瘦素對西門塔爾牛屢配不孕的影響及與生殖激素相關(guān)性分析

曲 苗，孫亞偉，閆向民，李紅波，姚 剛，張 楊，李 娜*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學(xué)院畜牧所，新疆 烏魯木齊 835000)

【研究意義】生活水平提高，人們對肉類的需求大大提升，西門塔爾牛是一種乳肉兼用的品種，深受廣大消費者喜愛，但西門塔爾牛在生產(chǎn)上容易出現(xiàn)屢配不孕現(xiàn)象，養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益達(dá)不到預(yù)想結(jié)果。導(dǎo)致牛屢配不孕的疾病有很多，如卵巢囊腫[1]、陰道炎[2]、輸卵管疾病、持久黃體、子宮內(nèi)膜炎[3]等疾病?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，在引起肉牛繁育率降低的幾種疾病中，屢配不孕占全部疾病的53.06%[4]。但一些牛沒有明顯的生殖疾病特征，例如：直腸檢查無卵巢囊腫，無陰道疾病等，仍然出現(xiàn)屢配不孕的狀況。LEP是由肥胖基因指導(dǎo)的，由脂肪組織分泌的一種蛋白質(zhì)激素[5]，具有生殖調(diào)節(jié)功能[6]。LEP作為一種調(diào)節(jié)信號，作用于下丘腦—垂體—性腺軸及胎盤和子宮等來調(diào)控哺乳動物的繁殖過程[7]。林戎等人研究表明LEP會影響胎兒宮內(nèi)的生長發(fā)育[8]，Guzmán A等[9]發(fā)現(xiàn)LEP濃度降低，影響神經(jīng)肽的分泌增加，在這種負(fù)調(diào)節(jié)的作用下，使得GnRH分泌減少。這一系列研究都表明LEP對生殖調(diào)節(jié)可能起著重要的作用。【本研究切入點】前人研究表明LEP影響生殖活動，但目前LEP與屢配不孕的研究相對較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為探究LEP與屢配不孕的關(guān)系，本試驗通過對西門塔爾牛血清LEP和各生殖激素含量進(jìn)行檢測，深度分析除生殖疾病以外，可能導(dǎo)致西門塔爾牛屢配不孕的內(nèi)在因素，以期為預(yù)防及治療牛屢配不孕提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品的采集

試驗動物為伊寧市某牛場產(chǎn)后13 d的西門塔爾牛，其生長環(huán)境和飼養(yǎng)管理條件一致，共計19頭，根據(jù)其配種次數(shù)將其分為2組，分別為健康組(配種1次或2次成功)16頭和屢配不孕組(配種3次以上不孕)3頭，使用氯前列醇鈉(PG)對其進(jìn)行同期發(fā)情處理，分別在產(chǎn)后14、28和42 d注射PG，每頭牛注射3 mL。從產(chǎn)后13 d開始每周采集1次試驗牛的靜脈血5 mL，在3000 r/min的條件下離心血樣，離心10 min，分離血清，置于液氮保存。

1.2 試驗試劑

瘦素(LEP)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0106Bo)，促性腺激素釋放激素(GnRH)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0083Bo)，促卵泡生成素(FSH)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0055Bo)，促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0054Bo)，雌激素(E2)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0057Bo)，孕激素(PROG)酶聯(lián)免疫試劑盒(貨號：JYM0056Bo)，均由武漢基因美公司提供。氯前列醇鈉注射液(PG，寧波第二激素廠，0.2 mg*10支)。

