Dehydroheliobuphthalmin與 Lapatinib聯(lián)合應(yīng)用靶向抑制NCI-H441細(xì)胞的研究

羅 銳，趙 月，爨向丹，楊星瑩，朱威巍，黃艷蘋(píng)，王宣軍*，盛 軍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201; 3. 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】肺癌在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。肺癌是第2大常見(jiàn)癌癥，絕大多數(shù)肺癌病例是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[2]。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例的85%，其中30%為鱗狀細(xì)胞癌(SCC)，70%為腺癌和大細(xì)胞癌[3]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和存活[4]。人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)含有一個(gè)胞外區(qū)、一個(gè)疏水性跨膜段、一個(gè)帶有膜旁區(qū)段的胞內(nèi)區(qū)和一個(gè)蛋白激酶活性區(qū)，激酶區(qū)是抗癌藥物開(kāi)發(fā)中探索最多的結(jié)構(gòu)域之一[5]。EGFR參與影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和新陳代謝的磷酸化反應(yīng)[6]。EGFR的激活始于其胞外區(qū)與內(nèi)源性表皮生長(zhǎng)因子的結(jié)合，促進(jìn)了EGFR 4個(gè)成員間不對(duì)稱同源和異源二聚體的形成[7]。EGFR的配體激活導(dǎo)致與其家族成員的同源和異源二聚化，這種二聚化導(dǎo)致EGFR磷酸化。EGFR在40%～80%的非小細(xì)胞肺癌和許多其他上皮性癌中過(guò)表達(dá)[8]。靶向EGFR的藥物對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】關(guān)于Dehydroheliobuphthalmin(Dehy)的研究?jī)H有一篇文獻(xiàn)報(bào)道，在側(cè)柏葉90%的甲醇組分中分離出3種木脂素類化合物，其中Dehy在原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞中，對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。但是在白附子中發(fā)現(xiàn)一種木脂素抑制SGC-7901細(xì)胞增殖[10]。木脂素類化合物具有細(xì)胞毒作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且某些木脂素類化合物能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，木脂素的抗腫瘤作用可能受周期阻滯及其細(xì)胞毒性的雙重影響。目前抗腫瘤作用機(jī)制大體有如下幾個(gè)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抗血管生成；逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥等，還有許多尚不確定的機(jī)制尚待研究。Lapatinib，一種口服酪氨酸激酶抑制劑，能有效抑制人類表皮生長(zhǎng)因子受體-1(ErbB1)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(ErbB2)酪氨酸激酶活性。研究中發(fā)現(xiàn)Lapatinib對(duì)EGFR和HER2的雙重抑制效果未在非小細(xì)胞肺癌中表現(xiàn)出其更加顯著的效果[11]。在三陰性乳腺癌中，Lapatinib通過(guò)抑制三磷酸腺苷(ATP)的結(jié)合和抑制磷酸化來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活[12]。雖然Lapatinib在乳腺癌中的治療效果較好，但在野生型EGFR非小細(xì)胞肺癌中并未發(fā)現(xiàn)Lapatinib有治療效果，但是其對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞具有一定的抑制效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究對(duì)比了Dehy聯(lián)合應(yīng)用Lapatinib對(duì)NCI-H441和NCI-H1975細(xì)胞的影響，從細(xì)胞存活率、克隆形成、細(xì)胞凋亡情況、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變化方面闡述了二者聯(lián)合應(yīng)用的作用機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】驗(yàn)證木脂素類化合物與抑制劑聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同抑制NCI-H441細(xì)胞存活的效果，以期為EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的化合物Dehy，分子式C22H20O8，來(lái)源于植物側(cè)柏，純度99%，購(gòu)于云南西力生物技術(shù)股份有限公司，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞NCI-H441和NCI-H1975購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas, VA, USA)，并在含10% FBS和1%P/S的DEME培養(yǎng)基中于37 ℃下在含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(BINDER; Tuttlingen, Germany)。實(shí)驗(yàn)用抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先計(jì)算化合物Dehy的IC50值，確定Dehy對(duì)NCI-H441細(xì)胞的最大無(wú)顯著性抑制的濃度，利用該濃度的Dehy和Laptinib分別處理NCI-H441細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞；試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理組，對(duì)照組：con；Dehy組：Dehy；Lapatinib組：Lap；Dehy聯(lián)合應(yīng)用Lapatinib組：Dehy+Lap。并依次測(cè)定4個(gè)處理的2種細(xì)胞存活率、克隆形成；檢測(cè)4個(gè)處理組的NCI-H441細(xì)胞中EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)變化；檢測(cè)4個(gè)處理的2種細(xì)胞凋亡水平和周期進(jìn)展情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到85%～90%時(shí)，在超凈工作臺(tái)中，吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS清洗；培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)1 mL，混勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱消化，吹打細(xì)胞將懸液移至離心管中，1500 r/min，離心3 min，吸去上清，加入培養(yǎng)基吹打均勻，將細(xì)胞懸液按照1∶5的比例，滴入100 mm培養(yǎng)皿，移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板中，恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜；然后按照每孔200 μL的規(guī)格加入相應(yīng)的配好的藥，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，避光4 h；4 h后，吸去每個(gè)孔的上清，每孔加入150 μLDMSO，在微孔板震蕩儀上震蕩使孔中的紫色沉淀完全溶解；將96孔板放于酶標(biāo)儀中，在492 nm處讀取細(xì)胞的吸光值。

