基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析“金銀花-苦參”治療表皮生長因子受體抑制劑皮膚毒性的分子機(jī)制

徐晶鈺，張 璇，王曉煒，陸 燁，裴 蓓，魏品康

(1. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，上海 200003；2. 中國人民解放軍海軍第905醫(yī)院，上海 200052)

全球范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率、病死率每年逐步提升，使人民的生命健康受到嚴(yán)重威脅，并加重了國家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。如何診治惡性腫瘤一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著科研技術(shù)與方法的持續(xù)更新，針對惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的靶向藥物不斷被研發(fā)，患者臨床獲益日漸明顯[2]。表皮生長因子受體抑制劑(epidermal growth factor receptor inhibitors，EGFRI)是臨床上使用最為廣泛、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最為充分的靶向藥物，常見的EGFRIs包括吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、西妥昔單抗等。目前公布的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)在多種晚期實(shí)體腫瘤中，EGFRIs的使用使患者臨床癥狀明顯緩解，生活質(zhì)量得到改善，中位生存期顯著延長[3]。基礎(chǔ)研究證實(shí)EGFRIs能對腫瘤病程進(jìn)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——EGFR信號通路進(jìn)行調(diào)控，對腫瘤細(xì)胞起到干預(yù)增殖、加速凋亡、抑制侵襲遷移、影響新生血管生成等多種作用[4]。EGFR不僅是跨膜酪氨酸激酶生長因子受體的重要組成部分，而且也是原癌基因c-erbB1活化后的特定產(chǎn)物，廣泛分布于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞膜表面及成熟毛囊的外根鞘部位[5]。抑制EGFR信號通路雖然可以干預(yù)腫瘤病程進(jìn)展，對腫瘤控制有益，但同樣對皮膚及其附屬器產(chǎn)生毒副作用，使正常皮膚結(jié)構(gòu)出現(xiàn)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)丘疹膿皰樣疹、皮膚皸裂、皮膚干燥脫屑瘙癢、指甲或甲周改變、毛發(fā)脫落、卷曲、皮膚黑變、光敏反應(yīng)等毒副作用[6]，病情嚴(yán)重者甚至需要減量或停藥，影響患者療效。目前針對本病并無特殊治療藥物，多采用對癥治療，常用藥物如局部使用激素、抗生素、皮膚保護(hù)劑等，療效并不明顯[7]。因此尋找既能增強(qiáng)EGFRIs抗腫瘤療效，同時(shí)又能緩解皮膚毒性反應(yīng)的藥物具有十分明確的臨床意義。中醫(yī)藥因其具有“異病同治”“內(nèi)病外治”等特殊治療特色，在本病的治療上受到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)研究表明，金銀花、苦參是治療EGFRIs皮膚毒性的最常用兩味中藥[8]，但具體機(jī)制并未完全清楚。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析金銀花、苦參藥對治療EGFRIs皮膚毒性的分子作用機(jī)制，以期為該藥對的實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1EGFRIs相關(guān)皮膚毒性靶點(diǎn)搜集 EGFRIs相關(guān)皮膚毒性患者最常見癥狀為痤瘡樣皮疹和皮膚瘙癢，因此以“acne”“pruritus”“rash”“Dermatitis”作為檢索詞，通過CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)，OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并將以上數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)匯總并除去重復(fù)值，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對靶點(diǎn)信息進(jìn)行校正，從而建立EGFRIs相關(guān)皮膚毒性靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2金銀花、苦參成分及靶點(diǎn)搜集 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)得到金銀花、苦參含有的化合物成分，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)特性(ADME)參數(shù)篩選活性成分，同樣通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正。

1.3共有靶點(diǎn)篩選及共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助Genomics平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選金銀花、苦參兩味中藥與疾病的共有靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING平臺(https://string-db.org/)構(gòu)建共有靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4金銀花、苦參“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥化合物成分和共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape(3.7.2)軟件(http://cytoscapeweb. cytoscape.org/)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape軟件內(nèi)置的Network Analyzer工具進(jìn)行可視化分析。關(guān)注“節(jié)點(diǎn)”(node)與“邊”(edge)。node表示中藥化合物成分和疾病靶點(diǎn)，edge表示二者之間的關(guān)系。用度值(Degree)評價(jià)藥物成分和靶點(diǎn)的重要程度，度值表示網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點(diǎn)相連路徑條數(shù)，數(shù)值越大表明該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要。借此研究金銀花、苦參兩味中藥中較為重要的成分、靶點(diǎn)及二者之間的關(guān)系。

