香蕉磷脂酶D的純化與生化特性分析

何雪梅，唐雅園，孫 健，李 麗，向 昱，楊兆杏，趙承剛，韋 珍，唐 杰*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007； 2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西香蕉保鮮與加工工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530007；4. 河池市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 河池 547000)

【研究意義】磷脂酶D(PLD)即磷脂酰膽堿磷脂水解酶(EC3.l.4.4)，是植物組織中普遍存在的一類水解酶，能催化水解磷脂末端的磷酸二酯鍵生成磷脂酸(PA)和親水性膽堿等，在保持細胞膜基本結(jié)構(gòu)與生理功能方面具有重要調(diào)控作用，其在植物種子萌發(fā)、器官衰老及逆境脅迫中的作用已成為研究熱點[1-2]。香蕉為芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)單子葉植物，也是全球鮮銷量最大的水果品種之一[3]，其果實在采收與運輸過程中冷害、病害及機械傷等造成的損失相當(dāng)嚴重，其中我國香蕉采后損耗率在30%以上[4]。已有研究表明，香蕉PLD對香蕉衰老劣變和采后逆境發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。因此，建立香蕉PLD的分離純化方法并分析其生化特性，對系統(tǒng)研究香蕉PLD在香蕉采后貯運保鮮中的作用具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關(guān)香蕉PLD的研究主要集中于PLD基因克隆和表達在香蕉冷害、機械傷等逆境脅迫中的作用等方面。Li等[5]通過RT-PCR方法獲得PLDα(MaPLDα)基因，并分析其基因序列，發(fā)現(xiàn)MaPLDα mRNA和PLD活性在發(fā)育旺盛的組織(葉片、花和莖)中表達量較高，低溫能激發(fā)香蕉MaPLDα基因表達，說明MaPLDα基因表達與香蕉的低溫抗性有一定關(guān)系。He等[6]的研究也證實低溫能激發(fā)香蕉PLD活性，延長貯藏期。損傷果實中PLDmRNA的表達量是未損傷果實的2.67倍，同時脂氧合酶活性升高、丙二醛(MDA)生成加快，抗氧化酶活性均顯著高于未損傷果實[7]。PLD是細胞膜磷脂水解的關(guān)鍵酶，可催化磷脂生成磷脂酸和膽堿，引起細胞膜損傷和膜透性增加，導(dǎo)致膜功能喪失，加速果實衰老劣變[8]。貨架期香蕉果實的PLD活性較貯藏初期顯著提高，正己醛(1種PLD抑制劑)可通過抑制PLD活性以延長香蕉貨架期，也可通過保持果皮和果肉細胞的結(jié)構(gòu)完整性延緩成熟過程，提高貯藏品質(zhì)，延長貯藏期[9]。隨著采后龍眼貯藏時間的延長，果實中PLD等膜脂水解酶活性升高，水解產(chǎn)物含量增加，膜透性增大，而噴施胺鮮酯可降低PLD等膜脂水解酶活性，延緩果實衰老[10]。許佳妮等[11]研究證實，橙油處理致柑橘果實油胞病發(fā)生，病程中PLD活性顯著升高，導(dǎo)致細胞膜水解加劇，促使油胞病發(fā)生并加劇油胞病癥狀。【本研究切入點】PLD在果蔬采后逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，但目前針對香蕉PLD的研究多集中在香蕉的PLD基因克隆與表達方面，分離純化出香蕉PLD并明確其生理生化特性的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】提取香蕉PLD并對其進行分離純化，分析其生化特性，優(yōu)化香蕉PLD活性測定的最佳條件，為香蕉PLD的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香蕉品種為桂蕉6號，于2019年9月27日采摘自廣西南寧市壇洛鎮(zhèn)果園，當(dāng)天運至廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，挑選成熟期一致、大小均一、無機械傷害的果實為試驗材料。

儀器與試劑：Beckman J-301高速冷凍離心機(德國BECKMAN公司)，BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，LC-16高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)，磷脂酰膽堿(PC)、二甲基戊二酸(DMG)、辣根過氧化酶(HRP)、膽堿氧化酶、亞油酸(美國Sigma公司)，50%膽堿水溶液(中國安譜科學(xué)儀器有限公司)，其他常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉PLD提取 香蕉置于勻漿機中，加入預(yù)冷的HEPES緩沖液(含0.32 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L二硫代蘇糖醇、1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟和1.0 mmol/L EGTA，pH 7.0)制成10%勻漿，勻漿液過4層紗布后3000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)15 000 r/min離心25 min，再以105 000 r/min超速離心1 h后，沉淀部分為微粒體膜蛋白，該蛋白包括細胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和液泡膜。沉淀溶于100.0 mmol/L pH 6.5的DMG，即得PLD粗酶提取液，凍干備用。所有提取步驟均在4 ℃下進行。

