工廠化雙孢蘑菇催蕾期覆土層細菌群落變化研究

陸 娜，宋吉玲，周小華，沈漢斌，袁衛(wèi)東*

(1. 杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024；2. 桐廬縣農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 桐廬 311599；3. 嘉善縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,浙江 嘉善 314100)

【研究背景】雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇[1]，它是世界性栽培和消費的菇類，是世界上生產(chǎn)量最大的食用菌[2]，有“世界菇”之稱。浙江省作為全國雙孢蘑菇主產(chǎn)區(qū)之一，工廠化栽培逐漸成為主要栽培方式，產(chǎn)量高，質(zhì)量優(yōu)，且能周年生產(chǎn)。雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)與農(nóng)法栽培一樣整個生長過程中伴隨著土壤，覆土層微生物的生長繁殖變化與雙孢蘑菇原基形成有著密不可分的關(guān)系[3-4]。而覆土層中對雙孢蘑菇生長有益的微生物細菌，其產(chǎn)生的不耐熱代謝物能夠刺激子實體原基的形成[5]。【前人研究進展】Visscher[6]、Rainey[7]等人研究得出致腐假單胞桿菌會促進雙孢蘑菇從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化，John報道在雙孢蘑菇子實體形成機制的調(diào)節(jié)時發(fā)現(xiàn)有40種細菌，大多數(shù)為假單胞菌，在無菌培養(yǎng)料中能誘導子實體的形成，并提出這些細菌能消除菌絲體生長期產(chǎn)生的一些自抑物質(zhì)，促進菌絲從營養(yǎng)生長向生殖生長的假說[8]。其中，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、固氮菌屬、鏈霉菌屬對菌絲長勢、長速和子實體發(fā)育均有明顯促進作用[9-10]。【本研究切入點】“冷卻—降溫”是工廠化栽培雙孢蘑菇催蕾的重要階段，目的就是模擬自然界中夏季到秋季的轉(zhuǎn)變過程刺激雙孢蘑菇由營養(yǎng)生長(菌絲體生長)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(子實體生長)，對降溫時機的把控和溫度的精確控制，與后期出菇的產(chǎn)量和質(zhì)量關(guān)系密切[11]。微生物是雙孢蘑菇覆土層的重要組成部分[12],采用不同的“冷卻—降溫”處理會讓雙孢蘑菇覆土層微生物多樣性產(chǎn)生更替，使其微生物構(gòu)成發(fā)生變化，而這些變化都會不同程度的影響到雙孢蘑菇的生長發(fā)育。微生物多樣性是基于 Illumina HiSeq 測序平臺，利用雙末端測序的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對 Reads 拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成；進一步進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和顯著物種差異分析等，可以挖掘樣品之間的差異。目前，微生物多樣性研究主要是在編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進行的，細菌主要是基于16S區(qū)。目前，浙江地區(qū)工廠化雙孢蘑菇栽培中降溫催蕾時長以6 d左右為主，但并無文獻報道相關(guān)機理研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本試驗在雙孢蘑菇生長催蕾期選取4、6和8 d 3種時長，將培養(yǎng)溫度由25 ℃勻速降至17.5 ℃對雙孢蘑菇進行變溫培養(yǎng)，刺激催蕾，對其覆土層的細菌群落進行生物多樣性分析，揭示不同變溫時長下雙孢蘑菇覆土層的物種構(gòu)成， 挖掘采用不同變溫措施之間的差異，以期為雙孢蘑菇“冷卻-降溫”過程中選用最佳變溫催蕾時長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雙孢蘑菇催蕾期不同變溫時長的處理

雙孢蘑菇培養(yǎng)料取自浙江省嘉善寧遠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，栽培品種為W192，培養(yǎng)料配方：麥草53%、雞糞40%、石膏4.4%、花生粕2.5%，尿素0.1%，覆土材料為純草炭土。培養(yǎng)料處理方法一致，選取堆料、發(fā)酵、上架及播種時間一致的3個蘑菇出菇房，在催蕾過程中分別以降溫時長為4、6、8 d 3個時間段從25 ℃勻速降到17.5 ℃進行處理。

