血必凈注射液在內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)脂多糖誘導(dǎo)的腎內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制

卓 劍,鄭武平,溫江華，吳英春，陳 松

(1. 海南省萬(wàn)寧市人民醫(yī)院，海南 萬(wàn)寧 571500；2. 海南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，海南 ?？?570102)

膿毒癥是由嚴(yán)重全身感染引起炎性反應(yīng)過(guò)度激活及凝血功能障礙所致的臨床綜合征，可以導(dǎo)致多器官功能障礙，其中急性腎衰竭發(fā)生率約為19%，在重度膿毒癥中發(fā)病率約為23%，膿毒癥并發(fā)急性腎衰竭的病死率高達(dá)70%[1-3]。內(nèi)皮祖細(xì)胞具有促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)及缺血性血管新生的作用，近年來(lái)在肢體缺血性疾病及心血管疾病等領(lǐng)域有關(guān)內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究非常活躍[4]。血必凈注射液具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，可以拮抗內(nèi)毒素并抑制內(nèi)源性炎性介質(zhì)，有抗炎作用，包括阻止白細(xì)胞的黏附和激活，抑制補(bǔ)體激活，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免遭一些破壞物質(zhì)如趨化因子、組胺、緩激肽、細(xì)菌內(nèi)毒素、溶酶體陽(yáng)離子蛋白和氧自由基的損傷，保持血管內(nèi)皮細(xì)胞膜感應(yīng)性和完整性等[5-7]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)探討了血必凈注射液在內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腎內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制，旨在為急性腎衰竭的臨床治療提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料 大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；CD133、CD45、CD31、CD31、NF-κB、第Ⅷ因子、GAPDH抗體、熒光二抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)；血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040033)；Matrigel膠(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)；cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒(凱基生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞提取

1.2.1大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取 將2只SPF級(jí)健康SD大鼠(6～7周齡，體重200～220 g，購(gòu)自北京斯貝福生物公司，許可證號(hào)：SYXK-2017-0005)頸椎脫臼處死，使用75%酒精溶液浸泡消毒后，于無(wú)菌超凈工作臺(tái)中解剖去股骨和脛骨，PBS清洗后，去除股骨和脛骨兩端的干骺端，使用勻漿沖洗液反復(fù)沖洗骨髓腔，并使用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾骨髓沖洗液，收集沖洗液，450×g離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，重選細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為1×1012/L。根據(jù)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書(shū)將分離液1、分離液2、細(xì)胞懸液按3∶1∶1的比例混合，1 000×g離心30 min，吸取白膜內(nèi)皮祖細(xì)胞層，使用洗滌液清洗2次后使用差異貼壁法純化內(nèi)皮祖細(xì)胞，使用EGM-2培養(yǎng)基重選細(xì)胞，并接種至纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，48 h后清洗去除未貼壁的細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)消化傳代。

1.2.2腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取 將健康雌雄大鼠混養(yǎng)，待雌鼠孕育健康胎鼠后取出2只,水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后打開(kāi)腹腔,取出腎臟；放入37 ℃ PBS(加雙抗)中，去除被膜，沿充血區(qū)周?chē)べ|(zhì)區(qū)取一薄層，剪碎加入0.125%預(yù)熱的胰酶(7.5 mL)，37 ℃震蕩水浴35 min, 吹打10～15 min, 加入0.1%預(yù)熱的膠原酶Ⅱ(約7.5 mL)37 ℃震蕩水浴30 min,繼續(xù)吹打10～15 min；100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后，底物100×g離心，去上清，加入20% DMEM制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中；5% CO2、37 ℃條件下飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)3 d，顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，第Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)法檢查進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3細(xì)胞鑒定

