小豆幼苗對(duì)低溫脅迫的生理應(yīng)激及烯效唑的緩解效應(yīng)

項(xiàng)洪濤，李 琬，何 寧，劉 佳，王詩(shī)雅，王曼力，王彤彤，楊純杰

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué) 院耕作栽培研究所，哈爾濱 150086；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

小豆(Vignaangularis)是喜溫喜光不耐冷、短日照作物，是我國(guó)重要的食用豆類作物之一，近年來種植面積逐漸增加。小豆對(duì)溫度敏感，最適生育溫度為20～24℃，低于該溫度即發(fā)生低溫脅迫甚至產(chǎn)生冷害[1]。低溫影響植物生長(zhǎng)和代謝，使植株體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基大量積累，未被及時(shí)清除的ROS積累在植物體內(nèi)，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂過氧化傷害[2]，影響作物正常的理化代謝功能和途徑。李海燕等[3]研究表明，低溫脅迫使H2O2含量顯著增加，低溫時(shí)間越長(zhǎng)，增加趨勢(shì)越明顯。張愛冬等[4]也指出，隨著溫度降低，植物葉片H2O2含量呈上升趨勢(shì)，促使細(xì)胞膜透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，加劇膜質(zhì)過氧化作用。項(xiàng)洪濤等[5]指出，低溫導(dǎo)致植物體內(nèi)MDA含量增加，并隨脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間而增多。鄧化冰等[6]也得出相似結(jié)論，認(rèn)為低溫導(dǎo)致植物葉片MDA含量顯著增加，加劇膜質(zhì)過氧化程度，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，質(zhì)膜透性加大，電解質(zhì)外滲，從而影響葉片的生理生化機(jī)能。

烯效唑(uniconazole)，簡(jiǎn)稱S3307，是一種具有廣譜、高效、低毒、低殘留特點(diǎn)的植物生長(zhǎng)延緩劑，S3307有提高作物產(chǎn)量的作用，常被用在調(diào)控作物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)抗逆性的等方面[7]。相關(guān)研究表明，低溫條件下，S3307能顯著提高秋茄幼苗的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性[8]，可以顯著提高水稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[5]，顯著降低綠豆ROS類物質(zhì)以及丙二醛(MDA)的積累[9]，顯著提高大豆的產(chǎn)量[10]。綜上可以看出S3307能夠有效緩解作物的低溫脅迫，但鮮有關(guān)于S3307提高小豆幼苗抗性的報(bào)道。葉片是小豆重要的光合器官，起到合成并供給同化產(chǎn)物的重要作用，當(dāng)小豆受到低溫脅迫時(shí)，葉片生理代謝會(huì)受到阻礙并影響幼苗建植，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此本試驗(yàn)于幼苗期對(duì)小豆進(jìn)行低溫處理，開展低溫脅迫及預(yù)噴施S3307對(duì)小豆葉片抗逆生理及產(chǎn)量的影響研究，旨在分析S3307緩解小豆苗期低溫的作用，豐富東北地區(qū)小豆抗冷技術(shù)工程體系，為小豆耐冷栽培、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小豆品種為耐冷品種龍小豆4號(hào)和冷敏品種天津紅，材料由國(guó)家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蕓豆育種崗位專家魏淑紅研究員饋贈(zèng)。

供試植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為烯效唑(S3307)，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)化控研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所盆栽場(chǎng)及人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。采用盆栽方式，試驗(yàn)用盆高30 cm、直徑25 cm，每盆裝自然風(fēng)干壤土7.0 kg，播種后覆土200 g，每盆保苗15株(5穴×3株)。試驗(yàn)用土取自哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)，土壤類型為草甸黑土。供試土壤的理化性質(zhì)：土壤容重約1.72 g·cm-3，最大田間持水量約25.65%，有機(jī)質(zhì)含量2.63%、全氮1.46 mg·g-1、全磷0.66 mg·g-1、緩效鉀325.7 mg·kg-1、堿解氮165.0 mg·kg-1、速效磷41.25 mg·kg-1、速效鉀156.7 mg·kg-1、土壤pH6.69。4月18日播種(陽光型人工氣候室內(nèi)播種，哈爾濱地區(qū)4月中旬室外溫度相對(duì)偏低，不利出苗)，每品種分別播種75桶，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的樣本進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，具體設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

