有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)CUMS小鼠海馬神經(jīng)炎癥及改善NF-κB、TNF-α/IDO/5-HT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制研究①

劉瑞蓮 屈紅林（宜春學(xué)院體育科學(xué)研究所，宜春336000）

抑郁癥是臨床上常見的一種以思維緩慢、興趣缺失、記憶力減退及顯著而持久的心境低落等為主要特征的伴有精神障礙和生理疾病的慢性復(fù)發(fā)性精神情感類腦疾病，患者通常社會(huì)功能低下，嚴(yán)重者會(huì)喪失生活工作能力，甚至出現(xiàn)自殺觀念和行為，嚴(yán)重危害人類的身心健康，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，抑郁癥已經(jīng)成為第二大負(fù)擔(dān)疾病，預(yù)計(jì)至2030年，將成為世界首位重大負(fù)擔(dān)疾病。但截至目前，有關(guān)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，雖然有研究者提出一些假說，如單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌減少［1］及突觸傳遞效能減弱、細(xì)胞因子炎癥學(xué)說［2］、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能紊亂［3］、應(yīng)激性環(huán)境與遺傳因素相互作用致使神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)，以及突觸傳遞與突觸可塑性異常和大腦皮層與邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能環(huán)路異常［4］等，但這些抑郁癥發(fā)病的假說難以從根本上解釋抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥可通過激活調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)抗抑郁的病理改變［5］。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)揭示，神經(jīng)免疫系統(tǒng)與炎癥細(xì)胞因子參與了抑郁樣癥狀的產(chǎn)生。

海馬作為大腦中神經(jīng)連接環(huán)路較為豐富的區(qū)域之一，其功能常與記憶、信息儲(chǔ)存相關(guān)，近年研究還發(fā)現(xiàn)其可參與情感和認(rèn)知活動(dòng)的調(diào)控，尤其在抑郁癥的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此，近年來抑郁癥發(fā)病機(jī)制的諸多研究指向了海馬組織的變化，如海馬體積減小、神經(jīng)元衰亡、丟失，及突觸發(fā)生核神經(jīng)發(fā)生的減少等［6］?，F(xiàn)有的抗抑郁藥幾乎均靶向增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和去甲腎上腺素系統(tǒng)功能，但療效并不顯著，如UDAYA等［7］的研究結(jié)果顯示，抗抑郁藥5-HT再攝取抑制劑類藥物能緩解海馬神經(jīng)元萎縮，增加海馬CA1區(qū)域齒狀回的樹突棘密度，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元新生，提高神經(jīng)再生能力。但大多數(shù)抗抑郁藥并非得益于藥物的直接藥理效應(yīng)，而更多見于大腦試圖重建的代償反應(yīng)，且時(shí)程較長。另外，抗抑郁藥停藥后實(shí)際上將患者置于更糟糕的狀況之中［8］。課題組前期研究成果表明，有氧運(yùn)動(dòng)一方面能促進(jìn)慢性腦缺血的修復(fù)作用，顯示其在提高腦缺血小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞方面作用顯著［9-10］；另一方面對(duì)于抑郁小鼠海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的上調(diào)具有較好的促進(jìn)作用［11］。抑郁癥的病理過程與海馬組織炎癥和神經(jīng)遞質(zhì)間有怎么樣的關(guān)系？它們之間又發(fā)揮怎樣的協(xié)調(diào)關(guān)系？有氧運(yùn)動(dòng)在抗抑郁的過程中扮演怎樣的角色？是本研究擬要解決的問題。本實(shí)驗(yàn)采用慢性應(yīng)激性刺激小鼠進(jìn)行抑郁造模，實(shí)施有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)手段，并檢測干預(yù)前后有關(guān)色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸（kynurenine，KYN）含量及代謝途徑限速酶吲哚胺2，3過氧化酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）與其相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的變化，以明確有氧運(yùn)動(dòng)在對(duì)抗慢性應(yīng)激性刺激誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)的抗抑郁作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)選用健康、雄性SPF級(jí)Kunming mice（KM）小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)：No.43004700032222，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002）作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，60只，8周齡，體重（25±3）g，由湖南省景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ELISA試劑盒（Cusabio，Houston，USA）；TaKaRa提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（TaKaRa Bio，USA）；蘇木素（Gill，Saint-Bio China）；甲苯胺藍(lán)（Sigma-Aldrich，China）；BCA試劑盒（Abcam，China）；Q-5000超 微 量 分 光 光 度 計(jì)（Quawell，USA）；7500熒光定量PCR儀（BIORAD，USA）；倒置顯微鏡（XSP-8F，廣西梧州中康貿(mào)易有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（RT6000，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字法分組，分為空白對(duì)照組（Control group，CG）、模型對(duì)照組（Model group，MG）和模型運(yùn)動(dòng)組（Model exercise group，ME），20只/組。除空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)外，模型組小鼠均進(jìn)行慢性應(yīng)激性刺激造模。

