)胞,記為miR-NC組、miR-150-5p組、an?ti-miR-NC 組、anti-miR-150-5p 組;將 miR-NC、miR-150-5p、si-NC、si-DDR1 轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)細(xì)胞后進(jìn)行OGD 處理,記為 OGD+miR-NC 組、OGD+miR-150-5p組、OGD+si-NC 組、OGD+si-DDR1 組;將 miR-150-5p分別與pcDNA、pcDNA-DDR1 共轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)細(xì)胞后再進(jìn)行OGD 處理,記為OGD+miR-150-5p+pcD?NA組、OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1組。
1.2.3 RT-qPCR 檢測 miR-150-5p、DDR1 mRNA 表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按熒光定量說明進(jìn)行PCR反應(yīng),各樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),反應(yīng)條件為95℃ 30 s,60℃ 40 s;72℃ 30 s,共40 個(gè)循環(huán);60℃ 延長 5 min,2?ΔΔCt法計(jì)算。miR-150-5p 和 DDR1 分別以U6 和 GAPDH 為 內(nèi) 參 ,miR-150-5p F:5'-CGCTCTCTCCCAACCCTTGTACC-3',R:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6 F:5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3',R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3';DDR F:5'-ACTTTGGCATGAGCCGGAAC-3',R:5'-ACGTCACTCGCAGTCGTGAAC-3';GAPDH F:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3',R:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3',引物由上海生工生物工程公司合成。
1.2.4 Western blot 法檢測 DDR1、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量,配膠,上樣,SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜,封閉液封閉90 min,加入一抗4℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育2 h,底物反應(yīng)、顯影、定影,掃描儀掃描膠片,Image軟件分析各目的條帶灰度值,以GAPDH 為內(nèi)參,分析各組目的蛋白表達(dá)。
1.2.5 MTT 檢測細(xì)胞存活率 收集細(xì)胞,加入MTT 孵育 4 h,吸取上清,加入 DMSO,搖勻,酶標(biāo)儀測量吸光度(OD)。細(xì)胞存活率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對照組×100%。
1.2.6 LDH釋放率檢測 收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞,根據(jù)說明書進(jìn)行LDH釋放量檢測。LDH釋放率(%)=LDH上清/(LDH上清+LDH細(xì)胞)×100%。
1.2.7 細(xì)胞凋亡率檢測 收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS 漂洗,加入結(jié)合緩沖液重懸,加入Annexin V-FITC和PI混勻后避光孵育10 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-150-5p 和DDR1 靶向關(guān)系 構(gòu)建含miR-150-5p 結(jié)合位點(diǎn)的DDR1 野生型載體和突變型載體,分別與miR-NC、miR-150-5p共轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h,根據(jù)說明書檢測熒光素酶活性。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 miR-150-5p 和 DDR1 在 OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá) 與對照組相比,OGD 組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)降低,DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05,圖1、表1)。
表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)(,n=9)Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in?duced rat cortical neural cells(,n=9)
表1 miR-150-5p 和DDR1 在OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)(,n=9)Tab.1 Expressions of miR-150-5p and DDR1 in OGD-in?duced rat cortical neural cells(,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05.
DDR1 protein 0.56±0.05 0.92±0.081)11.448 0.000 Groups Con OGD t P miR-150-5p 1.00±0.08 0.43±0.041)19.118 0.000 DDR1 mRNA 1.01±0.09 3.42±0.341)20.557 0.000
圖1 DDR1蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of DDR1 protein
2.2 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活率和LDH 釋放的影響 與對照組相比,OGD 組miR-150-5p 表達(dá)降低,細(xì)胞存活率降低,LDH 釋放率升高(P<0.05);與 OGD+miR-NC 組相比,OGD+miR-150-5p 組 miR-150-5p 表達(dá)升高,細(xì)胞存活率升高,LDH釋放率降低(P<0.05,表2)。
表2 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活率和LDH釋放的影響(,n=9)Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in?duced by OGD(,n=9)
表2 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活率和LDH釋放的影響(,n=9)Tab.2 Effect of miR-150-5p overexpression on survival rate and LDH release of rat cortical neurons in?duced by OGD(,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with OGD+miRNC group,2)P<0.05.
