健脾益氣方對(duì)慢性萎縮性胃炎脾虛證大鼠胃組織的影響

徐雨璇 嚴(yán)展鵬 徐婷婷 王 培 鄭 雪 朱方石,

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究室，江蘇南京 210028

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）指胃黏膜上皮反復(fù)受損致腺體萎縮、減少的疾病。CAG 與胃癌發(fā)病相關(guān)[1]。Notch 信號(hào)通路可以促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖[2-4]。細(xì)胞增殖凋亡失衡是CAG 機(jī)制之一[5]。健脾益氣方對(duì)CAG的臨床療效肯定[6-7]，能保護(hù)CAG 大鼠胃黏膜、抑制胃組織Wnt/β-catenin 及PI3K-Akt 信號(hào)通路蛋白的表達(dá)[8-10]。本研究擬通過(guò)健脾益氣方干預(yù)CAG 脾虛證大鼠，觀察其Ki67 及Notch 等信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，揭示健脾益氣方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 MNNG（日本東京化成工業(yè)）；蘇木精染液（719054，珠海貝索）；伊紅染液（719062，珠海貝索）；大鼠促胃液素（EG038-18，依科賽）和生長(zhǎng)抑素（somatostatin，SST）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（EG027-36，依科賽）；Notch1（AI10126996，Bioss），Notch2（AG09066100，Bioss），Hes1（11988S，CST）?？贵w濃度均為1∶1000。

1.1.2 藥物 雷尼替?。?50 mg/粒，上海衡山藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：200804）；替普瑞酮[50 mg/片，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，1606031]；葉酸片（5 mg/片，天津力生制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1612054）。健脾益氣方水提液：茯苓10 g，黨參15 g，炒白術(shù)10 g，炙甘草3 g，法半夏6 g，陳皮6 g，木香10 g，砂仁6 g，莪術(shù)10 g，郁金10 g，云母石30 g，白花蛇舌草30 g（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科）。

1.1.3 動(dòng)物 健康SD 大鼠65 只，體重（230±10）g，雄性（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK2019-0001，生產(chǎn)許可證號(hào)：AEWC-20181205-65，南京藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.1.4 儀器 CT-9 生物組織攤烤片機(jī)、CB-08 石蠟包埋機(jī)，湖北定源醫(yī)用材料。RM2245 石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica。CKX31 倒置生物顯微鏡，日本Olympus。KHB ST-360酶標(biāo)儀，瑞士Tecan。

1.2 研究方法

1.2.1 CAG 脾虛證大鼠模型建立及分組干預(yù) 選取55 只健康SD 大鼠自由飲食含170 μg/ml MNNG的純凈水及含0.03%雷尼替丁的大鼠飼料制造CAG 大鼠模型，造模24 周。24 周后選取5 只大鼠處死觀察其胃黏膜萎縮狀態(tài)，形成CAG 脾虛證模型[11]。剩余50 只按隨機(jī)數(shù)字表法分為健脾益氣方低[13.1 g/（kg·d）]、中[26.2 g/（kg·d）]、高劑量組[52.4 g/（kg·d）]，以及模型組（等量生理鹽水）、陽(yáng)性藥組[葉酸2.7 mg/（kg·d）+替普瑞酮13.5 mg/（kg·d）]，每 組 各10 只，另 取10 只健康SD 大鼠作為空白組（等量生理鹽水）。六組均灌胃干預(yù)8 周，記錄其狀態(tài)和體重。

1.2.2 標(biāo)本的采集 8 周后，每組取5 只進(jìn)行標(biāo)本采集。采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉（0.3 ml/100 g），腹主動(dòng)脈取血3～6 ml，靜置2 h 后離心5 min（3000 r/min，離心半徑為13.5 cm），取上層血清，-80°C 儲(chǔ)存。取胃底、胃竇、胃體組織各1 塊，甲醛固定。

1.2.3 HE 染色 切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水后蘇木精染色3 min，清洗，分化5 s，清洗，梯度乙醇脫水，伊紅染色15 s，95%、100%乙醇各5 min，二甲苯5 min，封片。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)孔10 孔梯度稀釋?zhuān)瑯颖究字屑尤氪郎y(cè)血清40 μl 及促胃液素、SST 一抗10 μl，封膜。震蕩后37℃孵育1 h。洗板30 s 共3 次。加鏈霉素-辣根過(guò)氧化物酶50 μl，封膜，37℃孵育1 h。37℃避光顯色15 min。每孔加入50 μl 終止液。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 將切片放入二甲苯中5 min共2 次脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水清洗；抗原修復(fù)液中沸騰持續(xù)10 min；清洗，雙氧水10 min，封閉1 h；一抗4℃過(guò)夜；磷酸鹽吐溫緩沖液清洗，二抗室溫1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗，DAB 顯色；蘇木精復(fù)染30 s，清洗，分化，返藍(lán)，清洗。浸入梯度乙醇、二甲苯，封片。Ki67、蛋白表達(dá)量采用Image-ProPlus 6.0 計(jì)算其光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組一般情況及體重比較

空白組毛色白有光澤，活動(dòng)積極。模型組毛色黃易脫落，活動(dòng)量減少。陽(yáng)性藥組及健脾益氣方低、中、高劑量組毛光亮，活動(dòng)量高。模型組體重低于空白組，健脾益氣方中、高劑量組體重高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 六組體重比較（g，）