慢性應(yīng)激性抑郁癥造模（chronic unpredictable mild stress，CUMS）方法：針對(duì)模型組小鼠實(shí)施包括晝夜調(diào)整、白噪音、禁食、禁水、傾斜鼠籠、潮濕墊料、束縛、水平震蕩等在內(nèi)的13種慢性應(yīng)激性刺激，按照隨機(jī)數(shù)字法確定刺激方案，為防止小鼠出現(xiàn)適應(yīng)刺激現(xiàn)象，確保相鄰時(shí)間的實(shí)施不同的刺激，總造模時(shí)間為4周。

運(yùn)動(dòng)方案：針對(duì)運(yùn)動(dòng)組小鼠在進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，均采取0坡度，10 m/min，60 min/d，6 d/周的中等強(qiáng)度進(jìn)行為期8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后，每組隨機(jī)數(shù)字法選取8只小鼠，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳（forced swim test，F(xiàn)ST）、強(qiáng)迫懸尾（tail suspension test，TST）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定。

1.2.3 小鼠及樣本處理神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定結(jié)束后，針對(duì)每組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定的8只小鼠，戊巴比妥鈉（劑量：50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，心臟取血處死，冰上斷頭剝離頭皮及毛發(fā)，自枕骨大孔沿矢狀縫撬開顱骨，玻璃分針撥開大腦皮層，暴露海馬，分離海馬與周圍的腦組織，取出海馬，眼科剪自雙側(cè)海馬中間一分為二，左側(cè)海馬組織用于ELISA檢測，右側(cè)海馬組織進(jìn)行總RNA提取。

隨機(jī)數(shù)字法選取6只小鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，迅速開胸，自心臟進(jìn)行腦在體固定，固定時(shí)先以4℃冰生理鹽水快速灌注，直至右心耳流出清亮液體，再以4%的多聚甲醛灌注，直至小鼠肝臟完全變白變硬，四肢和軀干僵直。冰上斷頭剝離頭皮及毛發(fā)，自枕骨大孔沿矢狀縫撬開顱骨，眼科剪從顱底部分離大腦與顱底組織連接，取出腦組織，4%多聚甲醛固定48 h以上，用于Nissl染色和HE染色。

每組隨機(jī)選取6只小鼠，按照上述方法剝離海馬組織，-80℃冰箱凍存，用于Western blot檢測蛋白含量。

1.2.4 Nissl染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體改變腦在體固定后的小鼠腦組織，502膠水固定后，乙醇脫水、二甲苯透明，于石蠟包埋盒包埋，全自動(dòng)切片機(jī)切片，厚度為5μm，切好后的腦片（海馬組織所在的腦片）進(jìn)行脫蠟、脫水處理后，于45℃的甲苯胺藍(lán)溶液中染色30 min，蒸餾水沖洗3次后，梯度乙醇脫水、特殊分色液中分色，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察尼氏體形態(tài)及染色陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 HE染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變

腦在體固定和包埋、切片、脫蠟、脫水等（過程同前）處理后，蘇木素染色，自來水沖洗后，鏡下1%鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍(lán)，伊紅染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察與拍照。