1.5GO分類、KEGG 通路富集分析 使用R語言(R version 3.6.3，http://www.r-project.org/)進(jìn)行基因本位(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集(P<0.05)，結(jié)果以氣泡圖顯示。GO富集分析包括分子功能(Molecular Function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)3個(gè)部分，可闡述關(guān)鍵靶點(diǎn)的抗EGFRIs皮膚毒性的生物過程；KEGG富集分析，揭示關(guān)鍵靶點(diǎn)抗EGFRIs皮膚毒性的主要信號通路。

1.6“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.5中KEGG富集分析出的通路結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)分析，取排名前20的通路，并將金銀花、苦參有效成分和基于KEGG結(jié)果所映射的相關(guān)靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選金銀花、苦參藥對治療EGFRIs皮膚毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路。

2 結(jié) 果

2.1EGFRIs皮膚毒性及金銀花、苦參成分和靶點(diǎn)搜集 通過CTD、OMIM、Drugbank、Disgenet數(shù)據(jù)庫篩選出541個(gè)疾病靶點(diǎn)。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，根據(jù)設(shè)定ADME篩選標(biāo)準(zhǔn)納入金銀花成分15個(gè)，苦參成分22個(gè)，二者重復(fù)成分1個(gè)，刪除重復(fù)值后共得到210個(gè)藥物靶點(diǎn)信息。

2.2共有靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將金銀花、苦參和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Genomics平臺構(gòu)建韋恩圖取交集，篩選共有靶點(diǎn)，見圖1。將48個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺構(gòu)建靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2A。網(wǎng)絡(luò)中包含48個(gè)節(jié)點(diǎn)，319條邊，Degree平均值為13.3。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件作圖并計(jì)算節(jié)點(diǎn)Degree值。予中位數(shù)(12，19，25)進(jìn)行Degree劃分，Degree≥25的節(jié)點(diǎn)是：AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、IL1B、EGFR、PTGS2，ALB，見圖2B及表1。

圖1 EGFRIs皮膚毒性和金銀花、苦參藥對靶點(diǎn)維恩圖

圖2 EGFRIs皮膚毒性和金銀花、苦參藥對共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中EGFRIs皮膚毒性和金銀花、苦參藥對共有靶點(diǎn)

2.3金銀花、苦參成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將金銀花、苦參化合物成分和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，可知槲皮素作用于AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、IL1B、EGFR、PTGS2，山奈酚作用于AKT1、PTGS2，木犀草素作用于AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、EGFR、PTGS2，beta-谷甾醇作用于PTGS2，即槲皮素、山奈酚、木犀草素、beta-谷甾醇既是金銀花、苦參中的重要化合物成分，也是治療EGFRIs皮膚毒性的潛在藥物成分。兩味中藥化合物成分中Degree前4的成分是MOL000098(槲皮素，quercetin)、MOL000422(山奈酚，kaempferol)、MOL000006(木犀草素，luteolin)、MOL000358(beta-谷甾醇，beta-sitosterol)，見表2。

圖3 金銀花、苦參“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 金銀花、苦參藥對成分化合物(按Degree值取前十)

2.4GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，48個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)共得到 686個(gè)富集結(jié)果。其中包括生物過程(BP)391項(xiàng)，主要涉及細(xì)胞對藥物、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)、異源生物刺激的反應(yīng)等；分子功能(MF)43項(xiàng)，主要涉及G蛋白耦聯(lián)的胺受體和神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、細(xì)胞因子受體活性、抗氧化活性、磷酸酶結(jié)合等；細(xì)胞組成(CC)49項(xiàng)，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、突觸前膜、突觸后膜等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，48個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)共參與103條信號通路過程，篩選排名前 20位的信號通路。用R語言繪制GO和KEGG通路富集分析氣泡圖，見圖4。每張圖左側(cè)為排名靠前的富集名稱，氣泡顏色由紅到藍(lán)代表校正后p值從小到大，氣泡越大代表該通路的基因計(jì)數(shù)(Count)越大，橫軸代表該通路基因所占總體輸入基因的比率(Ratio)。綜合文獻(xiàn)分析，與本病相關(guān)的包括MAPK信號通路、VEGF信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。