1.2 樣品采集

分別對搔菌前(A)、降溫前(B)、降溫4 d(C)、6 d(D)、8 d(E)和采收期(F)6個時間段的雙孢蘑菇覆土層進行采集，在菇房內(nèi)不同出菇層架取樣，每層取3個點，約200 g，將所有樣品均勻混合后從中取50 g，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。采收后的樣品立即存入液氮速凍轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取及測序處理

提取和純化各處理土樣總基因組DNA后，對16S V3+V4區(qū)進行PCR擴增，引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R(5’-GGACTACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[13]。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min， 95 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，包含測序序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息的結(jié)果以FASTQ文件格式保存。

1.4 生物信息分析流程

根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，使用 FLASH v1.2.7軟件將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags，使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)，同時使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。按照97%相似性進行OTU聚類，通過對SILVA、UNITE數(shù)據(jù)庫進行比對，得到每個OTU的代表物種[14]?；贠TU的分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽取的方法，進行Alpha多樣性分析[15-16]，并作出相應(yīng)的稀釋曲線[17]。采用非度量多維標定法(NMDS)通過QIIME軟件進行 Beta 多樣性分析[18]，比較不同變溫處理在物種多樣性方面存在的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢蘑菇覆土層細菌群落OTU劃分

通過對雙孢蘑菇所有階段土壤樣品測序共獲得 3009 758對高質(zhì)量測試序列，雙端測試序列拼接、過濾后共產(chǎn)生2753 152條優(yōu)化序列數(shù)，每個樣品至少產(chǎn)生48 594條優(yōu)化序列數(shù)，平均產(chǎn)生65 551條優(yōu)化序列數(shù)。數(shù)據(jù)表明在所有樣本中共產(chǎn)生572個OTUS(圖1)，其中變溫期間C、D、E分別獲得了567、569、566個OTUs。從種群來看(圖2)，變溫期間C、D、E單獨比對，有288個共有種群，在8 d降溫和6 d降溫2個處理中分別有1個和2個獨有種群。

2.2 不同變溫處理下細菌群落結(jié)構(gòu)分析

將所有OTU代表序列與參考數(shù)據(jù)庫進行比對可知，從搔菌到第一潮菇采收的過程中細菌分屬于14門、31綱、72目、117科、217屬、290種。按照不同變溫處理下的樣本細菌種群在屬水平的分類中，物種數(shù)量排在前10位的分別是假單胞菌屬Pseudomonas、蛭弧菌屬Bdellovibrio、根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Parahizobium-Rhizobium、黃桿菌屬Flavobacterium、短波單胞菌屬Brevundimonas、裂桿菌Pedobacter、腐敗桿菌屬Peredibacter、諾維赫巴螺菌屬Noviherbaspirillum、德沃西亞菌屬Devosia和噬氫菌屬Hydrogenophaga。其中采用4 d變溫處理中假單胞菌屬所占的比例最高，為21.2%，且隨著變溫時長的增加呈現(xiàn)遞減趨勢；蛭弧菌屬情況相反，8 d變溫時長下的比例最高，為15.2%，且呈現(xiàn)遞增趨勢；根瘤菌屬4和8 d比例均為5.8%，高于6 d的5.14%，后續(xù)排名的細菌種群比例相差不大(圖3)。

將前50位的細菌屬進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，從圖4中可見,進化樹中每條樹枝代表一個物種，樹枝長度為兩個物種間的進化距離，即物種的差異程度，相同顏色的代表屬于同一種屬門，結(jié)果表明其中30種屬于變形菌門Proteobacteria， 14種屬于擬桿菌門Bacteroidetes，其余6種屬于厚壁菌門Firmicutes和放線菌門Actinobacteria。變形菌門是細菌中最大的一門，包括許多病原菌，擬桿菌門生活在動物腸道類，是糞便的主要微生物種類，主要來源是雙孢蘑菇生產(chǎn)中原料是雞糞、牛糞。

2.3 不同變溫處理下細菌的Alpha多樣性分析

稀釋曲線反映了采用不同變溫處理持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率，如圖5所示，在0～40 000條數(shù)范圍內(nèi)，OTU數(shù)目呈上升趨勢，測序數(shù)目在0～10 000條數(shù)時，曲線表現(xiàn)為急劇上升，表示此階段群落中有大量新物種被檢測到，當大于10 000條數(shù)后曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，可以進行數(shù)據(jù)分析，說明本次實驗的測序量反映出了樣品中絕大部分的物種信息。