表1 六組體重比較（g，）

注：與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05

2.2 六組胃黏膜HE 染色情況

空白組胃黏膜上皮層次清楚，腺體正常。模型組胃黏膜上皮變薄，腺體減少，排列疏松、雜亂，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞。其余四組胃黏膜上皮增厚，腺體增加，排列趨向整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，健脾益氣方中劑量組最近似空白組。見(jiàn)圖1。

圖1 六組胃黏膜HE 染色情況（100×）

2.3 六組血清促胃液素、SST 水平比較

模型組血清促胃液素、SST 水平均低于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。健脾益氣方高劑量組血清促胃液素水平高于模型組，健脾益氣方低、中、高劑量組SST 水平均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 六組血清促胃液素、SST 水平比較（pg/ml，）

表2 六組血清促胃液素、SST 水平比較（pg/ml，）

注：與空白組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。SST：生長(zhǎng)抑素

2.4 六組胃組織Ki67 蛋白表達(dá)情況

模型組Ki67 表達(dá)呈淺棕色，其余五組均呈黃棕色，見(jiàn)圖2（封三）。模型組Ki67 蛋白表達(dá)量低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。健脾益氣方低劑量組Ki67 蛋白表達(dá)量高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 六組胃組織Ki67 蛋白表達(dá)量比較（）

表3 六組胃組織Ki67 蛋白表達(dá)量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bbP ＜0.01

圖2 六組胃組織Ki67 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，100×）

2.5 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達(dá)情況

模型組Notch1、Notch2、Hes1 蛋白呈淺褐色，其余五組呈深褐色，見(jiàn)圖3～5（封三、封四）。模型組Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達(dá)量均低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。健脾益氣方低、中、高劑量組Notch1、Notch2 蛋白表達(dá)量均高于模型組，健脾益氣方高劑量組Hes1 蛋白表達(dá)量高于模型組，差異竣工有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達(dá)量比較（）

表4 六組胃組織Notch1、Notch2、Hes1 蛋白表達(dá)量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

圖3 六組胃組織Notch1 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，100×）

圖4 六組胃組織Notch2 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，100×）

3 討論

CAG 屬中醫(yī)“胃痞”“嘈雜”等范疇[12]，脾胃虛弱是主要病機(jī)，健脾益氣為主要治法[13]。胃黏膜損傷是脾虛的主要原因，脾虛的狀態(tài)為胃黏膜損傷提供了客觀條件，這一惡性循環(huán)加重了脾虛的病理改變[14]，“從脾虛論治”CAG的治則觀具有理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

健脾益氣方由黨參、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、法半夏、木香、砂仁、莪術(shù)、白花蛇舌草、云母石、郁金組成。黨參性平，與炒白術(shù)、茯苓、炙甘草合用益氣健脾；半夏、陳皮、砂仁、木香理氣化痰；莪術(shù)、郁金活血消積、行氣止痛；云母去瘀生新[15]；白花蛇舌草抗癌變[16]。諸藥合用，共奏健脾益氣，活血行氣之功[13]。

本研究結(jié)果顯示，健脾益氣方低、中、高劑量組一般狀態(tài)、體重較模型組均改善，以中、高劑量組優(yōu)勢(shì)顯著。促胃液素由G 細(xì)胞分泌，對(duì)胃腸道黏膜具有營(yíng)養(yǎng)作用[17]；SST 由D 細(xì)胞分泌，可以減輕細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，是胃黏膜防御機(jī)制之一[18]。在萎縮和腸化階段，促胃液素與SST 分泌呈下降趨勢(shì)[19-21]。健脾益氣方高劑量組促胃液素高于模型組，健脾益氣方三組SST 均高于模型組，提示其可以修復(fù)CAG 大鼠胃黏膜損傷。

胃黏膜細(xì)胞增殖是導(dǎo)致CAG 病理改變的核心因素之一，在CAG 發(fā)展進(jìn)程中胃黏膜細(xì)胞增殖會(huì)出現(xiàn)被抑制的狀態(tài)[22-23]。Ki67 可評(píng)估細(xì)胞增殖水平。本研究顯示，模型組Ki67 表達(dá)下降，用藥干預(yù)促進(jìn)了Ki67的表達(dá)，以健脾益氣方低劑量組為優(yōu)，提示健脾益氣方能改善CAG 胃黏膜上皮細(xì)胞增殖阻滯，促進(jìn)胃黏膜正常細(xì)胞的增殖，有利于萎縮的胃黏膜腺體修復(fù)。

Notch 信號(hào)通路是控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡的核心途徑[24]，由受體（Notch）和配體（Jagged、DLL）及靶基因Hes1 等組成[25-26]。Notch1、Notch2 能促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖[2-4]，而胃黏膜細(xì)胞增殖被抑制與CAG的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[22-23]。據(jù)此推測(cè)，Notch 信號(hào)通路蛋白表達(dá)下降導(dǎo)致的細(xì)胞增殖阻滯是胃黏膜萎縮和腸上皮化生的機(jī)制之一。本研究示，健脾益氣方可以促進(jìn)Notch1、Notch2 及Hes1的表達(dá)，以促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖，從而改善胃黏膜萎縮的病理改變。但中藥不同劑量組間尚未顯示出明顯差異。本研究為解釋健脾益氣方對(duì)CAG 療效的作用機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)，至于健脾益氣方在Notch 等信號(hào)通路中發(fā)生分子調(diào)節(jié)作用的具體過(guò)程，有待進(jìn)一步深入研究。