圖4 金銀花、苦參藥對GO富集及KEGG通路富集氣泡圖

2.5“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為進(jìn)一步揭示信號通路與候選靶標(biāo)及化合物之間的關(guān)系，構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖5。 從網(wǎng)絡(luò)中可知，PTGS2、MAPK14、MAPK1、AKT1、IL6、VEGFA、EGFR、IL1B具有較大的Degree值，分別為37，22，22，21，15，15，14，13，以上靶點(diǎn)較前述PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果中增加MAPK14，減少ALB，而化合物中前四位與“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中一致。

圖5 金銀花、苦參藥對“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

EGFRIs皮膚毒性屬于中醫(yī)外科學(xué)中“藥毒疹”的疾病范疇?！岸尽笔侵杆幬镏?，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中等同于毒副作用。患者久病體虛，復(fù)感藥物之毒，損傷肌表，常見皮膚毒性具有皮疹、膿皰、紅斑、瘙癢等，故EGFRIs引起的藥毒之性應(yīng)屬溫?zé)嵝浴＜又∧w衛(wèi)外功能減弱，易受風(fēng)、濕、熱、火等外邪侵犯，熱、火、濕、風(fēng)等相互搏擊，郁于皮膚腠理導(dǎo)致本病發(fā)生。目前清熱祛風(fēng)、解毒燥濕為中醫(yī)治療EGFRIs皮膚毒性的基本原則。鄧博等[8]通過臨床數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)金銀花、苦參是治療EGFRIs皮膚毒性的最常用中藥。金銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，為治一切內(nèi)癰外癰之要藥；苦參清熱燥濕、解毒殺蟲，與金銀花配伍無論內(nèi)服外治對EGFRIs皮膚毒性均有療效，但二者治療本病的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步完善。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了金銀花、苦參治療EGFRIs皮膚毒性的作用機(jī)制。在 PPI構(gòu)建的疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，根據(jù)Degree值的中位數(shù)計(jì)算，AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、IL1B、EGFR、PTGS2，ALB的節(jié)點(diǎn)Degree值排名靠前，但在最后建立的“藥物成分-作用靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)中，與前述節(jié)點(diǎn)相比，增加MAPK14，減少ALB。說明ALB與通路相關(guān)性不大，故PTGS2、MAPK14、MAPK1、AKT1、IL6、VEGFA、EGFR、IL1B這8個(gè)節(jié)點(diǎn)可能在本病治療中起到關(guān)鍵作用。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞膜表面廣泛分布，參與了細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移等重要生物學(xué)進(jìn)程[9]。因此EGFRIs雖然可以干預(yù)腫瘤病程進(jìn)展，但同樣對皮膚及其附屬器產(chǎn)生毒副作用，這也是EGFRIs皮膚毒性發(fā)生的主要原因[10]。EGFRIs將破壞皮膚的完整性，這一病理過程將在局部招募大量炎癥相關(guān)因子、趨化因子，誘導(dǎo)皮膚出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)[11]。IL-6、IL1B是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，與炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[12]；PTGS2又名COX-2，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶，與炎癥和有絲分裂發(fā)生相關(guān)的前列腺素生物合成有關(guān)[13]；MAPK1、MAPK14在MAPK通路中處于核心地位，廣泛參與了細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激等活動(dòng)，其中MARK14扮演的是炎癥信號的角色[14]。AKT1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與角質(zhì)形成細(xì)胞及毛囊等附屬器細(xì)胞的生長與代謝相關(guān)[15]；VEGFA 是血管生成刺激因子，影響內(nèi)皮細(xì)胞的血管通透性，可促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合，修復(fù)受損皮膚[16]。

在“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”中，通過計(jì)算金銀花、苦參中成分化合物的Degree值，選擇槲皮素、山奈酚、木犀草素、beta-谷甾醇進(jìn)行分析。槲皮素化學(xué)名為 3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮，分子式為C15H10O7，生物學(xué)活性豐富，藥理學(xué)作用多樣，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[17]；山奈酚作為蛋白激酶抑制劑，可有效阻止炎癥介質(zhì)的釋放，減輕其對機(jī)體損傷[18]；金銀花有效成分木犀草素在植物的次級代謝產(chǎn)物中含量豐富，同樣具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌和抗腫瘤特性[19]，含有高木犀草素含量的中藥在炎癥相關(guān)的疾病治療中扮演了重要角色[20]。β-谷甾醇作為植物中甾醇類重要組成部分之一，屬于四環(huán)三萜類化合物，同時(shí)也是人體細(xì)胞膜的主要成分。生物功能主要包括抗氧化、抗炎、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和抗腫瘤等[21]。根據(jù)文獻(xiàn)分析以上4種成分共性中比較重要的仍是抗炎、抗氧化及抗腫瘤，但進(jìn)一步根據(jù)節(jié)點(diǎn)Degree值考慮炎癥反應(yīng)與本病發(fā)生最為密切。