于幼苗期(4月30日，此時(shí)真葉完全展開，第一片復(fù)葉露頭)進(jìn)行低溫處理，處理溫度為恒定4℃。進(jìn)行低溫處理當(dāng)天上午10∶00，采取葉面噴施方式施用S3307，使用濃度20 mg·L-1，折合用液量22.5 mL·m-2(使用濃度和使用劑量為本課題組前期試驗(yàn)所得)。噴施完畢后，于當(dāng)晚20∶30進(jìn)入事先預(yù)冷的人工氣候室冷房?jī)?nèi)進(jìn)行低溫處理，持續(xù)時(shí)間12 h，CK處理溫度人工氣候室內(nèi)自然溫度(當(dāng)日夜間溫度為17℃)，次日上午8∶30停止低溫處理。并進(jìn)行第一次取樣，之后每天上午8∶30順延進(jìn)行下一次取樣，共取樣5 d，記為取樣第1天～第5天。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1取樣方法

低溫處理后，連續(xù)取樣5次，每天上午8∶30取樣一次，各處理分別進(jìn)行取樣，將小豆植株葉片迅速剪下裝入標(biāo)記好的自封袋內(nèi)，并立即放入液氮中，而后置于-80℃冰箱中保存，待測(cè)生理指標(biāo)。

1.3.2測(cè)定方法

按照李合生等[11]的方法采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性、愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)活性、采用分解過氧化氫含量速率法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性、采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，過氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定采用碘化鉀法[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)利用Excel2010進(jìn)行處理和作圖，使用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)小豆幼苗葉片膜損傷的影響

2.1.1對(duì)葉片H2O2含量的影響

由圖1可知，幼苗期低溫處理后，小豆葉片H2O2含量快速升高，隨著取樣時(shí)間的延續(xù)，小豆葉片H2O2含量呈下降趨勢(shì)。對(duì)龍小豆4號(hào)來說，第1天和第2天取樣時(shí)，H2O2含量均為T2>T1，方差分析結(jié)果表明差異達(dá)到顯著水平；第3天到第5天取樣時(shí)，T2和T1之間差異減小，差異未達(dá)到顯著水平。天津紅H2O2含量的表現(xiàn)與龍小豆4號(hào)一致，說明低溫對(duì)不同抗性小豆品種影響趨勢(shì)一致。從圖1中可以看出，與T2處理相比，噴施S3307處理龍小豆4號(hào)H2O2含量第1天顯著降低了6.03%，第2天降低了2.81%；與T4處理相比，噴施S3307處理天津紅的H2O2含量第1天和第2天分別顯著降低6.51%和8.32%，之后處理間H2O2含量差異不顯著，說明低溫脅迫下噴施S3307處理能抑制H2O2含量的升高。對(duì)于不同抗性品種而言，S3307對(duì)冷敏品種天津紅的效果更好。

圖1 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片H2O2含量的影響

2.1.2對(duì)葉片MDA含量的影響

由圖2可知，幼苗期低溫處理后，小豆葉片MDA含量明顯升高，隨著取樣時(shí)間的延續(xù)，MDA含量呈下降趨勢(shì)。對(duì)龍小豆4號(hào)來說，第1天到第3天取樣時(shí)，T2的MDA含量均高于T1，分別高出65.56%、20.75%和7.20%，方差分析結(jié)果表明差異達(dá)到顯著水平；第4天和第5天取樣時(shí)，T2和T1之間含量差減小，未達(dá)到顯著差異水平。低溫處理對(duì)天津紅MDA含量影響規(guī)律與龍小豆4號(hào)相同，但抗性較強(qiáng)的品種龍小豆4號(hào)的MDA含量相對(duì)較低，說明低溫對(duì)不同品種小豆葉片MDA含量影響一致，但影響程度上存在差別。對(duì)龍小豆4號(hào)來說，第1天到第3天取樣時(shí)，MDA含量均為T3

圖2 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片MDA含量的影響

2.2 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.2.1對(duì)葉片SOD活性的影響

由圖3可知，低溫處理及噴施后S3307后，小豆葉片SOD活性相應(yīng)提高，各處理大致呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。整體看龍小豆4號(hào)的活性高于天津紅(T1>T4)，這與其耐冷性強(qiáng)有關(guān)。對(duì)龍小豆4號(hào)來說，第1天到第4天取樣時(shí)，T2>T1，分別高出6.67%、3.37%、6.64%和8.13%，T2和T1間差異在第4天達(dá)到顯著水平。對(duì)天津紅而言，第1天到第4天取樣時(shí)，T5>T4，分別高出18.48%、18.21%、18.72%和10.24%，差異均達(dá)到顯著水平；直到第5天差異不顯著。說明低溫對(duì)不同品種小豆葉片內(nèi)SOD活性影響具有較大影響，對(duì)耐冷性較弱天津紅影響更大。噴施S3307能進(jìn)一步提高低溫條件下SOD活性，龍小豆4號(hào)第1天到第4天取樣時(shí)，各處理間高低順序均為T3>T2>T1，其中T3較T2分別提高10.20%、13.03%、11.55%和7.65%，方差分析結(jié)果表明T3均顯著高于T2和T1。對(duì)天津紅來說，第1天到第4天取樣時(shí)，各處理間高低順序均為T6>T5>T4，其中T6較T5分別提高了17.26%、16.81%、9.05%和13.92%，方差分析結(jié)果表明T6均顯著高于T5和T4。綜合來看，噴施S3307對(duì)不同抗性的小豆品種具有相同的調(diào)控規(guī)律。