1.3.1大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定 使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定：調(diào)整內(nèi)皮祖細(xì)胞密度為1×106/mL，于100 μL流式管中分別與待測(cè)抗體CD133、CD45、CD31、CD31、Flk-1以及相應(yīng)的同型抗體4 ℃避光共孵育30 min，清洗3次后，使用0.5 mL固定液重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)CD31、CD31、Flk-1，而不表達(dá)CD133和CD45，證實(shí)為內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.3.2腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 采用免疫熒光法鑒定：將腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁，去除培養(yǎng)基后用PBS清洗3次，然后加入4%的多聚甲醛溶液固定15 min，PBS清洗3次后，使用0.5%TritonX-100室溫通透20 min，PBS清洗3次后，加入5%的胎牛血清封閉30 min，清洗后每孔加入適量的第Ⅷ因子一抗稀釋液，4 ℃固定過(guò)夜，TBST清洗3次后，每孔加入稀釋后的熒光二抗，避光染色1 h，清洗后滴加DAPI染料染色5 min，TBST洗去多余的DAPI染料，于熒光顯微鏡下觀察拍照，證實(shí)為腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.4分組及細(xì)胞共孵育 取腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分為空白組、模型組、CM+LPS組、CM+LPS+血必凈12.5 mg/mL組、CM+LPS+血必凈25 mg/mL組、CM+LPS+血必凈50 mg/mL組；收集內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基(CM)，0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌?？瞻捉M給予正常培養(yǎng)，模型組給予含LPS 10 mg/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余組給予含LPS 10 mg/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入CM及相應(yīng)濃度血必凈注射液培養(yǎng)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，每孔按照1.4各組干預(yù)方案共孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育4 h后每孔更換為150 μL的二甲亞砜溶液，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量每孔的吸光度(OD)值，OD值越大提示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.5.2Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，按照1.4各組干預(yù)方案與Transwell小室中配置200 μL共孵育體系，每個(gè)小室接種10 000個(gè)細(xì)胞，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL完全培養(yǎng)基，使小室底部浸入培養(yǎng)基，將24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用無(wú)水乙醇固定30 min，晾干后用結(jié)晶紫對(duì)小室底部染色10 min，清洗晾干后，在顯微鏡下觀察拍照，每孔拍5張照片，并用Photoshop軟件計(jì)數(shù)，比較各組遷移的細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞數(shù)目越多提示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.5.3小管形成實(shí)驗(yàn) 4℃條件下融化Matrigel膠，96孔板中每孔加入50 μL Matrigel膠，輕輕搖晃96孔板，使Matrigel膠均勻覆蓋于96孔板底部，37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min，使Matrigel膠充分凝固。按照1.4各組干預(yù)方案配置共孵育體系，并調(diào)整腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL，于96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞混合液，每組3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后在顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計(jì)算小管形成數(shù)量。

1.5.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，取各組孵育24 h后的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞5×105個(gè)于離心管中，用500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，而后添加5 μL的Annexin V-FLTC和5 μL的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設(shè)置Annexin V-FLTC和PI單陽(yáng)性管用于調(diào)熒光補(bǔ)償，空白管用于調(diào)電壓；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述各樣品的熒光值，使用FlowJo 7.6.1軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.5.5qRT-PCR法檢測(cè)腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)情況 取各組孵育24 h后的細(xì)胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，將200 μL氯仿加入上述裂解液，靜置5 min，4 ℃下12 000×g離心15 min，取上層溶液，加入500 μL異丙醇，4 ℃下12 000×g離心10 min，棄上清，1 mL 75%酒精清洗RNA沉淀后，20 μL RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量?jī)x檢測(cè)總RNA含量。根據(jù)miRNA cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應(yīng)體系，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用核酸定量?jī)x對(duì)cDNA進(jìn)行定量。然后根據(jù)EvaGreen qPCR試劑盒指示配置反應(yīng)體系，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，采用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)后采用2-ΔΔCt法計(jì)算VEGF和bFGF的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：VEGF上游為5’-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3’，下游為5’-AATCCCATCACCATCTTCCA-3’；bFGF上游為5’-ATCACTTCGCTTCCCGCACT-3’，下游為5’-TCCAGGCGTTCAAAGAAGAAAC-3’；GAPDH上游為5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，下游為5’-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3’。

1.5.6Western blot法檢測(cè)腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)情況 取各組孵育24 h后的細(xì)胞加入125 μL的RIPA蛋白裂解液和5 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，裂解30 min后，4 ℃下12 000×g離心10 min，取上清，即為總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2h，然后以1∶1 000比例稀釋后的NF-κB、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育12 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力比較 模型組細(xì)胞增殖檢測(cè)OD值明顯低于空白組(P<0.05)；CM+LPS組及血必凈各組細(xì)胞增殖檢測(cè)OD值均明顯高于模型組(P均<0.05)，且血必凈各組均明顯高于CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組呈劑量依賴(lài)性增高(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力

2.2各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力比較 模型組細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于空白組(P<0.05)；CM+LPS組及血必凈各組細(xì)胞遷移數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，且血必凈各組均明顯多于CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組呈劑量依賴(lài)性增多(P均<0.05)。見(jiàn)圖2及圖3。

圖2 鏡下觀察各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移情況(×200)

圖3 各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)比較

2.3各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力比較 模型組細(xì)胞小管形成數(shù)明顯少于空白組(P<0.05)；CM+LPS組及血必凈各組細(xì)胞小管形成數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，且血必凈各組均明顯多于CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組呈劑量依賴(lài)性增多(P均<0.05)。見(jiàn)圖4及圖5。