1.2.2 香蕉PLD活性測定 參考張紅宇等[12]的方法采用酶聯(lián)比色法測定香蕉PLD活性，稍加修改。 取PLD酶液(空白組由DMG替代) 30 μg，加入200.0 μL反應(yīng)系中，其中含100 mmol/L DMG(pH 6.5)、10 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2和5 mmol/L亞油酸，加入12 mmol/L PC后在30 ℃下孵育30 min，8 min沸水浴終止反應(yīng)。冷卻后加入含45 mmol/L(pH 8.0)Tris-HCl、0.8單位膽堿氧化酶、2.4單位HRP、0.24 mg 4-ATT和0.16 mg重蒸酚顯色液0.8 mL，30 ℃下反應(yīng)90 min，最后加入1.0 mL含2 g/L Triton X-100的Tris-HCl(pH 8.0)，混合液經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜濾除雜蛋白，于500 nm下測定OD值。以Bradford比色法測定可溶性蛋白含量，PLD活性以nmol/(min·mg)蛋白表示。

1.2.3 香蕉PLD純化 分別采用硫酸銨沉淀和柱層析法對粗酶液進行純化[13-14]。將粗酶液50.00 mg分別加入1.0 mL不同濃度(50%、60%、70%、80%和90%)硫酸銨溶液中，4 ℃ 靜置 2 h 后，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀并用緩沖液懸浮，測定沉淀中的PLD活性以確定硫酸銨沉淀條件。

篩選的高活性酶液經(jīng)GE系列的PD-10脫鹽柱除鹽。脫鹽后的酶液上Hitrap SP HP陽離子交換柱，用含1.0 mol/L NaCl的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(50.0 mmol/L，pH 5.0) 進行梯度洗脫，根據(jù)酶活測定結(jié)果篩選高活力洗脫液，濃縮后上Sephadex G-200凝膠層析柱，用含0.5 mol/L NaCl 的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(50.0 mmol/L，pH 5.0) 洗脫，收集高PLD活力洗脫液。純化后的酶液經(jīng)高效液相檢測純度，色譜條件為：色譜柱TSK-GEL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm，10 μm)，檢測波長215 nm，流動相為磷酸鹽緩沖液(0.2 mmol/L，pH 6.5)，流速0.5 mL/min。

1.2.4 香蕉PLD生化特性與酶動力學(xué)分析 參考夏禹等[13]的方法考察反應(yīng)體系中不同蛋白含量(0.00～50.00 μg)、Ca2+濃度(0～1.40 mmol/L)反應(yīng)時間(0～35.00 min)和pH(5.0～8.0)對PLD活性的影響；參考楊寧等[15]的方法，在適宜的pH條件下測定香蕉PLD在不同底物濃度(PC，0～1.2 mmol/L)下的反應(yīng)速率，建立酶動力學(xué)方程，分析香蕉PLD的酶動力學(xué)特性，確定香蕉PLD活性的最佳測定條件。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計，以Duncan，s新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉PLD的分離純化結(jié)果

2.1.1 不同濃度硫酸銨對PLD的初步純化效果 由表1可知，隨著硫酸銨濃度的增加，蛋白沉淀量不斷增大，PLD活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，說明在適宜的蛋白含量下PLD活性最強；當(dāng)硫酸銨濃度為80%時，回收的PLD活性最高，回收率最高，分別達24.05 nmol/(min·mg)和73.89%；當(dāng)硫酸銨濃度大于80%時，PLD活性及其純化倍數(shù)降低，說明此時的硫酸銨濃度有利于其他雜蛋白沉淀，雜蛋白含量增多，沉淀中酶的活性也有緩慢降低趨勢。因此，確定香蕉PLD初步純化效果最佳的硫酸銨濃度為80%。