1.2.6 ELISA解凍后的左側(cè)海馬組織于電動(dòng)勻漿機(jī)冰上勻漿后，低溫2 500 r/min離心15 min，取上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣，并依次完成溫育、洗滌、加酶、顯色、終止反應(yīng)等過程，酶標(biāo)儀調(diào)零后在450 nm波長處依序測量各組小鼠海馬組織中IDO、NF-κB、TNF-α、5-HT和多巴胺（dopamine，DA）等的OD值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各因子濃度。

1.2.7 RT-qPCR分離右側(cè)海馬組織，Trizol中冰上電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，充分裂解，嚴(yán)格按照兩步法試劑盒抽提海馬總RNA。分光光度計(jì)測定小鼠海馬組織總RNA濃度及質(zhì)量。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR PCR Mixture進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。按照2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。相關(guān)引物設(shè)計(jì)由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)。具體見表1。

表1 小鼠相關(guān)因子mRNA引物Tab.1 Related factor mRNA primers of mice

1.2.8 Western blot測試前，將海馬組織取出剪碎、碾磨、裂解、提取蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。Western blot檢測小鼠海馬IDO、NF-κB、TNF-α的蛋白表達(dá)。5%SDS-PAGE進(jìn)行制膠、電泳、轉(zhuǎn)模，3%的脫脂牛奶TBST室溫封閉1 h后，加入一抗稀釋液（1：1 000），TBST洗滌4次，4℃孵育過夜。加入兔抗鼠二抗稀釋液（1：8 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌5次。ECL顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行膠片的曝光和成像。檢測結(jié)果以IDO/β-actin、NF-κB/β-actin、TNF-α/β-actin灰度比值進(jìn)行比較。

0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響由神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定結(jié)果可知，與CG相比，MG小鼠FST和TST時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與MG組相比，經(jīng)8周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，ME組小鼠的FST和TST時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示系統(tǒng)規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能顯著降低抑郁小鼠的絕望行為。見表2。

表2 各組CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定結(jié)果比較（±s）Tab.2 Comparison of neurobehavioral assessment results of CUMS depressed mice in each group（±s）

表2 各組CUMS抑郁小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定結(jié)果比較（±s）Tab.2 Comparison of neurobehavioral assessment results of CUMS depressed mice in each group（±s）

Note：1）P＜0.01，vs CG；2）P＜0.01，vs MG.

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2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響由圖1可知，CG組小鼠海馬組織內(nèi)5-HT含量較高，抑郁后小鼠海馬組織內(nèi)5-HT與DA含量明顯減少，與CG組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)系統(tǒng)的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，小鼠海馬組織內(nèi)5-HT和DA含量明顯增高。提示有氧運(yùn)動(dòng)能明顯增加抑郁小鼠海馬組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量。

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響與CG小鼠Nissl染色結(jié)果相比，MG組小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體染色變淺，核固縮嚴(yán)重并伴有神經(jīng)細(xì)胞的空泡樣改變，數(shù)量減少甚至消失；HE染色結(jié)果顯示，MG組小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，核內(nèi)空泡樣明顯，排列紊亂，連接松散。經(jīng)連續(xù)8周的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，抑郁小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體核固縮得到較好改善，空泡樣神經(jīng)元減少，尼氏體數(shù)量增加并趨于飽滿；HE染色顯示雖仍存在神經(jīng)元排列不整齊，但相比MG組小鼠得到較大改善，且神經(jīng)元連接趨于緊密。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬組織IDO和KYN含量的影響表3和圖1結(jié)果表明，抑郁小鼠海馬組織內(nèi)IDO和KYN明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），有氧運(yùn)動(dòng)能有效下調(diào)海馬組織內(nèi)的IDO與KYN含量，且運(yùn)動(dòng)對(duì)二者的干預(yù)作用具有高度一致性。這可能與運(yùn)動(dòng)促使支鏈氨基酸供能增加，釋放的游離脂肪酸濃度上升，競爭性結(jié)合白蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使游離色氨酸增多，干擾色氨酸代謝過程降低其代謝產(chǎn)物KYN的含量有關(guān)。

圖1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與KYN含量的影響Fig.1 Effects of aerobic exercise on monoamine neurotransmitters and KYN content in hippocampus of CUMS depressed mice