miR-150-5p Groups Survival rate(%)1.00±0.08 0.42±0.041)0.41±0.03 0.86±0.082)215.745 0.000 Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P 100.00±13.26 48.25±4.361)45.28±4.57 78.69±7.252)91.449 0.000 LDH release rate(%)9.25±0.93 36.21±3.541)39.47±3.85 14.29±1.442)276.368 0.000
2.3 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比,OGD 組細(xì)胞凋亡率升高,Bcl-2 表達(dá)降低,Bax 表達(dá)升高(P<0.05);與 OGD+miR-NC 組相比,OGD+miR-150-5p 組細(xì)胞凋亡率降低,Bcl-2 表達(dá)升高,Bax 表達(dá)降低(P<0.05,圖2、表3)。
圖2 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons
表3 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(,n=9)Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons(,n=9)
表3 miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(,n=9)Tab.3 Effect of miR-150-5p overexpression on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons(,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with OGD+miRNC group,2)P<0.05.
Bax protein 0.31±0.03 0.76±0.071)0.77±0.06 0.38±0.042)195.164 0.000 Groups Con OGD OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p F P Apoptotic rate(%)7.36±0.74 26.58±2.611)28.36±2.71 11.69±1.132)250.038 0.000 Bcl-2 protein 0.69±0.06 0.23±0.031)0.22±0.03 0.61±0.062)245.167 0.000
2.4 抑制DDR1 表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響 與OGD+si-NC 組相比,OGD+si-DDR1 組 DDR1 表達(dá)降低,細(xì)胞存活率升高,LDH 釋放率降低,細(xì)胞凋亡率降低,Bcl-2 表達(dá)升高,Bax 表達(dá)降低(P<0.05,圖3、表4)。
表4 抑制DDR1表達(dá)對OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響(,n=9)Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury(,n=9)
表4 抑制DDR1表達(dá)對OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響(,n=9)Tab.4 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-induced rat cortical neuronal injury(,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.05;compared with OGD+si-NC group,2)P<0.05.
Bax protein 0.32±0.03 0.75±0.071)0.77±0.06 0.42±0.042)171.600 0.000 Groups Con OGD OGD+si-NC OGD+si-DDR1 F P DDR1 protein 0.51±0.05 0.93±0.081)0.95±0.09 0.59±0.052)95.692 0.000 Survival rate(%)100.00±9.32 49.32±4.331)46.28±4.71 71.36±7.252)123.065 0.000 LDH release rate(%)8.36±0.84 38.41±3.881)41.25±4.31 19.65±1.872)233.033 0.000 Apoptotic rate(%)6.59±0.66 27.39±2.771)28.43±2.85 15.62±1.512)209.584 0.000 Bcl-2 protein 0.68±0.06 0.22±0.021)0.21±0.03 0.56±0.052)277.743 0.000
圖3 抑制DDR1 表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of DDR1 expression inhibition on OGD-in?duced apoptosis of rat cortical neurons
2.5 miR-150-5p 靶向調(diào)控 DDR1 表達(dá) StarBase 預(yù)測顯示,miR-150-5p 與DDR1 存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與miR-NC 組相比,miR-150-5p 組中轉(zhuǎn)染DDR1 野生型表達(dá)載體的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而轉(zhuǎn)染DDR1 突變型表達(dá)載體的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 5)。與 miR-NC 組相比,miR-150-5p 組 DDR1 表達(dá)顯著升高(P<0.05),與anti-miR-NC 組相比,antimiR-150-5p組DDR1表達(dá)顯著降低(P<0.05,表6)。
表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=9)Tab.5 Double luciferase report experiments(,n=9)
表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=9)Tab.5 Double luciferase report experiments(,n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.
MUT-DDR1 1.01±0.08 1.03±0.07 0.564 0.580 Groups miR-NC miR-150-5p t P WT-DDR1 1.00±0.09 0.44±0.041)17.058 0.000
表6 miR-150-5p調(diào)控DDR1蛋白表達(dá)(,n=9)Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression(,n=9)
表6 miR-150-5p調(diào)控DDR1蛋白表達(dá)(,n=9)Tab.6 miR-150-5p regulates DDR1 protein expression(,n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05;compared with antimiR-NC group,2)P<0.05.