圖3 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片SOD活性的影響

2.2.2對(duì)葉片POD活性的影響

從圖4可以看出，幼苗期低溫處理后小豆葉片POD活性增加，隨著取樣時(shí)間的推移POD活性整體大致呈下降趨勢(shì)。龍小豆4號(hào)在第1天到第4天取樣時(shí)，POD活性均為T2>T1，僅第1天POD活性差異達(dá)到顯著水平。天津紅經(jīng)低溫處理后，第1天到第5天取樣時(shí)，POD活性均為T5>T4，分別高出102.44%、56.21%、62.13%、31.67%和3.55%，前4天的差異均達(dá)顯著水平。說明不同抗性品種對(duì)低溫的感受不同，抗性較弱的天津紅對(duì)低溫更為敏感，其POD活性持續(xù)較高，來抵御低溫的脅迫傷害，而抗性較強(qiáng)的龍小豆4號(hào)葉片內(nèi)POD活性僅取樣第1天顯著高于對(duì)照，說明其對(duì)低溫鈍感，短時(shí)低溫對(duì)其傷害不大。噴施S3307后，龍小豆4號(hào)在第1天到第5天取樣時(shí)POD活性均為T3>T2，分別高出17.16%、17.78%、4.46%、11.87%和2.08%，前2天的差異達(dá)到顯著水平。對(duì)天津紅來說，第1天到第5天全部取樣期間，各處理間高低順序均為T6>T5>T4，方差分析結(jié)果表明T6均顯著高于T5和T4。整體來看，噴施S3307能進(jìn)一步提高低溫條件下POD活性，對(duì)天津紅的POD活性具有更加明顯的調(diào)控效應(yīng)。

圖4 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片POD活性的影響

2.2.3對(duì)葉片CAT活性的影響

由圖5可知，幼苗期低溫處理后，小豆葉片內(nèi)CAT活性呈下降的變化趨勢(shì)。各取樣時(shí)期內(nèi)，龍小豆4號(hào)的T2和T1之間差異不大，經(jīng)過方差分析可知各取樣時(shí)期內(nèi)不同處理間CAT活性沒有顯著性差異。天津紅經(jīng)低溫處理后，第1天到第4天取樣時(shí)，CAT活性均為T5>T4，分別高出20.43%、18.18%、13.79%和1.08%，且前2天的差異達(dá)顯著水平。說明不同抗性品種對(duì)低溫的應(yīng)激存在差異，短時(shí)低溫對(duì)抗性較弱的天津紅CAT活性影響更為明顯。噴施S3307能進(jìn)一步提高低溫條件下CAT活性，對(duì)于龍小豆4號(hào)而言，CAT活性提高不明顯，處理間CAT活性均未達(dá)到顯著水平；對(duì)天津紅來說，第1天取樣時(shí)，T6顯著高于T5和T4，其他取樣時(shí)期T6和T5之間差異不顯著。

圖5 低溫脅迫及噴施S3307對(duì)小豆幼苗葉片CAT活性的影響

3 結(jié)論與討論

自然界中植物生長(zhǎng)發(fā)育不可避免地受到低溫、干旱等逆境因素的影響，其中溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡的最關(guān)鍵環(huán)境因子。低溫對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝活動(dòng)都有明顯的影響甚至傷害，使植物在逆境下產(chǎn)生復(fù)雜的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)[13]。低溫脅迫可引起細(xì)胞內(nèi)部的ROS類物質(zhì)、膜脂過氧化產(chǎn)物、酶功能等發(fā)生生理改變[14]。