2.5 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織炎癥因子活性的影響與CG組相比，MG組小鼠海馬組織中炎癥因子IDO、NF-κB、TNF-α活性明顯增高（P＜0.01），有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后小鼠海馬組織的炎癥因子活性得到顯著抑制，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示有氧運(yùn)動(dòng)能夠在一定程度上起到明顯的抗炎效果，結(jié)果見表3。

表3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織炎癥因子活性的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.3 Effects of aerobic exercise on inflammatory factor activity in hippocampus of CUMS depressed mice（±s，n=8，pg/ml）

表3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織炎癥因子活性的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.3 Effects of aerobic exercise on inflammatory factor activity in hippocampus of CUMS depressed mice（±s，n=8，pg/ml）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.01，vs MG.

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2.6 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠IDO、NF-κB、5-HT mRNA表達(dá)的影響與CG組相比，慢性應(yīng)激性刺激可增加小鼠海馬組織炎癥因子IDO、NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)，降低5-HT mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；有氧運(yùn)動(dòng)能夠抑制IDO、NFκB TNF-α mRNA表達(dá)，增強(qiáng)5-HT mRNA表達(dá)，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表4。

表4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織IDO、NF-κB和5-HT mRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）Tab.4 Effects of aerobic exercise on IDO，NF-κB and 5-HT mRNA expression in hippocampus of CUMS depressed mice（±s，n=8）

表4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)CUMS抑郁小鼠海馬組織IDO、NF-κB和5-HT mRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）Tab.4 Effects of aerobic exercise on IDO，NF-κB and 5-HT mRNA expression in hippocampus of CUMS depressed mice（±s，n=8）

Note：1）P＜0.05 vs CG；2）P＜0.01 vs MG.

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圖2 各組小鼠海馬神經(jīng)元Nissl染色與HE染色結(jié)果（×400）Fig.2 Results of Nissl and HE staining of hippocampal neurons in each group of mice（×400）

2.7 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬組織IDO、NF-κB、TNF-α蛋白含量的變化與CG組相比，MG組小鼠海馬組織中IDO、NF-κB、TNF-α蛋白含量均明顯升高（P＜0.05，圖3）。提示采用慢性應(yīng)激性刺激能夠使小鼠產(chǎn)生抑郁行為的同時(shí)，其炎癥因子IDO、NF-κB與TNF-α等表達(dá)也明顯升高，說明其炎癥反應(yīng)較為嚴(yán)重。相比于MG組抑郁小鼠，ME組小鼠NF-κB與TNF-α的蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IDO蛋白表達(dá)水平較MG組雖有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在一定程度上有氧運(yùn)動(dòng)有助于抑郁小鼠炎癥降低。此外，與CG組相比，ME組小鼠的炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)除TNF-α低于CG組外，其他蛋白因子表達(dá)水平均高于CG組，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在一定程度上也預(yù)示CUMS抑郁小鼠進(jìn)行系統(tǒng)的有氧運(yùn)動(dòng)后其炎癥反應(yīng)下降。

圖3 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)CUMS抑郁小鼠海馬組織蛋白含量（n=6）Fig.3 Aerobic exercise interferes protein levels in hippocampus of CUMS depressed mice（n=6）

