LINC00467通過(guò)靶向miR-495-3p調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡①

李思瑩 周萍萍 齊艷秀 張 劍 王玉清 （佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，佳木斯154002）

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）是一種常見(jiàn)致死性眼內(nèi)腫瘤，高發(fā)于兒童［1］。與其他惡性腫瘤相比，Rb發(fā)病率較低，但若治療不當(dāng)則發(fā)展迅速，常發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，死亡率較高［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的缺乏蛋白編碼能力的RNA，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因或通路發(fā)揮致癌基因或抑癌基因功能，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯和侵襲有關(guān)［3-4］。多個(gè)與腫瘤相關(guān)的lncRNA 參與Rb進(jìn)展，并是Rb的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［5］。LINC00467 是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)RNA，研究顯示，LINC00467高表達(dá)與結(jié)腸癌患者總體生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存期較短有關(guān)，下調(diào)LINC00467 表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［6］。肝癌中 LINC00467 呈高表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。生物信息學(xué)分析顯示，miR-495-3p 是LINC00467 的潛在靶基因。miR-495-3p 已被證實(shí)在骨肉瘤中具有抑癌基因作用［8］，但 LINC00467 是否具有抗 Rb 作用，其作用是否與調(diào)控miR-495-3p 表達(dá)有關(guān)尚未闡明。本研究探討 LINC00467、miR-495-3p 在 Rb 中的生物學(xué)作用，以期為Rb分子治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 人Rb 細(xì)胞系Y79（美國(guó)菌種保藏中心）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；RP?MI1640 培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco 公司）；TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；PrimeScript RT 試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega 公司）；SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 試劑盒（中國(guó)TaKaRa 公司）；LINC00467特異性小干擾RNA（si-LINC00467）、亂序無(wú)意義陰性對(duì)照序列（si-NC）、miR-495-3p 模擬物（miR-128-3p mimics）、模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-495-3p 抑制物（antimiR-182-5p）、抑制物對(duì)照（anti-NC）由上海吉瑪制藥公司提供；MTT（美國(guó)Sigma 公司）；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海鈺博生物公司）；兔抗人細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lym?phoma 2，Bcl-2）、Bcl 相關(guān) X 蛋白（Bcl associated X protein，Bax）、GAPDH 抗體及山羊抗兔二抗（上海艾博抗公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.1.2 組織來(lái)源 收集2014 年至2018 年我院病理科確診的 25 例 Rb 標(biāo)本，男性 14 例，女性 11 例，年齡6 個(gè)月~16 歲，另取25 例正常視網(wǎng)膜組織，男性18 例，女性 7 例，年齡 5~14 歲。Rb 標(biāo)本在摘除手術(shù)中采集，術(shù)前均未接受放化療治療，正常視網(wǎng)膜組織來(lái)源于意外死亡捐獻(xiàn)者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 Y79 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)按Lipofectamine 2000使用說(shuō)明將si-NC、si-LINC00467、miR-NC、miR-495-3p mimics、si-LINC00467+anti-miRNC、si-LINC00467+anti-miR-495-3p 分別轉(zhuǎn)染至 Y79細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，合格后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測(cè) LINC00467 和 miR-495-3p 表達(dá) 采用TRIzol試劑提取Rb組織、正常視網(wǎng)膜組織總RNA，采用PrimeScript RT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分別采用SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 試 劑 盒 測(cè) 定 LINC00467 和 miR-495-3p 表達(dá)，2?ΔΔCt法計(jì)算，LINC00467 以 GAPDH 為內(nèi)參，miR-495-3p 以 U6 為內(nèi)參，引物序列（5'-3'）：LINC00467 F：ATTGAAGATGCTGCCAAGGG，R：GCCCAGTTTCAGTCCCTCTT；GAPDH F：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA，R：AATGAAGGGGTCATTGATGG；miR-495-3p F：GCGGAAACAAACATGGTGCA；U6 F：TCCGATCGTGAAGCGTTC，R：GTGCAGGGTCCGAGGT。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集Y79 細(xì)胞，采用RPMI1640 培養(yǎng)基制備細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，取0.1 ml細(xì)胞懸液加入96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，20 μ/l 孔加入MTT 試劑（5 mg/ml），反應(yīng)4 h，終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，150μ/l 孔加入二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集Y79 細(xì)胞，采用1×結(jié)合緩沖液制備細(xì)胞密度為1×108個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，取0.1 ml 細(xì)胞懸液加入至流式管內(nèi)，分別加入5μl Annexin V-FITC和PI，避光反應(yīng)15 min，補(bǔ)加400 μl 1×結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 合成含有miR-495-3p 結(jié)合位點(diǎn)的LINC00467 野生型序列或突變位點(diǎn)的突變序列，并將野生型/突變型LINC00467 序列克隆至pmirGLO 雙熒光素酶載體，WT-LINC00467、MUT-LINC00467 由上海吉瑪公司構(gòu)建。采用Lipo?fectamine 2000 將報(bào)告載體WT-LINC00467 或MUTLINC00467 分 別 與 miR-495-3p mimic 或 miR-NC 共轉(zhuǎn)染至Y79細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)以表示。采用 SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rb 組織中 LINC00467 和 miR-495-3p 表達(dá) 與正常視網(wǎng)膜組織（1.00±0.06）、（1.02±0.09）相比，Rb 組織中 LINC00963 表達(dá)（4.22±0.41）顯著升高，miR-495-3p表達(dá)（0.58±0.05）顯著降低（P<0.05）。