H2O2是植物體內(nèi)一類重要的ROS物質(zhì)，正常條件下H2O2的產(chǎn)生和清除過程基本保持一種精細(xì)的平衡狀態(tài)，這樣既保證了植物體內(nèi)H2O2具有一定的生理功能，同時(shí)也將其對(duì)植物的傷害效應(yīng)降到最低。如果打破H2O2產(chǎn)生和清除的這種平衡，就會(huì)出現(xiàn)H2O2的積累。由于它具有較高的氧化還原活性，所以能引起細(xì)胞內(nèi)大分子氧化損傷，最終抑制植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)，影響植物體內(nèi)的調(diào)控和代謝[15]。MDA是細(xì)胞膜過氧化的產(chǎn)物，能夠抑制細(xì)胞保護(hù)酶活性，從而加劇膜脂過氧化，同時(shí)其本身也是具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，其含量的高低可作為質(zhì)膜受損的重要指標(biāo)，脅迫強(qiáng)度越大，MDA含量越多，MDA含量與植物耐寒性間呈負(fù)相關(guān)[7]。張騰國(guó)等[16]指出油菜受到低溫脅迫后體內(nèi)H2O2含量迅速增加，鄧化冰等[17]指出低溫脅迫導(dǎo)致水稻葉片H2O2和MDA含量迅速上升，膜透性增大，損傷細(xì)胞生理功能，張愛冬等[4]在對(duì)絲瓜的研究中也有相似的報(bào)道。本研究結(jié)果也表明低溫誘導(dǎo)小豆葉片體內(nèi)H2O2和MDA含量顯著增加，但隨著溫度恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2含量逐步下降并與對(duì)照趨平，這是小豆體內(nèi)的保護(hù)機(jī)制的生理作用，尤其是抗氧化酶活性的提高，起到很強(qiáng)的清除H2O2的作用，并抑制ROS自由基與脂質(zhì)作用發(fā)生過氧化反應(yīng)，最終抑制MDA的產(chǎn)生，有效降低MDA含量。

植物抵御外界脅迫能力的強(qiáng)弱與抗氧化系統(tǒng)水平的高低具有相關(guān)性[13]，抗氧化酶是指植物體內(nèi)存在的一系列可以防止自由基對(duì)植物造成毒害的具有清除活性氧自由基功能的酶，如保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等。植物通過SOD、POD和CAT三者協(xié)同作用，使體內(nèi)的氧自由基維持在較低水平，可以在一定程度上減緩或防御低溫脅迫[18]。SOD的主要作用是清除超氧根陰離子(O2·-)，但同時(shí)產(chǎn)生H2O2，而POD和CAT通過酶促作用降解多余的H2O2等ROS，避免植物遭受因脅迫引起的過氧化傷害。相關(guān)研究指出低溫可導(dǎo)致植物體內(nèi)SOD、POD和CAT活性先升高后下降，短時(shí)期內(nèi)可清除多余的ROS，但隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這種保護(hù)機(jī)能逐漸下降甚至崩潰[7]，這與李春燕等[19]的報(bào)道相似，其指出低溫處理一段時(shí)間后保護(hù)酶活性表現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)，并表明這種持續(xù)下降的現(xiàn)象是低溫對(duì)作物造成了不可恢復(fù)的傷害。本研究結(jié)果也表明低溫脅迫下小豆葉片的SOD和POD活性顯著提高，消除ROS的過氧化反應(yīng)，消除或緩解低溫的脅迫效應(yīng)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑預(yù)處理是緩解植物非生物脅迫重要措施，S3307是一種有效的植物生長(zhǎng)延緩劑，能夠顯著提高逆境脅迫下作物的抗性生理并有效緩解產(chǎn)量因子受到脅迫，促使作物產(chǎn)量有效提高。Zhao等[10]指出開花期低溫條件下，S3307能降低ROS產(chǎn)生速率及MDA含量，并促進(jìn)保護(hù)酶活性提高；楊文鈺等[20]指出S3307能減少膜脂過氧化物MDA含量，提高SOD、POD和CAT活性，并增加植物幼苗體內(nèi)游離脯氨酸的含量；Xiang等[21]指出低溫脅迫下S3307能相應(yīng)提高SOD、POD和CAT活性，增強(qiáng)作物的抗冷性，緩解脅迫并提高產(chǎn)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施S3307能緩解低溫脅迫對(duì)小豆造成的傷害，與噴施清水相比，能夠顯著降低H2O2和MDA含量、提高SOD和POD活性，增加小豆幼苗的抗冷性。

幼苗期短時(shí)低溫引起小豆葉片H2O2和MDA含量提高，SOD和POD活性提高，預(yù)噴施S3307具有提高小豆幼苗緩解低溫脅迫的作用，能顯著降低H2O2和MDA含量，顯著提高SOD和POD活性。不同品種小豆的生理應(yīng)激存在顯著差異，抗性較弱的品種天津紅對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)更為劇烈；噴施S3307能夠有效緩解低溫脅迫對(duì)小豆的傷害，對(duì)天津紅的緩解效應(yīng)更加明顯，增加其抗冷性。