DDR1 protein 0.55±0.05 0.22±0.021)0.53±0.04 0.96±0.082)304.404 0.000 Groups miR-NC miR-150-5p anti-miR-NC anti-miR-150-5p F P
圖4 miR-150-5p靶向調(diào)控DDR1表達(dá)Fig.4 miR-150-5p targets DDR1 expression
2.6 DDR1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-150-5p 過表達(dá)對OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用 與OGD+miR-150-5p+pcDNA 組相比,OGD+miR-150-5p+pcD?NA-DDR1 組DDR1 表達(dá)升高,細(xì)胞存活率降低,LDH釋放率升高,細(xì)胞凋亡率升高,Bcl-2表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高(P<0.05,表7、圖5)。
表7 DDR1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-150-5p過表達(dá)對OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用(,n=9)Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury(,n=9)
表7 DDR1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-150-5p過表達(dá)對OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用(,n=9)Tab.7 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuronal injury(,n=9)
Note:Compared with OGD+miR-NC group,1)P<0.05;compared with OGD+miR-150-5p+pcDNA group,2)P<0.05.
Groups DDR1 protein Survival rate(%)Bcl-2 protein Bax protein 0.78±0.07 0.37±0.031)0.35±0.04 0.67±0.062)152.155 0.000 OGD+miR-NC OGD+miR-150-5p OGD+miR-150-5p+pcDNA OGD+miR-150-5p+pcDNA-DDR1 F P 0.94±0.08 0.43±0.041)0.42±0.03 0.81±0.072)183.478 0.000 44.39±4.28 77.58±7.751)79.65±7.36 52.11±5.322)71.169 0.000 LDH release rate(%)37.54±3.87 13.46±1.331)12.58±1.26 31.65±3.142)205.674 0.000 Apoptotic rate(%)27.55±2.71 11.02±1.131)10.47±1.08 22.32±2.252)173.887 0.000 0.22±0.03 0.62±0.061)0.63±0.05 0.32±0.032)199.101 0.000
圖5 DDR1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用Fig.5 DDR1 overexpression reverses effect of miR-150-5p overexpression on OGD-induced rat cortical neuro?nal apoptosis
缺血性腦損傷是臨床常見疾病,缺血性神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦損傷發(fā)生密切相關(guān),研究其作用分子機(jī)制對腦損傷防治具有重要意義[9]。氧化應(yīng)激在缺血缺氧性腦損傷中具有重要作用[10]。本研究采用OGD 法誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,結(jié)果顯示,細(xì)胞存活率降低,LDH 釋放率升高,細(xì)胞凋亡率升高,說明OGD 可誘導(dǎo)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。研究報(bào)道,miR-24 抑制劑可預(yù)防缺血性卒中神經(jīng)元凋亡[11]。miR-let-7c-5p 過表達(dá)通過抑制神經(jīng)炎癥和調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化,改善創(chuàng)傷性腦損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙和腦水腫[12]。說明miRNA 參與調(diào)控缺血性卒中及腦神經(jīng)損傷。較低水平的miR-150-5p 與死亡率獨(dú)立相關(guān),miR-150-5p 可降低急性缺血性中風(fēng)后 90 d 內(nèi)的死亡率風(fēng)險(xiǎn)[13]。miR-150 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡保護(hù)小鼠心臟免受缺血性損傷[14]。本研究結(jié)果顯示,OGD 誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中miR-150-5p 呈低表達(dá)。過表達(dá)miR-150-5p,細(xì)胞存活率升高,LDH釋放率降低,細(xì)胞凋亡率降低,Bcl-2表達(dá)升高,Bax 水平降低,提示過表達(dá)miR-150-5p 可促進(jìn)細(xì)胞存活,抑制LDH 釋放和細(xì)胞凋亡,可保護(hù)OGD誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷。
研究報(bào)道,氧糖剝奪損傷的神經(jīng)元細(xì)胞中DDR1 蛋白表達(dá)增加[15]。大鼠局灶性腦缺血后DDR1表達(dá)升高,DDR1可能在腦缺血再灌注后破壞血腦屏障中起關(guān)鍵作用[16]。miR-199a-5p 通過下調(diào)大鼠DDR1預(yù)防腦缺血性損傷[17]。高遷移率簇蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)通過上調(diào)DDR1 表達(dá)和下調(diào)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化促進(jìn)細(xì)胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT),并誘導(dǎo)自噬[18]。本研究顯示,OGD 誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中DDR1 呈高表達(dá),抑制DDR1表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞存活,減少LDH釋放和細(xì)胞凋亡,且miR-150-5p 靶向調(diào)控DDR1,DDR1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-150-5p 過表達(dá)對OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
綜上所述,過表達(dá)miR-150-5p 可能通過下調(diào)DDR1 表達(dá)保護(hù)OGD 誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷,為治療缺血性腦損傷相關(guān)疾病提高新思路和靶點(diǎn)。