表1 不同濃度硫酸銨對香蕉PLD純化的影響

2.1.2 柱層析對香蕉PLD的純化效果 經(jīng)80%硫酸銨溶液沉淀后的酶液經(jīng)脫鹽后，分別過DEAE-sepharose CL-6B陰離子交換柱、Hitrap SP HP陽離子交換柱和Sephadex G-200凝膠層析柱，進一步除去雜質(zhì)后測定蛋白含量和酶活性，考察不同層析柱對香蕉PLD的純化效果，結(jié)果(表2)表明，經(jīng)DEAE-sepharose CL-6B陰離子交換柱純化層析，香蕉PLD純化了13.70倍，酶活性達94.15 nmol/(min·mg)；經(jīng)Hitrap SP HP陽離子交換柱純化層析，香蕉PLD純化了22.96倍，酶活性達157.76 nmol/(min·mg)；經(jīng)Sephadex G-200凝膠層析柱進一步純化層析，香蕉PLD純化了58.74倍，酶回收率雖僅為11.57%，但酶活性達403.55 nmol/(min·mg)。說明硫酸銨沉淀結(jié)合柱層析法對香蕉PLD粗酶液的純化效果極佳，該方法適用于香蕉PLD純化。

表2 柱層析對香蕉PLD的純化效果

將純化后的香蕉PLD經(jīng)高效液相色譜(HPLC)進行檢測分析，可見HPLC色譜圖顯示香蕉PLD為單一峰(圖1)，表明該酶液純度較高，經(jīng)SDS-PAGE測定，顯示為單一條帶，表示酶液為電泳純，香蕉PLD的相對分子量約為43 kD。香蕉PLD的純化為進一步研究香蕉PLD的特性打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 香蕉PLD的生化特性

2.2.1 不同蛋白含量對香蕉PLD活性的影響 測定不同香蕉PLD蛋白含量條件下的香蕉PLD活性發(fā)現(xiàn)(圖2)，在0～30.00 μg蛋白含量下，PLD活性隨著反應(yīng)體系中蛋白含量的增加呈逐漸升高趨勢，當(dāng)?shù)鞍缀窟_30.00 μg時PLD活性達峰值，且顯著高于其他蛋白含量時的PLD活性(P<0.05，下同)，隨后隨著蛋白含量的增加呈降低趨勢。因此，確定在香蕉PLD活性測定體系中蛋白含量以30.00 μg為宜。

2.2.2 不同Ca2+濃度對PLD活性的影響 從圖3可看出，反應(yīng)體系中不同Ca2+濃度下，香蕉PLD活性呈先升高后降低的變化趨勢。其中，在0～1.20 mmol/L區(qū)間，PLD活性呈波動升高，當(dāng)Ca2+濃度為1.20 mmol/L時PLD活性達最高值，為672.13 nmol/(min·mg)，且顯著高于除Ca2+濃度為1.00 mmol/L外的PLD活性，說明在香蕉PLD活性測定體系中Ca2+濃度以1.20 mmol/L為宜。

2.2.3 不同反應(yīng)時間對香蕉PLD活性的影響 從圖4可看出，隨著反應(yīng)時間的延長，香蕉PLD活性表現(xiàn)出先迅速升高后緩慢降低的變化趨勢。在起始的10.00 min內(nèi)，PLD活性快速升高，反應(yīng)15.00 min時PLD活性達峰值，且顯著高于除反應(yīng)10.00 min外的PLD活性，隨后波動下降。說明在香蕉PLD活性測定體系中測定時間以15.00 min為宜。

2.2.4 不同pH對香蕉PLD活性的影響 從圖5可看出，反應(yīng)體系pH為5.0～6.5時，香蕉PLD活性總體上呈升高變化趨勢，pH為6.5時香蕉PLD活性最高，且顯著高于其他pH條件，當(dāng)pH大于6.5時，PLD活性急劇降低。因此，確定香蕉PLD活性測定體系中pH以6.5為宜。

2.3 香蕉PLD的酶動力學(xué)特性

從圖6可看出，在pH為6.5條件下，以1/[s]為橫坐標(biāo)、1/V為縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，得到方程式l/V=16.034/[s]+9.5145(R2=0.998，其中V表示反應(yīng)速度，[s]為底物濃度)。

繼續(xù)根據(jù)方程式求該香蕉PLD催化不同濃度底物的Km和Vmax(其中Km為米氏常數(shù)，是反應(yīng)速度達到Vm一半時的底物濃度；Vmax表示底物飽和時的反應(yīng)速度)，分別為2.31 mmol/L和39.04 nmol/min，Vmax/Km為16.90，說明香蕉PLD親和力強，具有較高的催化活性。