1.3 試驗方法

根據(jù)發(fā)情周期將試驗分為產(chǎn)后恢復(fù)期(產(chǎn)后0～40 d)、第1個發(fā)情期(產(chǎn)后41～62 d)、第2個發(fā)情期(產(chǎn)后63～84 d)、第3個發(fā)情期(產(chǎn)后85～106 d)4組。使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[10]試劑盒對血清中的LEP、GnRH、FSH、LH、E2和PROG進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel制作回歸曲線，并做圖對比LEP濃度在兩組樣品中的變化規(guī)律。使用SPSS 21.0進(jìn)行獨立樣本T檢驗，兩兩比較，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)進(jìn)行表示，使用Spearman對LEP與生殖激素進(jìn)行單側(cè)相關(guān)性分析，結(jié)果P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著，P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEP及生殖激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照LEP及GnRH、FSH、LH、E2和PROG的ELISA試劑盒說明書繪制LEP及生殖激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1～6。LEP、GnRH、FSH、LH、E2和PROG線性回歸曲線的相關(guān)系數(shù)分別是0.994、0.998、0.992、0.992、0.992和0.995，均大于試劑盒所提供的相關(guān)系數(shù)(R2>0.92)，說明此次試驗樣品的檢測結(jié)果可信。

2.2 西門塔爾牛不同組的LEP濃度的變化

由表1可知，健康組在4個時期中的LEP濃度均高于屢配不孕組的LEP濃度，且2個組隨時間的推移濃度逐漸降低。圖7顯示，健康組的LEP濃度高于屢配不孕組的LEP濃度，只有產(chǎn)后27 d時屢配不孕組的濃度高于健康組，此時健康組的LEP平均濃度是2.16 ng/mL，而屢配不孕組的LEP平均濃度是2.53 ng/mL。健康組在采樣期間的LEP濃度出現(xiàn)4個峰值，分別是產(chǎn)后34、52、68和85 d，屢配不孕組的LEP濃度在采樣期間出現(xiàn)了4個峰值，分別是產(chǎn)后27、34、68和85 d，兩組出現(xiàn)峰值的時間大體相同。

表1 不同組的瘦素濃度比較

2.3 西門塔爾牛不同分組的瘦素與生殖激素的相關(guān)性分析

由表2可知，在健康組與屢配不孕組中，LEP與GnRH、E2、PROG和LH正相關(guān)，與FSH負(fù)相關(guān)。在健康組中，LEP與GnRH和E2相關(guān)性顯著(P<0.05)，與PROG相關(guān)性極顯著(P<0.01)。在屢配不孕組中，LEP只與PROG相關(guān)性顯著(P<0.05)。

表2 西門塔爾牛健康組與屢配不孕組的瘦素與生殖激素的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 西門塔爾牛不同組LEP濃度的變化

LEP是由Zhang[11]等人在1994年在對遺傳性肥胖小鼠的脂肪組織進(jìn)行位置克隆技術(shù)時所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)激素，在內(nèi)分泌方面有著一定的作用[12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)LEP除了有調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪的消耗儲存的能量平衡的重要作用外[13],在生殖方面也發(fā)揮著重大作用[14]。LEP可縮短性成熟的

時間，Chehab F F[5]等對正常性成熟之前的小鼠腹腔注射LEP，可明顯發(fā)現(xiàn)LH和E2的濃度上升，并且小鼠的陰道口明顯張開，提前進(jìn)入動情期及性器官趨向成熟。LEP是青春期中早于LH、FSH出現(xiàn)的激素[15]。LEP在妊娠期起維持妊娠的作用。妊娠前期的LEP水平與機(jī)體內(nèi)的脂肪含量高度相關(guān)，但在妊娠期，脂肪組織產(chǎn)生的LEP低于胎盤所產(chǎn)生的LEP[13]。Highman TJ[16]等研究表明在妊娠期，LEP隨妊娠時間先上升，在妊娠中期達(dá)到最高，隨后下降并保持在正常范圍內(nèi)。