3 討論

本研究有3個(gè)新發(fā)現(xiàn)：①慢性應(yīng)激性刺激造模方法能有效誘導(dǎo)小鼠FST和TST延長，絕望行為表現(xiàn)突出，海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯減少，并伴有海馬神經(jīng)細(xì)胞元尼氏體核固縮及空泡樣病理改變，而系統(tǒng)的有氧運(yùn)動(dòng)能有效改善抑郁小鼠的絕望行為，增加海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，修復(fù)和改善海馬神經(jīng)元尼氏體的病理改變；②炎癥細(xì)胞因子TNF-α與IFN-γ高表達(dá)重復(fù)激活并誘導(dǎo)IDO活化，其又可促使色氨酸分解代謝的KYN通路的代謝產(chǎn)物KYN增加，游離色氨酸濃度下降甚至耗竭，低濃度游離色氨酸難以透過血腦屏障，造成腦內(nèi)合成5-HT的前體物質(zhì)色氨酸含量不足，直接影響5-HT的合成與釋放，其病理改變影響了抑郁癥的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，可能與NF-κB、TNF-α/IDO/5-HT通路的調(diào)控作用有關(guān)；③有氧運(yùn)動(dòng)拮抗抑郁炎癥，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而降低IDO活性，減少腦內(nèi)KYN通路代謝產(chǎn)物KYN含量，增加游離色氨酸濃度，使之能夠更多的通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)合成5-HT，改善海馬神經(jīng)元認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與發(fā)展［12］，作為運(yùn)動(dòng)抗抑郁作用的潛在機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)提示有氧運(yùn)動(dòng)在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)抑郁癥中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.1 CUMS抑郁造模效果及有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果抑郁癥發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜。本研究采用CUMS方法建立小鼠抑郁模型，并探究有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑郁小鼠的抗炎效果。FST和TST是評(píng)價(jià)小鼠抑郁行為的有效監(jiān)測指標(biāo)，其中FST是通過檢測小鼠在強(qiáng)迫游泳過程中不動(dòng)時(shí)間，TST是通過檢測小鼠強(qiáng)迫懸尾的不動(dòng)時(shí)間，二者可反映小鼠的絕望抑郁狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，MG組小鼠相比于CG組而言，F(xiàn)ST和TST時(shí)間均明顯延長，提示慢性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)焦慮、絕望樣抑郁行為的出現(xiàn)。這種變化在之后的8周內(nèi)并未呈現(xiàn)明顯改變，說明僅靠自身難以使造模成功的小鼠修復(fù)其抑郁狀態(tài)，這一結(jié)果與多數(shù)研究者所證實(shí)的慢性應(yīng)激性刺激造模方法可引起抑郁小鼠不可逆性的損害一致［13］。與MG組相比，ME組小鼠在造模后的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與MG組相差較小，但隨著時(shí)間的推移，ME組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分得到較大幅度改善。提示有氧運(yùn)動(dòng)有助于抑郁小鼠神經(jīng)行為機(jī)能的恢復(fù)。從海馬組織炎癥細(xì)胞因子活性來看，MG組小鼠海馬組織癥性因子活性明顯高于CG組，IDO、NF-κB及TNF-α差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MG組小鼠除因慢性應(yīng)激性刺激誘發(fā)行為學(xué)改變外，還可引起小鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子活性增加，增強(qiáng)其炎癥反應(yīng)。同樣，與MG組小鼠相比，ME組小鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子活性有顯著下降，提示有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低抑郁小鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子的活性，起到明顯的抗炎效果，與3組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定結(jié)果一致。