2.2 抑制LINC00467 表達(dá)對(duì) Y79 細(xì)胞增殖的影響 與轉(zhuǎn)染si-NC 組相比，轉(zhuǎn)染si-LINC00467 后Y79細(xì)胞LINC00467 表達(dá)顯著降低（P<0.05），表明Y79細(xì)胞中LINC00467表達(dá)受抑制。抑制LINC00467表達(dá)，Y79 細(xì)胞24~72 h 細(xì)胞活力顯著降低，CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，p21 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖1、表1。

表1 抑制LINC00467表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

表1 抑制LINC00467表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

Groups LINC00467 OD490 CyclinD1 protein p21 protein si-NC si-LINC00467 t P 1.01±0.06 0.43±0.04 24.129 0.000 24 h 0.29±0.03 0.24±0.03 3.536 0.003 48 h 0.53±0.05 0.37±0.04 7.496 0.000 72 h 0.81±0.08 0.49±0.04 10.733 0.000 0.65±0.06 0.24±0.03 18.336 0.000 0.18±0.02 0.58±0.05 22.283 0.000

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC00467 表達(dá)對(duì)Rb 細(xì)胞Y79 凋亡的影響 與si-NC 組（6.25±0.63）、（0.75±0.07）、（0.27±0.03）相比，抑制 LINC00467 表達(dá)，Y79 細(xì)胞凋亡率（23.47±2.33）顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)（0.31±0.03）顯著降低，Bax 蛋白表達(dá)（0.69±0.06）顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 抑制LINC00467表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting LINC00467 on apoptosis of Y79 cells

2.4 LINC00467 靶向調(diào)控 miR-495-3p 表達(dá) Lnc?Base Predicted v. 2 網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)顯示，LINC00467與miR-495-3p 存在連續(xù)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。雙熒光素酶報(bào)告顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 和WT-LINC 00467 共轉(zhuǎn)染組（1.00±0.06）相比，miR-495-3p mim?ics 和 WT-LINC00467 共轉(zhuǎn)染組（0.52±0.05）Y79 細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與轉(zhuǎn)染miRNC 和MUT-LINC00467 共轉(zhuǎn)染組（1.04±0.07）相比，miR-495-3p mimics 和 MUT-LINC00467 共 轉(zhuǎn) 染 組Y79 細(xì)胞熒光素酶活性（1.01±0.08）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot 檢測(cè)顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA 組（1.00±0.05）相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA-LINC00467 后 Y79細(xì)胞miR-495-3p 表達(dá)（0.55±0.04）顯著降低；與轉(zhuǎn)染 si-NC 組（0.98±0.07）相比，轉(zhuǎn)染si-LINC00467 后Y79 細(xì)胞 miR-495-3p 表達(dá)（2.79±0.27）顯著升高（P<0.001）。

圖3 LINC00467 序列中存在與miR-495-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC00467 contains a nucleotide se?quence complementary to miR-495-3p

2.5 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Rb 細(xì)胞Y79增殖和凋亡的影響 與轉(zhuǎn)染miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimic 后 Y79 細(xì)胞 miR-495-3p 表達(dá)顯著升高（P<0.05），表明 Y79 細(xì)胞 miR-495-3p 表達(dá)上調(diào)成功。過(guò)表達(dá) miR-495-3p，Y79 細(xì)胞 24~72 h 活力顯著降低，凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，p21 和Bax 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖4、表2。

表2 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表2 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Groups miR-495-3p OD490 p21 protein Bcl-2 protein Bax protein miR-NC miR-495-3p t P 1.00±0.06 3.11±0.29 21.375 0.000 24 h 0.28±0.03 0.26±0.03 1.414 0.176 48 h 0.56±0.05 0.41±0.04 7.028 0.000 72 h 0.86±0.07 0.53±0.05 11.509 0.000 Apoptosis rate（%）7.25±0.72 19.47±1.82 18.730 0.000 CyclinD1 protein 0.64±0.06 0.29±0.03 15.652 0.000 0.19±0.02 0.54±0.05 19.498 0.000 0.77±0.07 0.36±0.03 16.151 0.000 0.26±0.03 0.65±0.06 17.441 0.000

圖4 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpressing miR-495-3p on prolifera?tion and apoptosis of Y79 cells