3 討 論

早在1947年，科學(xué)家已從胡蘿卜和白菜葉中提取到有活性的PLD[16]，但PLD類型豐富多樣，且對其生化與酶學(xué)特性的了解甚少，直至1994年Wang等[17]從萌發(fā)的蓖麻種子中提取、純化得到有活性的PLD，并成功克隆蓖麻子PLD基因，才拉開了PLD功能研究與利用的序幕。Novotn等[18]研究顯示，油菜籽PLD經(jīng)硫酸銨沉淀、Octyl-Sepharose CL-4B層析、PAPG電泳后，酶被純化了703倍，酶活性達713.97 nmol/(min·mg)。Simkhada等[14]依次采用硫酸銨沉淀、Sepharose CL-6B凝膠柱、DEAE-sepharose CL-6B column離子交換柱和Sepharose CL-6B凝膠柱層析對產(chǎn)自Streptomycessp. CS684的PLD進行純化后使其達到電泳純，分子量為29 kD。胡博新等[19]利用硫酸銨沉淀、陰離子色譜柱DEAE-sepharose、陽離子色譜柱 Source30s和凝膠過濾色譜柱Superdex G 75純化鏈霉菌PLD，PLD被純化了474倍并達到電泳純，酶活力達379 U/mg，分子量為57 kD。本研究在參考前人分離純化方法的基礎(chǔ)上，篩選適宜的香蕉PLD分離技術(shù)，優(yōu)化硫酸銨溶液沉淀濃度為80%，再依次經(jīng)過DEAE-sepharose CL-6B陰離子交換柱、Hitrap SP HP陽離子交換柱和Sephadex G-200凝膠層析柱純化后，香蕉PLD純化了58.74倍，酶回收率雖僅為11.57%，但酶活性達403.55 nmol/(min·mg)，純化后的香蕉PLD分子量為43 kD，與迄今檢測到的PLD分子量在22～330 kD之間(大部分介于75～125 kD之間)[20-21]存在差異，可能與測定方法不同有關(guān)。

不同來源PLD的生化特性存在差異，影響PLD催化反應(yīng)的因素很多，如鹽濃度特別是Ca2+濃度、反應(yīng)時間和底物濃度等。Ca2+濃度對PLD尤其是植物源的PLD影響最顯著，除擬南芥PLD家族中的PLD ζ外，其他植物PLD均需要一定的Ca2+濃度才能達到最強活性。PLDα是PLD家族中受Ca2+影響最大的成員，在體外達到最強活力時需Ca2+催化[22]，當(dāng)Ca2+濃度在0～200.0 μmol/L時，PLD基本無活性，只有在高于200.0 μmol/L時，PLD才表現(xiàn)強活性。對甘藍、芥菜和桃等PLD的研究均已證實，PLD活性受Ca2+調(diào)控[2，12，15]。PLD C2區(qū)的存在是Ca2+激活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和膜運輸?shù)鞍?PKC、PLC和PLA2)中都存在C2區(qū)，因此有必要對細胞膜上Ca2+調(diào)控的蛋白進行翻譯[23-25]。但不同PLD所需Ca2+濃度不同，本研究中，香蕉PLD活性達最高值時的Ca2+濃度為1.20 mmol/L，與桃PLD達最強活性所需的Ca2+濃度為10.00 mmol/L，高山離子芥達最強活性所需的Ca2+濃度為0.80 mmol/L[12，15]差異較明顯。對比以往文獻[15，20，26]報道發(fā)現(xiàn)，本研究中香蕉PLD反應(yīng)速度快于高山離子芥PLD(反應(yīng)30.00 min活性達峰值)，但比草莓和玉米PLD反應(yīng)速度慢，草莓PLD在反應(yīng)后10.00 min達峰值，而玉米PLD在反應(yīng)后2.50 min即達峰值；蛋白含量對香蕉PLD活性的影響趨勢與草莓、桃和高山離子芥等一致[12，15，20]，均有一個峰值，即在適宜的蛋白含量條件下，PLD活性最強。因此，考察不同因素對PLD反應(yīng)的影響，優(yōu)化PLD檢測的最佳條件，明確其生化特性及酶動力學(xué)特性，對后續(xù)研究香蕉PLD在果實生長發(fā)育與采后貯藏中的調(diào)控機制非常必要。

4 結(jié) 論

80%硫酸銨沉淀結(jié)合DEAE-sepharose CL-6B陰離子交換柱、Hitrap SP HP陽離子交換柱和Sephadex G-200凝膠層析柱適用于香蕉PLD純化，蛋白含量30.00 μg、Ca2+濃度1.20 mmol/L、反應(yīng)時間15.00 min和pH 6.5可作為優(yōu)化的香蕉PLD活性測定最佳條件。