本試驗中，產(chǎn)后恢復(fù)期的LEP濃度均高于發(fā)情期中的LEP濃度，可能是因為在發(fā)情時需要的能量比較多，導(dǎo)致LEP的濃度低于產(chǎn)后恢復(fù)期的LEP濃度。健康組在配種成功后進(jìn)入到妊娠期，而屢配不孕組則進(jìn)入下一個發(fā)情期接著發(fā)情，直到配種成功，所以3個發(fā)情期所代表的是屢配不孕的時期分組，而健康組在第2個發(fā)情期之后就進(jìn)入了妊娠期，但是從圖7看出健康組進(jìn)入妊娠期的變化規(guī)律和屢配不孕組進(jìn)入第3個發(fā)情期的變化規(guī)律相似，可能是在妊娠前期攝入能量所影響的LEP濃度高于胎盤產(chǎn)生的濃度，所以其變化規(guī)律與未妊娠的牛相似。杜旭旭[17]等研究奶牛分娩前后血清中LEP的濃度變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)奶牛產(chǎn)后血清中的瘦素濃度總趨勢呈波浪式下降。本文結(jié)果與杜旭旭等結(jié)果相同，在產(chǎn)后都是波浪式下降。產(chǎn)后恢復(fù)期兩組的LEP濃度都先下降，分析原因是由于西門塔爾牛在這一時期出現(xiàn)不同程度的能量負(fù)平衡，導(dǎo)致LEP濃度降低，此結(jié)果與鄭家三[18]等的結(jié)果相同，鄭家三等人研究LEP與奶牛泌乳早期能量平衡和生殖機(jī)能的關(guān)系時得出奶牛泌乳早期出現(xiàn)能量負(fù)平衡，產(chǎn)后14 d其影響最高。能量負(fù)平衡使奶牛產(chǎn)后干物質(zhì)攝入量、體重和泌乳量減少及LEP濃度降低。

3.2 西門塔爾牛不同分組的瘦素與生殖激素的相關(guān)性分析

機(jī)體的內(nèi)分泌一直是處于相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，各激素之間的相互作用調(diào)節(jié)著機(jī)體的一系列生理活動。生殖激素間的相互作用使得生殖得以正常發(fā)生，LEP也可由胎盤、卵巢等組織分泌，影響著生殖的調(diào)控。研究表明，LEP和生殖激素有一定的相關(guān)性，影響著生殖激素的分泌[19]。孫長顥[20]等研究表明，在女性青春期整個發(fā)育過程中，LEP水平和E2水平呈正相關(guān)(r=0.45，P<0.01)，但是在糾正了年齡因素之后，LEP和E2相關(guān)性不顯著(P>0.05)，其試驗結(jié)果與本文的結(jié)果相同，本試驗的LEP與E2水平呈正相關(guān)(P<0.05)。

本試驗中健康組和屢配不孕組的LEP與PROG的相關(guān)顯著性程度不同，與健康組相關(guān)性極顯著，與屢配不孕組相關(guān)性顯著，說明屢配不孕組的LEP對PROG的合成及分泌的影響沒有健康組的影響大，由此可推斷低濃度的LEP可能影響西門塔爾牛屢配不孕的原因是影響了PROG的合成與分泌。陳正瓊[21]等對妊娠期糖耐量異?；颊哐宓腅2、PROG、PRL與LEP水平的關(guān)系進(jìn)行研究，表明LEP只與PROG相關(guān)(r=0.321，P<0.01)，而與PRL和E2的相關(guān)性不顯著(P>0.05)，與本文的試驗結(jié)果相同，說明本文的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用來說明LEP與PROG的關(guān)系。

LEP與FSH呈負(fù)相關(guān)，與LH呈正相關(guān)，LEP與兩種激素的差異性均不顯著(P>0.05)，說明LEP對FSH和LH的合成可能有影響，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，LEP可以促進(jìn)大鼠腺垂體FSH和LH的合成與分泌，還可以促進(jìn)小母豬的LH的合成與分泌，說明LEP可以作用于垂體組織來影響FSH和LH的濃度[22]。研究表明，給小鼠注射LEP，可發(fā)現(xiàn)FSH的濃度顯著低于未注射LEP時的濃度，說明LEP對FSH的合成與分泌具有副作用，與本文的結(jié)果相同，表明本試驗的結(jié)果正確[23]。

4 結(jié) 論

屢配不孕組的LEP濃度低于健康組的LEP濃度，因此，LEP可能會影響西門塔爾牛屢配不孕，為預(yù)防及治療生產(chǎn)中牛屢配不孕提供相關(guān)參考。LEP與屢配不孕組的PROG呈正相關(guān)(P<0.05)，說明LEP可能影響PROG的合成及分泌，LEP濃度增多可促進(jìn)PROG的分泌，為之后研究LEP與牛屢配不孕生殖激素之間的相關(guān)性提供參考。