1.3.3 集落形成實(shí)驗(yàn) 將1×105個(gè)NCI-H441細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，過(guò)夜，標(biāo)記并加入相對(duì)應(yīng)的藥，隔2 d換1次新的培養(yǎng)基并重新加入相對(duì)應(yīng)的藥，連續(xù)培養(yǎng)14 d左右；14 d后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，然后每板加入3 mL甲醇固定15 min，棄去甲醇后，再用0.1%結(jié)晶紫溶液避光染色20 min，用靜止的水緩慢洗去結(jié)晶紫，室溫晾干后拍照；拍照后，加入5%的冰乙酸溶解細(xì)胞，溶解轉(zhuǎn)移至96孔板中，于570 nm處讀取吸光值，設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)方法 吸光度測(cè)定：37 ℃恒溫孵育30 min，將96孔板取出，轉(zhuǎn)移至多通道酶標(biāo)儀中，測(cè)定其吸光度。測(cè)定波長(zhǎng)分別為560 nm和630 nm，測(cè)定數(shù)值均扣除空白孔吸光值，即得到樣品吸光值。樣品濃度的計(jì)算：將樣品的吸光度代入公式，計(jì)算樣品總蛋白濃度。化學(xué)顯影：將A液和B液按1∶1配置，混勻；將膜與AB混合液充分接觸；點(diǎn)擊“Expose”開(kāi)始曝光。曝光時(shí)間根據(jù)出現(xiàn)條帶的曝光程度自動(dòng)選擇曝光停止時(shí)間，曝光停止后選擇合適的圖片拷貝。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析(mean+SEM，one-way ANOVA)，*P<0.05為差異有顯著性，**P<0.01為差異有明顯顯著性，***P<0.001為差異極顯著。使用GraphPad Prism5作圖軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。細(xì)胞存活率=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)]×100%，As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度；Ac：對(duì)照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞存活率。IC50值計(jì)算方法：將濃度轉(zhuǎn)換未log10，存活率更換為抑制率，利用Graphpad Prism5軟件選擇第一個(gè)散點(diǎn)圖，數(shù)據(jù)錄入表格，選擇“Analyze”，在“XY analyses”中選擇“Nonlinear regression”，選擇“l(fā)og(inhibitor) vs.response”。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dehy對(duì)NCI-H441細(xì)胞存活率的影響

隨濃度的增加NCI-H441細(xì)胞的存活率逐漸降低；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10 μmol是當(dāng)前的最大無(wú)效濃度(P>0.05，圖2)，通過(guò)計(jì)算得出Dehy的IC50值為14.08 μmol(圖3)，因此Dehy對(duì)細(xì)胞存活存在一定的抑制效應(yīng)，試驗(yàn)濃度確定為10 μmol。

2.2 Dehy+Lap對(duì)NCI-H441和NCI-H1975細(xì)胞增殖率的影響

Dehy和Lap都分別抑制了NCI-H441細(xì)胞的存活率，Dehy +Lap組的NCI-H441細(xì)胞存活率要極顯著低于Dehy組和Lap組(P<0.001，圖4)。Lap組與對(duì)照組相比NCI-H1975細(xì)胞存活率無(wú)顯著降低(P>0.05)，并且Dehy+Lap組與對(duì)照組(Con)相比NCI-H1975細(xì)胞的存活率也未受到顯著抑制(P>0.05，圖5)。

Dehy+Lap組對(duì)NCI-H441細(xì)胞的抑制率大于Dehy組和Lap組，由于Dehy+Lap僅對(duì)EGFR(wild-type)細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，而對(duì)EGFR(mutant)無(wú)抑制這一結(jié)果，試驗(yàn)猜測(cè)Dehy聯(lián)用Lap是具有靶向性的。