本次測序樣品的OTU覆蓋率均在99.8%以上，說明樣品文庫的覆蓋率極高，樣品中序列沒有被檢測出的概率極低，反映本次測序結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實情況。Alpha多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標，試驗根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)對不同變溫處理的微生物物種的豐富度和多樣性進行了評估。由表2可以看出，Chao1和Ace指數(shù)在4 d變溫處理下數(shù)值最高，分別為522.58和519.05，并且隨著變溫處理時長的增加而遞減，說明在4 d變溫處理下細菌物種豐度即物種數(shù)量是最多的；Shannon指數(shù)剛好相反，4 d最小，隨著變溫時長增加而遞增，在8 d達到4.37，而Simpson指數(shù)規(guī)律不明顯，6 d最高；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[10]，所以8 d變溫處理下樣品的物種多樣性是最高的。

2.4 不同變溫處理下細菌的Beta多樣性分析

使用QIIME軟件進行 Beta 多樣性分析，比較不同變溫處理在物種多樣性方面存在的相似程度，實驗主要采用binary jaccard算法計算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。非度量多維標定法[11](NMDS)是一種適用于生態(tài)學研究的排序方法，主要是將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。通過不同變溫處理樣品的分布可以看出它們之間的差異。NMDS分析結(jié)果如圖6所示，圖中點分別表示各樣品，不同顏色代表不同不同變溫處理，點與點之間的距離表示差異程度，Stress數(shù)值為0.1671，表明NMDS分析具有一定的可靠性，從圖中可以看出3種變溫處理下的樣品多樣性相似度較高，但4和8 d變溫處理在坐標圖上距離更近，相似性更為一致。

表1 Alpha多樣性指數(shù)

3 討 論

本研究利用高通量測序技術(shù)對雙孢蘑菇催蕾期不同變溫時長處理樣本中的細菌核酸序列保守區(qū)(16S：V3+V4)進行測序，得到優(yōu)化序列并進行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類?；贠TU分析結(jié)果，共獲得 3 009 758 對高質(zhì)量測試序列，共產(chǎn)生572個OTUS、290個細菌種群，涵蓋了14門、31綱、72目、117科、217屬、290種。雙孢蘑菇催蕾期間，采用不同的降溫時長會影響細菌群落在雙孢蘑菇覆土層的生長速度導致細菌的含量不同，但不會影響覆土層細菌種類的變化。

假單胞菌屬是雙孢蘑菇覆土層中檢測出含量最高的種群，Reddy[19]等研究表明覆土中假單胞菌的數(shù)量越高雙孢蘑菇產(chǎn)量也越高。惡臭假單胞菌可顯著提高雙孢蘑菇菌絲的生長速度及誘導并促進子實體的形成和發(fā)育[20]；熒光假單胞菌對雞腿菇、平菇、雙孢蘑菇等有促生作用，可能是通過其 1-氨基環(huán)丙烷 -1-羧酸 (ACC)脫氨酶降解食用菌產(chǎn)生的 ACC、減少食用菌乙烯的合成及乙烯對菌絲生長和子實體發(fā)育的抑制作用[21-22]。具有固氮作用的根瘤菌屬對食用菌產(chǎn)量有重要作用[23]。蛭弧菌對環(huán)境細菌數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響主要取決于蛭弧菌裂解特性[24]，能夠裂解一些革蘭氏陰性菌，而覆土層中的細菌群落大部分是革蘭氏陰性菌。OTU聚類結(jié)果顯示隨著催蕾降溫時長的增加，假單胞菌屬含量逐漸降低，蛭弧菌屬含量逐漸增加，根瘤菌屬含量在4和8 d時最高，加之Alpha、Beta多樣性分析結(jié)果反映4 d變溫處理下細菌物種豐度最多，其假單胞菌屬所占的比例最高，說明降溫時長為4 d時覆土層中的細菌種群在3個處理中最適宜雙孢蘑菇菌絲生長和子實體形成，但形成的子實體的數(shù)量個數(shù)、產(chǎn)量及層次等與降溫時長的關(guān)系有待進一步的研究。