2.6 抑制miR-495-3p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467 對(duì)Rb 細(xì)胞Y79 增殖和凋亡的作用 如圖5、表3 所示，與轉(zhuǎn)染 si-NC 相比，轉(zhuǎn)染 si-LINC00467 后 Y79 細(xì)胞miR-495-3p表達(dá)顯著升高，24~72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，p21 和Bax 蛋白表達(dá)顯著升高；與轉(zhuǎn)染si-LINC00467+anti-miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染 si-LINC00467+anti-miR-495-3p 后 Y79 細(xì)胞 miR-495-3p 表達(dá)顯著降低，24~72 h時(shí)細(xì)胞活力顯著升高，凋亡率顯著降低，CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著升高，p21 和 Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。

圖5 下調(diào)miR-495-3p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467 對(duì)Y79 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Down-regulating miR-495-3p reverses effect of in?hibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells

表3 下調(diào)miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表3 下調(diào)miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with si-LINC00467+anti-miR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-495-3p Apoptosis rate（%）CyclinD1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein si-NC 1.01±0.06 OD490 24 h 0.28±0.03 48 h 0.55±0.05 72 h 0.84±0.087.65±0.740.64±0.060.17±0.020.76±0.070.28±0.03 si-LINC00467 si-LINC00467+anti-miR-NC si-LINC00467+anti-miR-495-3p 2.75±0.271）0.23±0.031）0.38±0.041）2.79±0.28 1.43±0.142）0.22±0.02 0.27±0.022）0.34±0.03 0.49±0.042）0.51±0.051）0.46±0.04 0.72±0.072）22.41±2.241）24.63±2.45 11.05±1.172）0.25±0.031）0.23±0.03 0.53±0.052）0.57±0.051）0.59±0.06 0.29±0.032）0.32±0.031）0.30±0.03 0.64±0.052）0.67±0.061）0.68±0.07 0.39±0.042）171.33512.00051.27374.396193.899190.291210.649208.043132.764 0.000 F P 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

近年研究表明，lncRNA 在Rb 進(jìn)展中具有重要作用。WANG等［9］研究表明，下調(diào)核豐富的轉(zhuǎn)錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）可顯著抑制Rb 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展，增強(qiáng)caspase-3和 caspase-9 活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。LI 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外抑制LINC00152均可顯著抑制Rb細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究揭示了LINC00467在Rb中的作用，并證實(shí)其作用發(fā)揮與調(diào)控miR-495-3p表達(dá)有關(guān)。

LINC00467 位于染色體1q32.3 區(qū)域，全長(zhǎng)2 616 nt。研究顯示，LINC00467 在膠質(zhì)瘤、肺腺癌、宮頸癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，表明LINC00467在上述類(lèi)型腫瘤中起抑癌基因作用［11-14］。但LINC00467 在Rb 中的表達(dá)和作用鮮有報(bào)道。本研究顯示，LINC00467 在Rb 組織中表達(dá)上調(diào)，提示LINC00467可能參與Rb 進(jìn)展。此外，本研究驗(yàn)證了LINC00467的生物學(xué)功能，表明抑制LINC00467 表達(dá)可顯著抑制Y79細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。增殖、凋亡關(guān)鍵蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00467 表達(dá)可降低CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)，升高 p21 和 Bax 蛋白表達(dá)，表明LINC00467在Rb中起致癌基因作用。

lncRNA 通過(guò)與miRNA 結(jié)合降低其表達(dá)發(fā)揮ceRNA 功能是其參與腫瘤調(diào)控的重要機(jī)制。研究顯示，核內(nèi)小RNA 宿主基因16（small nuclear RNA host gene 16，SNHG16）通過(guò)海綿miR-140-5p 促進(jìn)人Rb 進(jìn)展［15］；抑制同源盒基因 A11 反義 RNA（homolo?gous box gene A11 antisense RNA，HOXA11-AS）通過(guò)上調(diào)miR-506-3p 表達(dá)可明顯抑制Rb 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G/1G0期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16］。本研究以miR-495-3p 作為L(zhǎng)INC00467 的下游靶點(diǎn)，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RT-qPCR 證實(shí)LINC00467對(duì)miR-495-3p的靶向負(fù)調(diào)控作用。既往研究顯示，miR-495-3p 在結(jié)腸癌、黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)，抑制NEAT1通過(guò)上調(diào)miR-495-3p可觸發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［17-18］。此外，miR-495-3p 還是胃癌細(xì)胞自噬平衡和多藥耐藥的重要調(diào)節(jié)因子［19］。本研究顯示，miR-495-3p 在Rb 組織中表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics 上調(diào)其表達(dá)可抑制Y79 細(xì)胞增殖，抑制Cy?clinD1 和 Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn) p21 和 Bax 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制miR-140-5p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對(duì)Y79細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。表明LINC00467 通過(guò)miR-140-5p 參與Y79細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控。

綜上所述，本研究表明，LINC00467 在 Rb 中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與miR-506-3p 直接作用在Rb 發(fā)生中發(fā)揮致癌作用。因此，LINC00467 有望成為Rb 潛在治療靶點(diǎn)。