圖4 鏡下觀察各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成情況(×200)

圖5 各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成數(shù)比較

2.4各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況比較 空白組細(xì)胞凋亡率為(7.22±0.23)%；模型組細(xì)胞凋亡率為(38.34±1.03)%，顯著高于空白組(P<0.05)；CM+LPS組細(xì)胞凋亡率為(26.63±1.12)%，顯著低于模型組(P<0.05)；CM+LPS+血必凈12.5 mg/mL組、CM+LPS+血必凈25 mg/mL組、CM+LPS+血必凈50 mg/mL組細(xì)胞凋亡率分別為(18.08±1.23)%、(15.32±0.87)%、(10.13±1.00)%，均顯著低于模型組和CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組呈劑量依賴(lài)性降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況

2.5各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和bFGF表達(dá)情況比較 模型組細(xì)胞中VEGF、bFGF相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05)；CM+LPS組及血必凈各組細(xì)胞中VEGF、bFGF相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且血必凈各組均明顯高于CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組呈劑量依賴(lài)性增高(P均<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和bFGF相對(duì)表達(dá)量比較

2.6各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)情況比較 模型組細(xì)胞中NF-κB相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05)；CM+LPS組及血必凈各組細(xì)胞中NF-κB相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且血必凈各組均明顯低于CM+LPS組(P均<0.05)，血必凈各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖8及圖9。

A為空白組；B為模型組；C為CM+LPS組；D為CM+LPS+血必凈12.5 mg/mL組；E為CM+LPS+血必凈25 mg/mL組；F為 CM+LPS+血必凈50 mg/mL組圖8 Western blot法檢測(cè)各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)情況

圖9 各組腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

正常血管內(nèi)皮具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌功能，同時(shí)也是抗原提呈細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞可以被內(nèi)毒素等激活,參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程，可以啟動(dòng)炎癥和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致腎臟的損傷[8]。研究表明，15%～20%的ICU患者存在急性腎損傷，并且有近一半的急性腎損傷是由膿毒血癥引起的[9]。VEGF和bFGF為致纖維化因子，在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的異常表達(dá)可導(dǎo)致腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化[10]。LPS可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷[11]，可模擬膿毒血癥誘導(dǎo)的器官損傷，所以本研究利用LPS誘導(dǎo)大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外損傷，并觀察了VEGF和bFGF的表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后，腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、小管形成能力均顯著下降，細(xì)胞凋亡顯著增加，血管生成因子VEGF和bFGF表達(dá)下調(diào)，證實(shí)LPS可引起腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種骨髓干細(xì)胞，表達(dá)促血管生成的相關(guān)因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可促進(jìn)血管新生，為缺血性疾病、血管組織工程及腫瘤治療提供了新的思路和手段[4]。血必凈注射液的主要成分是赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸，具有拮抗內(nèi)毒素，改善微循環(huán)和保護(hù)內(nèi)皮功能的作用，可緩解因感染、創(chuàng)傷、燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征，可減輕內(nèi)毒素所致小鼠急性腎損傷[11-12]。在上述研究基礎(chǔ)上，本研究探討了血必凈注射液對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)腎損傷細(xì)胞作用的影響。結(jié)果顯示，將內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基與腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后，與模型組比較，細(xì)胞的增殖、遷移、小管形成能力和VEGF、bFGF表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡顯著減少，說(shuō)明內(nèi)皮祖細(xì)胞可修復(fù)LPS誘導(dǎo)的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；而在與內(nèi)皮祖細(xì)胞共孵育的同時(shí)加入血必凈注射液后，腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、小管形成能力及VEGF、bFGF表達(dá)更高，細(xì)胞凋亡更少，說(shuō)明血必凈注射液能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)LPS誘導(dǎo)的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

NF-κB作為一種存在于細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，NF-κB信號(hào)通路被激活后促進(jìn)膿毒癥炎癥因子的大量生成引起細(xì)胞損傷[13-14]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)顯著增加，說(shuō)明LPS可誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基與腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后NF-κB表達(dá)降低，加入血必凈注射液治療后，NF-κB表達(dá)進(jìn)一步降低，說(shuō)明血必凈注射液聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞可顯著抑制NF-κB信號(hào)通路。

綜上所述，血必凈注射液能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、小管形成能力和VEGF、bFGF表達(dá)，從而加強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

致謝：特別感謝海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院徐偉老師在實(shí)驗(yàn)研究中提供的幫助！

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。