2.3 Dehy與Lap聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H441和NCI-H1975細(xì)胞集落形成的影響

Dehy+Lap組NCI-H441細(xì)胞的集落數(shù)量顯著減少(圖6)，并且Dehy+Lap組細(xì)胞存活率顯著低于Dehy組和Lap組(P<0.001，圖7)；在NCI-H1975細(xì)胞中，Dehy+Lap組和其它3組染色結(jié)果無(wú)明顯變化(圖6)，經(jīng)SPSS分析也無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖7)。

2.4 Dehy與 Lap聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H441細(xì)胞EGFR信號(hào)通路的影響

Dehy+Lap組顯著抑制NCI-H441細(xì)胞p-EGFR、p-JNK、p-JAK、p-Stat3、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平。這表明Dehy聯(lián)用Lap抑制EGFR下游的2條信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 Dehy與 Lap聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H441凋亡率的影響

Lap處理細(xì)胞后凋亡總數(shù)少于對(duì)照(Con)，Dehy+Lap處理后，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的數(shù)量都大于對(duì)照組(Con)、Dehy組和Lap組(P<0.001，圖9)。這表明Dehy聯(lián)用Lap具有增加NCI-H441細(xì)胞凋亡率的效果。

2.6 Dehy 與Lap聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H441和NCI-H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

由圖10可知，與對(duì)照組(Con)、Dehy組和Lap組相比，Dehy+Lap組cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加；Bcl-2蛋白表達(dá)降低；Bax蛋白表達(dá)增加；cleaved-PARP蛋白表達(dá)增加。這表明Dehy聯(lián)用Lap通過(guò)激活Bcl-2家族、Caspase家族相關(guān)蛋白，并通過(guò)PARP和Caspase-3來(lái)執(zhí)行NCI-H441細(xì)胞的凋亡。Dehy+Lap處理NCI-H1975細(xì)胞24 h后，未能激活Bcl-2家族、Caspase家族相關(guān)蛋白。這表明在NCI-H1975細(xì)胞中Dehy聯(lián)用Lap不能調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白水平。

2.7 Dehy與Lap聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H441和NCI-H1975 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

由圖11可知，在NCI-H441細(xì)胞中Dehy+Lap組與對(duì)照組(Con)、Dehy和Lap組相比，其增加p21蛋白表達(dá)水平，因此抑制CDK2蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制CyclinE蛋白表達(dá)水平；并且增加p27蛋白表達(dá)水平，因此抑制CDK4蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制CyclinD蛋白表達(dá)水平；p53蛋白與細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)相關(guān)，在此次實(shí)驗(yàn)中Dehy聯(lián)用Lap后NCI-H441細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平增加。這表明Dehy聯(lián)用Lap能夠阻礙NCI-H441細(xì)胞從S期至G2期。Dehy+Lap處理NCI-H1975細(xì)胞后，細(xì)胞周期蛋白(CyclinE、CyclinD)未受到抑制、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK2、CDK4)未受到抑制，并且 (p21Waf1/Cip1、p27Kip1)蛋白表達(dá)也未增加。這表明在NCI-H1975細(xì)胞中Dehy聯(lián)用Lap對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展無(wú)明顯影響。

3 討 論

3.1 抑制劑對(duì)EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌治療效果差

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。EGFR 40%～80%在NSCLC過(guò)表達(dá)[13]。當(dāng)EGF等配體與EGFR結(jié)合之后，EGFR與ErbB家族其他成員發(fā)生同源或異源二聚化，導(dǎo)致其胞漿尾部特定酪氨酸殘基的磷酸化，從而激活細(xì)胞下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、血管生成和運(yùn)動(dòng)[14]。酪氨酸激酶抑制劑在EGFR活性激酶結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，但由于其作用效率低，并會(huì)發(fā)生獲得性耐藥和點(diǎn)突變的原因，第一代酪氨酸激酶抑制劑不能完全的抑制EGFR(wild-type)活化，慢慢的(TKIs)成了EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌患者二線或三線環(huán)境中的治療選擇。然而，其反應(yīng)率很低，只有大約25%能達(dá)到疾病控制[15]。