海馬神經(jīng)元尼氏體的功能是產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶類，以及神經(jīng)活動(dòng)時(shí)某些成分的更新，特別是神經(jīng)元在興奮傳導(dǎo)過程中所消耗的某些蛋白質(zhì)，主要由尼氏體合成新的蛋白質(zhì)予以補(bǔ)充。正常生理情況下，尼氏體大而數(shù)量多，神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)，但在神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí)，尼氏體的數(shù)量會(huì)銳減甚至消失［14］。由海馬組織Nissl染色和HE染色結(jié)果可知，MG組小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體核固縮嚴(yán)重甚至消失，神經(jīng)元數(shù)目減少，核內(nèi)空泡樣病變嚴(yán)重，細(xì)胞間隙增大，排列疏松不整齊，這與PERI?等［15］的研究結(jié)果較為相似。而有氧運(yùn)動(dòng)有助于抑郁小鼠海馬神經(jīng)元尼氏體空泡樣神經(jīng)元的修復(fù)，增加尼氏體數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)元排列更加整齊，這可能與有氧運(yùn)動(dòng)可修復(fù)海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持突觸的可塑性，進(jìn)而改善腦功能等有關(guān)［16］。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑郁小鼠海馬組織NF-κB、TNF-α/IDO/5-HT通路的作用機(jī)制“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說”認(rèn)為突觸間隙的5-HT及去甲腎上腺素水平下降是誘導(dǎo)抑郁癥發(fā)病的重要原因，而“細(xì)胞因子學(xué)說”認(rèn)為免疫應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子活化與釋放增多等是抑郁癥發(fā)病的重要誘因，兩種機(jī)制間是否存在依附關(guān)系？大量研究表明，抑郁癥患者腦脊液中5-羥吲哚乙酸水平較低，耗竭體內(nèi)色氨酸可導(dǎo)致抑郁癥患者病癥復(fù)發(fā)，恢復(fù)正常飲食后，抑郁癥狀得以緩解。IDO過度激活導(dǎo)致色氨酸更多的代謝為KYN，大量耗竭色氨酸影響5-HT的生成與代謝。本研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)控了CUMS抑郁小鼠海馬組織中的炎癥，這是有氧運(yùn)動(dòng)抗炎作用的重要體現(xiàn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB、TNF-α、IDO等炎癥因子及5-HT神經(jīng)遞質(zhì)在CUMS抑郁小鼠海馬組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，NF-κB、TNF-α等免疫炎癥細(xì)胞因子可激活誘導(dǎo)IDO活化，活化的IDO又使色氨酸分解代謝的KYN通路的代謝產(chǎn)物增加，影響5-HT的合成與釋放。KYN是人體必需氨基酸色氨酸的代謝產(chǎn)物之一，其可自由通過血腦屏障，參與多種神經(jīng)精神疾病、腎功能衰竭、白內(nèi)障及各種慢性惡性疾病的病理過程。當(dāng)機(jī)體受到過度壓力時(shí)，色氨酸分解的KYN代謝通路被激活，KYN水平升高即可誘發(fā)抑郁癥狀［17］。運(yùn)動(dòng)后機(jī)體骨骼肌利用脂肪和支鏈氨基酸供能增加，致使血液中支鏈氨基酸濃度下降，游離脂肪酸濃度上升，同時(shí)，系統(tǒng)的有氧運(yùn)動(dòng)還有助于通過肌肉、腸道菌群等代謝活動(dòng)清理KYN等代謝產(chǎn)物，進(jìn)而影響色氨酸在體內(nèi)的代謝狀態(tài)，增加游離色氨酸的濃度，高濃度的游離色氨酸能夠具備較強(qiáng)的競爭力通過血腦屏障進(jìn)入腦中［18-19］。由于5-HT不能透過血腦屏障，一方面需經(jīng)氧化脫核后轉(zhuǎn)變?yōu)?-HT，增加5-HT在腦內(nèi)的含量，另一方面，透過血腦屏障的游離色氨酸可合成腦內(nèi)5-HT，促使腦內(nèi)5-HT含量增加。此外，運(yùn)動(dòng)能夠提高骨骼肌細(xì)胞內(nèi)PGC-1α1基因的表達(dá)量，而PGC-1a1可有效調(diào)控KYN代謝的關(guān)鍵酶犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶（KAT）活性，KAT能誘發(fā)抑郁的KYN轉(zhuǎn)化為犬尿喹啉酸，降低KYN濃度，抵抗大腦壓力誘發(fā)的抑郁癥狀改變，因此，有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效應(yīng)對(duì)壓力和抑郁癥狀的耐受力已被論證［20］。臨床研究結(jié)果顯示，抑郁癥患者腦內(nèi)5-HT含量顯著降低，由5-HT所調(diào)控的情感、警覺、記憶、食欲、睡眠與覺醒狀態(tài)功能出現(xiàn)不同程度的失衡［21］。運(yùn)動(dòng)所誘導(dǎo)的5-HT增強(qiáng)了機(jī)體上述功能狀態(tài)的調(diào)整，可能與有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑郁癥的作用相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，海馬組織的炎癥可能是抑郁癥進(jìn)展的重要因素。但在這一過程中，有氧運(yùn)動(dòng)能顯著抑制CUMS誘導(dǎo)的抑郁小鼠病理性海馬組織的炎癥因子的表達(dá)。