在人體多種炎癥反應(yīng)中，槲皮素可以通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)而起到抗炎作用。如人為對大鼠大腦中動(dòng)脈進(jìn)行閉塞后導(dǎo)致的腦缺血模型中，給予槲皮素治療，發(fā)現(xiàn)其可以通過上調(diào)IL-4、IL-10和TGF-β1等抗炎細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子表達(dá)，從而對腦缺血后炎癥導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷起到明顯的改善作用[22]。在軟骨組織破壞的過程中，促炎性細(xì)胞因子IL-1β促使前列腺素E2和一氧化氮活化介導(dǎo)的炎性反應(yīng)發(fā)生是這一病理改變的誘因，山奈酚不僅能抑制該炎性通路的活化，還能使膠原蛋白等合成加速，從而明顯促進(jìn)破壞的軟骨組織的修復(fù)[23]。動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)木犀草素具有的抗炎作用可能是通過阻止前列腺素E2的釋放及NF-κB的磷酸化入核，進(jìn)而抑制炎性因子COX-2的表達(dá)。在大鼠足部炎癥模型中，木犀草素可明顯抑制前列腺素E2合成，下調(diào)其表達(dá)，從而顯著降低炎足爪中COX-2蛋白表達(dá)[24]。在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，木犀草素能顯著抑制前列腺素E2的表達(dá)，使NF-κB的DNA結(jié)合活性減弱，從而降低COX-2的表達(dá)[25]。對C57BL/6J雄性小鼠采用葡聚糖酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，β-谷甾醇灌胃可減緩結(jié)腸縮短，使糞便中血紅素含量受到抑制，并且使結(jié)腸炎病理學(xué)評分得到顯著改善，這一過程可能是通過下調(diào)IL-6和COX-2 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[26]。

GO富集分析表明金銀花、苦參可調(diào)控細(xì)胞對藥物、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)、異源生物刺激等生物進(jìn)程，干預(yù)G蛋白耦聯(lián)的胺受體和神經(jīng)遞質(zhì)受體、細(xì)胞因子受體、抗氧化活性等分子功能，影響細(xì)胞組成涉及的膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、突觸前膜、突觸后膜等區(qū)域。根據(jù)文獻(xiàn)對KEGG富集通路進(jìn)一步篩選，排除不相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)金銀花、苦參治療EGFRIs相關(guān)皮膚毒性主要集中在炎癥通路(MAPK通路、IL-17信號通路、TNF信號通路)及VEGF相關(guān)通路。前文中8個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在以上通路中富集度也高。說明靶點(diǎn)預(yù)測與KEGG的富集分析基本一致。文獻(xiàn)報(bào)道金銀花、苦參能顯著抑制炎癥反應(yīng)，從而對本病起到有效治療作用，但具體生物學(xué)特性和相關(guān)通路的研究尚缺乏大數(shù)據(jù)驗(yàn)證。VEGF信號通路與血管生成聯(lián)系緊密，有利于皮膚的修復(fù)，因此中藥有可能通過激活VEGF通路治療本病，但這與抗腫瘤機(jī)制相悖?？紤]腫瘤部位環(huán)境復(fù)雜，存在大量的病理性血管生成，與正常血管生成區(qū)別較大，因此金銀花、苦參在不同的部位對同樣的通路作用效果也可能存在差異，值得進(jìn)一步探討。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了金銀花、苦參藥對治療EGFRIs皮膚毒性的機(jī)制，闡明了中藥通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑對疾病進(jìn)行調(diào)控的思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物活性成分-靶點(diǎn)”“成分-靶點(diǎn)-通路”等網(wǎng)絡(luò)，從分子水平揭示靶點(diǎn)和疾病之間的相互關(guān)系和潛在機(jī)制，是目前了解中藥復(fù)方的熱點(diǎn)方法[20]。由于EGFRIs皮膚毒性的治療靶點(diǎn)與腫瘤治療靶點(diǎn)部分相悖，因此需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)深入研究金銀花、苦參在腫瘤、皮膚病變部位存在雙向調(diào)節(jié)機(jī)制的可能性，或者明確作用過程中是否有新化合物的產(chǎn)生。本研究的結(jié)論將為治療本病的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。