3.2 EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌治療趨向于聯(lián)用

目前EGFR(wild-type)的治療趨向于聯(lián)合治療，且治療方案較少。Jian-Shu Lou發(fā)現(xiàn)銀杏黃酮和順鉑聯(lián)合處理后，銀杏黃酮誘導(dǎo)的鐵下垂和順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)均被聯(lián)合用藥放大，對(duì)EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞毒作用增強(qiáng)[16]。Ke Li研究發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中，Quinalizarin抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與Icotinib聯(lián)用部分恢復(fù)了細(xì)胞對(duì)Icotinib的敏感性，聯(lián)合使用CK2抑制劑(Quinalizarin)和伊考替尼比單獨(dú)使用伊考替尼有更好的抗腫瘤活性[17]。YM155和厄洛替尼的聯(lián)合應(yīng)用,顯著提高了Erlotinib對(duì)A549(EGFR野生型)的敏感性[18]。Taichi Takashina 等利用EZH2抑制劑3-deazaneplanocin A與HDAC抑制劑 (SAHA)聯(lián)合處理抑制了H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且聯(lián)合處理協(xié)同抑制了所有受試NSCLC細(xì)胞系的增殖[19]。EZH2抑制劑GSK343和DZNep聯(lián)合吉非替尼能逆轉(zhuǎn)H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的耐藥性[20]。Jade H.-M. Hsu 發(fā)現(xiàn)Withaferin A與常規(guī)化療藥物聯(lián)合治療EGFR野生型肺癌患者[21]。Lecia V. Sequist 發(fā)現(xiàn)Seribantumab聯(lián)合Erlotinib治療EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌患者的隨機(jī)II期試驗(yàn)中，Seribantumab和Erlotinib的聯(lián)用改善了患者PFS(無(wú)進(jìn)展生存期)[22]。Chun-Hau Dai 研究發(fā)現(xiàn)Afatinib和雷公藤紅素聯(lián)合應(yīng)用可有效抑制H23和H292細(xì)胞存活，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[23]。

3.3 天然化合物的抗癌前景廣闊，但缺乏機(jī)理驗(yàn)證

由于替代藥物未能發(fā)現(xiàn)免疫抑制和癌癥等關(guān)鍵治療領(lǐng)域的新實(shí)體，人們對(duì)天然產(chǎn)物的研究重新產(chǎn)生了興趣[24]。目前近63%的抗癌藥物是天然產(chǎn)物，或者可以追溯到天然產(chǎn)物來(lái)源[25]。對(duì)于野生型非小細(xì)胞肺癌，利用Lap就可以沿著活化的EGFR下游蛋白尋找其作用靶點(diǎn)。結(jié)合Dehy這一天然產(chǎn)物具有多種生物活性，其抗癌作用已有部分研究成果，但都是單獨(dú)用藥，由于該類化合物的種類較多，其對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)理尚不清楚。因此，筆者猜測(cè)Dehy可能存在類似EGFR配體的功能，其能結(jié)合到EGFR胞外結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而減少EGFR的激活，因此當(dāng)Dehy與Lap聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，該組合具有協(xié)同效應(yīng)。但由于此實(shí)驗(yàn)缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，因此對(duì)Dehy是否與EGFR存在具體的結(jié)合位點(diǎn)還有待驗(yàn)證。

3.4 EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌患者占比高

當(dāng)前以EGFR(wild-type)的患者仍然占大多數(shù)。EGFR突變陽(yáng)性患者的發(fā)病率在亞洲人群中約為30%，在西方國(guó)家中僅為10%～15%[26]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的比率為85%，其中超過(guò)60%表達(dá)野生型EGFR[27]。以EGFR(wild-type)為焦點(diǎn)是研究新的治療策略的開(kāi)端，本研究利用天然化合物Dehy的抗癌活性為起點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用第一代酪氨酸激酶抑制劑Lap，不僅提高了Lap 的利用率，還發(fā)現(xiàn)了聯(lián)合用藥后僅對(duì)EGFR(wild-type)細(xì)胞NCI-H441有抑制效應(yīng)，而對(duì)NCI-H1975無(wú)效這一現(xiàn)象，并解釋了其作用機(jī)制為：從細(xì)胞EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開(kāi)始，到最終作用細(xì)胞核中的關(guān)鍵蛋白，整個(gè)信號(hào)傳遞鏈上都發(fā)現(xiàn)Dehy+Lap的組合調(diào)節(jié)了重點(diǎn)的關(guān)鍵蛋白，最終影響細(xì)胞的增殖分化，這對(duì)靶向EGFR(wild-type)細(xì)胞NCI-H441的治療方式的更新和作用機(jī)制具有重要意義。

4 結(jié) 論

經(jīng)多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，Dehy聯(lián)用Lap抑制EGFR及下游相關(guān)蛋白磷酸化的表達(dá)水平，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和增加細(xì)胞的凋亡率、調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的方式最終抑制EGFR(wild-type)細(xì)胞NCI-H441的存活。本研究為野生型非小細(xì)胞肺癌臨床應(yīng)用提供了可能的新的治療策略和新的研究方向。