迄今為止，多種抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究都涉及抑郁癥的致病因子與IDO的調(diào)節(jié)關(guān)系，IDO成為樞紐性因素。MAES等［22］認(rèn)為因免疫激活誘導(dǎo)IDO活化致5-HT合成的前體物質(zhì)色氨酸耗竭，致使5-HT合成不足，且下游毒性代謝產(chǎn)物的增加均參與抑郁癥的發(fā)生。IDO是細(xì)胞內(nèi)含亞鐵血紅素的酶，在催化色氨酸沿KYN代謝途徑中發(fā)揮限速酶作用，同時(shí)其還是一種由TNF-α、IFN-γ等炎癥因子中的一種或幾種細(xì)胞因子通過激活炎癥信號(hào)通路來激活的酶。TNF-α是能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在抑郁癥的發(fā)生與發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［23］。TNF-α代謝失調(diào)被認(rèn)為與多種急慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，尤其在抑郁癥的病理過程中直接參與免疫病理反應(yīng)，并成為機(jī)體免疫-炎癥協(xié)調(diào)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中樞。炎癥細(xì)胞因子除通過擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、病理性滲透等方式透過血腦屏障傳導(dǎo)炎癥信號(hào)外，還可由星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，而這兩類細(xì)胞正是IDO的存在場所，前炎癥細(xì)胞因子即可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞中的IDO的轉(zhuǎn)錄過程參與抑郁樣病理改變。機(jī)體處于正常生理狀態(tài)時(shí)，IDO呈現(xiàn)較低表達(dá)水平，但由于免疫激活、感染或炎癥反應(yīng)時(shí)，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、NFκB等釋放增多時(shí)，可誘導(dǎo)IDO過度激活或上調(diào)IDO顯著表達(dá)，同時(shí)會(huì)催化色氨酸朝KYN代謝途徑發(fā)展，促使合成5-HT的前體物質(zhì)色氨酸耗竭，影響5-HT的生成，進(jìn)而加重抑郁癥［24］。但采用IDO拮抗劑1-MT可顯著抑制小鼠抑郁樣行為。本研究結(jié)果顯示，與CG組小鼠相比，MG組小鼠海馬組織IDO、NFκB和TNF-α mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示CUMS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為與腦內(nèi)免疫激活及炎癥細(xì)胞因子釋放密切相關(guān)，且從IDO的高表達(dá)結(jié)果來看，此過程可能與IDO誘導(dǎo)的色氨酸耗竭，影響到色氨酸-KYN代謝途徑產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞毒性物質(zhì)有關(guān)［25］，這一結(jié)果可在5-HT mRNA的基因表達(dá)結(jié)果得到驗(yàn)證。與MG組相比，ME組小鼠的炎癥細(xì)胞mRNA表達(dá)明顯降低，且與CG組小鼠差異不顯著，同樣的結(jié)果也顯示，5-HT mRNA表達(dá)較MG組明顯升高，且高于CG組，這可能與有氧運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)皮質(zhì)醇下降有關(guān)。因皮質(zhì)醇過高會(huì)破壞中樞神經(jīng)核團(tuán)的遞質(zhì)降解，增高的皮質(zhì)醇引起血中色氨酸和酪氨酸降解，影響游離色氨酸透過血腦屏障，進(jìn)而導(dǎo)致中樞的5-HT合成減少。由3組小鼠的Western blot檢測結(jié)果可知，MG組小鼠的炎癥細(xì)胞因子IDO、NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高，而有氧運(yùn)動(dòng)組小鼠的蛋白表達(dá)含量降低，這一結(jié)果與炎癥細(xì)胞因子的RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果有高度相似性。

4 結(jié)論

8周的有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效地抑制慢性應(yīng)激性抑郁小鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，起到明顯的抗抑郁效果，這一作用機(jī)制可能與有氧運(yùn)動(dòng)參與調(diào)控炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的IDO干預(yù)色氨酸-KYN代謝途徑影響5-HT表達(dá)，即以NF-κB，TNF-α/IDO/5-HT通路的作用發(fā)揮拮抗抑郁小鼠海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減緩和改善抑郁小鼠海馬神經(jīng)認(rèn)知障礙。